저자는 도움이 SB 시스템과 관련하여 도움이 aAPC 클론 # 4, 박사 페리 해킷을 (미네소타 대학) 생성 및 제공하는 박사 칼 6 월 (펜실베니아 대학) 감사드립니다. 기금 지원 : 암 센터 코어 그랜트 (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), 포자 (CA136411), 앨버트 J 구 재단, 버로우즈 웰컴 기금, Gillson Longenbaugh 재단, 암 예방 텍사스의 연구소, CLL 글로벌 연구 재단, 국방부, Noelan L. Bibler의 부동산, 해리 T. Mangurian, 주니어, 백혈병 Immunotherapy을위한 기금, 개인 암 치료 연구소, 백혈병 및 림프종 학회, 림프종 연구 재단, MDACC의 자매 기관 네트워크 기금, 밀러 재단 씨는 허브 Simon 씨, 씨, 부인 조 H. 저울, 토마스 씨 스콧, 암 연구에 대한 국립 재단, 소아 암 연구 재단, 생산 Assistanc윌리엄 로렌스와 블랜치 휴즈 어린이 재단, 세포 치료 (협정)에 대한 전자.

<html> 일 0 또는 전 1. PB와 UCB에서 Mononuclear 세포의 절연 (MNC) <ol><li> 동일한 볼륨 PB, 그리고 PBS-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 네 개의 볼륨이있는 UCB을 희석. </li><li> 40 분 (NO 브레이크) - 50 ML의 원심 분리기 튜브 (들) 30 400 XG에서 원심 분리기에 Ficoll로 천천히 층 희석 혈액 (25 ML) (12 ML). </li><li> 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브에 전송 피펫을 사용하여 mononuclear 세포 분율 (인터페이스)를 수집하고 전송할 수 있습니다. </li><li> PBS-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 50 ML에 볼륨을 준비하고 10 분에 450 XG에 원심 분리기. </li><li> 전체 문화 미디어 (CCM)와 10 분 400 XG에 원심 분리기 50 ML에있는 표면에 뜨는, 부드럽게 다시 중단 세포 펠렛 (들)을 대기음. </li><li> 부드럽게 다시 중단과 수영장 CCM의 셀 알약을하고 Trypan 파랑 제외 방법 (Cellometer, PBMC 프로그램)를 사용하여 세포 수를 수행합니다. </li><li> MNC는 현재 electroporation (Nucleofection)을 사용하거나 나중에 사용하기 위해 cryopreserved 할 수 있습니다. </li></ol>일 0에 Electroporation에 대한 T 세포의 제목 &quot;&gt; 2. 준비 <ol><li> cryopreserved MNC를 사용하는 경우, 신속하게 전체 규모의 electroporation (2 X 10 8 원심 분리하고 2 시간의 잠복 기간 동안 세포 손실 계정에 ~ 20 %를 추가) 37 년 ° C 물 목욕 충분한 세포를 해동. 갓 격리 사용하는 경우 MNC는 2.3 단계로 진행합니다. </li><li> 부드럽게 다시 일시 중지 및 사전 예열 완료 페놀 - 무료 RPMI 문화 미디어 (PF-RPMI)과 10 분 (노 브레이크), 기음의 표면에 뜨는 200 XG에서 원심 분리기를 포함하고 적절하게 크기의 원심 분리기 튜브 (들)에 셀을 전송할 수 있습니다. </li><li> PF-RPMI에있는 MNC를 다시 중지 세포 수 (Cellometer)를 수행하고 10 6 세포 / ML의 농도에서 적절하게 크기의 세포 배양 용기 (들)에 셀을 전송할 수 있습니다. </li><li> humidified 37 ° 품다 2 시간을위한 C / 5퍼센트 CO 2 인큐베이터 ± 30 분. </li><li> 멸균 원심 분리기 튜브 (들), 5 분 (브레이크) 200 XG에서 스핀에 MNC을 전송, 부드럽게 표면에 뜨는 및 R를 대기음전자 중단하고 PF-RPMI의 셀 펠렛 (들)을 이루고 있습니다. </li><li> 셀 수 (Cellometer)를 수행하고 (2 X 10 8 MNC)가 필요 세포 현탁액의 볼륨을 계산합니다. </li><li> 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브 및 10 분 (노 브레이크) 200 XG의 스핀으로 계산 된 볼륨을 전송합니다. </li><li> 더 잔여 미디어가 남아하지 않고 부드럽게 튜브의 측면을 눌러 다시 일시 중지되도록 표면에 뜨는을 대기음. </li></ol> 3. 일 0에 MNC (10 큐벳을 사용하여 전체 규모 프로세스)의 Electroporation (Nucleofection) <ol><li> humidified 37 ° C / 5% CO 2 인큐베이터에서 따뜻한 PF-RPMI 4 ML을 포함하는 열 우물로 멸균 12 잘 판을 사전 품다. </li><li> 준비 및 사전 따뜻한 Lonza Nucleofector 솔루션 인간 T 세포 키트 (제조업체의 지침에 따라 재구성 <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) 바이오 내각 (BSC)의 주변 온도. </li><li> 추가 기능에 의해 Nucleofector 솔루션 / DNA 마스터 믹스를 준비보충 Nucleofector 솔루션의 g 100 μl, transposon 15 μg (CD19RCD28/pSBSO로 지정 플라스미드 supercoiled의 DNA)과 반응 / 큐벳 당 transposase 5 μg (pCMV-SB11로 지정 플라스미드 supercoiled DNA의). </li><li> 부드럽게 원심 분리기 튜브의 측면을 클릭하여 세포 펠렛을 (단계 2.8에서) 분산과 Nucleofection 솔루션 / DNA 마스터 믹스 (최종 세포 농도 : 2 X 10 7 cells/100 μl)에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 조심스럽게 거품을 피하려면 조심하는 것 10 Lonza의 Nucleofection 큐벳의 각 세포 현탁액 (단계 3.4에서) 100 μl를 전송합니다. </li><li> 한 번 큐벳을 누르면, 프로그램 U-014를 (unstimulated T 세포)를 사용하여 electroporate. </li><li> BSC에 큐벳과 12 잘 플레이트 (단계 3.1) 전송합니다. </li><li> 잘 대응에서 사전 예열 문화 매체의 ~ 500 μl를 추가 (STE에서 조리 12 잘 플레이트에 의해 Amaxa 고급 팁 전송 피펫을 사용하여 각 큐벳에서 electroporated 세포를 수확P 3.1)하고 humidified 37 판을 반환 ° 2 시간을위한 C / 5퍼센트 CO 2 인큐베이터 ± 30 분. </li><li> 2 시간의 잠복, 수확을 따라 모든 우물에서 멸균 원심 분리기 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 8 분, 주위 온도, 아니 브레이크와 더 잔류 매체는 세포 펠렛을 커버되지 않도록 표면에 뜨는을 기음과 폐기 140 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 부드럽게 원심 분리기 튜브의 측면을 클릭하여 세포 펠렛을 분산하고 부드럽게 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 CCM에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 세포 수를 수행하고 10 6 세포 / CCM에 ML로 세포 농도를 조정합니다. </li><li> 야간 보육의 세포 배양 플라스크 (들)과 장소에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> EGFP-transfected 세포 (Amaxa 제어 EGFP가 플라스미드 supercoiled 5 μg 5 X 10 6 세포 / 큐벳, pmaxGFP) : 프로세스 단계는 2.1-3.8가 제어 반복했다. </li></ol> 1 일 1 번째 및 이후자극주기 4. 1 일에 유동 세포 계측법에 의한 자동차 식의 분석 <ol><li> electroporated 세포를 수확하고 Trypan 파랑 제외 방법 (Hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 수행합니다. </li><li> 3 번 CD, CD4, CD8, 인간 IgG Fcγ (자동차 표현의 측정 등)에 대한 항체 특정와 얼룩 세포 (1 ~ 2 × 10 6). </li><li> FACS Calibur에 세포를 취득하고 자동차의 표현을 계산하는 FCS Express 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. <ol><li> 공식에 의한 문화의 자동차 + 셀을 계산 : (총 가능한 셀의 번호) X (%의 CAR + 셀) 차 = 번호 + 세포 </li></ol></li></ol> 5. 1 일에 aAPC의 준비 (클론 # 4). aAPC은 (클론 # 4) 공동 명시 원하는 T 세포 공동 stimulatory 분자에 K562 세포 (미국 유형 문화 컬렉션에서 획득 부모 선)에서 파생 된 <ol><li> 37 년 냉동 100 GY 방사능 aAPC의 나누어지는을 해동 °, C 물 목욕. </li><li> 셀은 400 XG, CCM에 10 분에서 원심 분리하여 두 번 세척하고 Cellometer을 (Trypan 파랑 제외)를 사용하여 계산됩니다. </li><li> 자극에 필요한 가능한 aAPC의 수를 계산 : (자동차 + 셀의 번호는) × 2 방사능 aAPC의 = 번호 필요 </li></ol> 6. 차 aAPC로 인한 자극 + 날에 T 세포 하나 1 일의 시작과 후속 자극주기 <ol><li> CCM의 : 1시 2분의 비율 (가능한 aAPC CAR + 셀)에서 무균 용기에 electroporated 전지 (자동차를 표현)와 γ-방사능 aAPC을 (클론 # 4) 섞는다. <ol><li> aAPC 비율은 유동 세포 계측법 electroporation 다음날에 따라 자동차의 표현에 따라 조정되어 있습니다. </li></ol></li><li> 세포 현탁액에 IL-21 (30 NG / ML)를 추가합니다. </li><li> 에서 나누어지는 T-75cm 2 플라스크 (들) 및 / 또는 10 6 세포 / ML의 농도에서 Vue는 생활 문화 가방과 incubat로 돌아나. </li></ol> 일 3, 5 7. 자동차의 지속적인 문화 + T 세포 <ol><li> 반 미디어 변경을 수행, IL-21를 보충하고, 10 6 세포 / ML의 농도에서 T 세포를 유지하고 있습니다. </li></ol> 7 일 8. 첫 번째 aAPC로 인한 자극주기의 끝 <ol><li> 수확 전지는, 계산 및 얼룩을 3 번 CD, CD4, CD8 및 Fcγ (자동차)와 10.1을 단계로 진행합니다. </li></ol> 9. CD56 + 세포 (보통 7 사이의 14 일 electroporation 후)의 고갈 <ol><li> 상자성체의 비즈를 사용하여 CD56 고갈을 수행하는 경우 CD56 + 3 번 CD 제외의 림프구 ≥ 10 %. </li></ol> 자극주기 # 2, # 3, 일 8 → 14 &amp; # 4 대응, 일 15 → 21, &amp; 일 22 → 28 10. 임상 - 충분한 숫자로 T 세포를 전파하는 aAPC의 재귀 추가 <ol><li> stimulatio를 반복N 과정 (4 시간) 등의 단계 4.3-8.1에 설명되어 있습니다. </li><li> 및 다음 각 미디어의 변화 (3 회, 월요일 - 수요일 - 금요일 일정에 따라)에서 일 7 14 21 일부터 문화에 IL-2 (50U/ml)를 추가합니다. </li><li> Cryopreserve (아카이브)를 초과 T 세포는 필요에 따라. <ol><li> T 세포는 제어 속도 냉동고를 사용하여 냉동. </li></ol></li></ol> 일 28 11. 마지막 aAPC로 인한 자극주기의 끝 : 수확 T 세포 <ol><li> 릴리스 테스트 및 주입을위한 T 세포를 Cryopreserve. </li></ol>

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Transposon 및 piggyBac 12,19 및 SB 18,20-22에서와 같은 transposase 시스템, 임상 학년 차의 바이러스로 인한 전달 + T 세포에 대한 대안 유전자 치료에 대한 비 바이러스 성 방법입니다. SB는 인간의 유전자 치료 1,6,23위한 잠재력을 바탕으로 유전자 전달 시스템으로 선정되었습니다. 우리는 SB의 전위 (차를 소개)와 준수 TAA 특정 T 세포의 제조에 플랫폼 기술의 역할을하도록 γ-방사능 aAPC의 재귀 추가 (안정적으로 차를 표현하는 유전자 변형 T 세포를 검색)의 이중 기술을 개발 단계 I / II 시험을위한 cGMP (그림 4)와. γ-방사능 aAPC의 공동 문화 28 일 (4 7 일간 자극을주기) 후, 우리는 일반적으로 인간의 응용 프로그램에 대한 최소한 ~ 10 10 유전자 변형 T 세포가 적절한 생성 할 수 있습니다. 필요에 따라 추가 자극을주기는 t을 수행 할 수 있습니다O 유전자 변형 T 세포의 큰 숫자를 생성합니다. 적은 자동차 + T 세포가 필요한 경우 또한, electroporation 및 전파에 대한 접근 방식은 다시 적은 큐벳을 채용 각의 시작 부분에서 앞으로 aAPC에서 확산의 후속 라운드에 대한 숫자 확대 T 세포의 단지 하위 집합을 들고 크기를 조정 할 수 있습니다 자극주기. 대부분의 electroporated 및 주입 안정적으로 차를 표현을위한 수확 T 세포를 증식. CD4의 가지가 + 및 2 차 생성 차를 표현하는 CD8 + T 세포는 메모리 / 순진한 표현형과 세포를 포함하고 재 감독 특이성 세 특징을 나타냅니다. 첫째, 유전자 변형 T 세포는 특히, 둘째 CD19 + 목표를 lyse CD19 + stimulator 세포에 대한 응답으로 IFN-γ를 생산 그리고 셋째는, CD19에 대한 응답으로 세포 분열 따위에 의해 번식 + 피더 세포, 자동차에 의존 방식으로 13,18의 모든합니다. integr에 대한 우리의 접근 방식SB 시스템에서 비 바이러스 성 DNA의 plasmids의 전자 송금 자동차 transgene을 먹은는 PB와 UCB에서 파생 된 동작 기본 T 세포에서 수행 할 수 있습니다. 우리와 다른 유전자 aAPC 효율적으로 주입 24,25에 대한 T 세포의 임상 - 충분한 숫자를 전파하는 역할을 K562 세포를 수정했습니다. aAPC 및 조직 문화 환경 (예 : IL-21의 추가)을 생성하도록 수정 된 된 환자와 조혈 줄기 세포 이식 후 주입을위한 CD19 특정 T 세포 (표 1) 13,18을 기증 - 파생. 우리는 자동차를 생성 할 수 있습니다 + PB의 T 세포는 단순히 비용, 불편 함, 그리고 apheresis에 의해 PB에서 MNC를 획득 불편을 방지하는 venipuncture하여 얻을. CAR 많은 수의 + MNC의 작은 숫자에서 T 세포를 유도 할 수있는 능력은 특히 allogeneic UCB 이식 후 T 세포를 기적에 호소하고 있습니다. 신생아 기증자의 작은 크기와 익명 재 precludes- 액세스 이후 시점에서이 개인을하고 수확 MNC의 제한된 숫자는 조혈을 방해하지 않도록 T 세포 제조를위한 재료를 시작하기로 사용할 수 있습니다. 제조 공정에 대한 더 진보는 현재 취급을 최소화하기 위해 완전히 폐쇄 WAVE의 생물 반응기와 결합 높은 처리량 electroporation 장치를 포함 진행되고 있습니다. 집계에서 SB와 aAPC는 플랫폼 CD19 별 CAR + cGMP 준수 대체 세포 표면 TAAs를 인식 할 수 유전자 변형 T 세포의 큰 숫자를 생성하도록 구성 할 수 있습니다 T 세포를 생성하는 호소하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> DNA 플라스미드 표현의 GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (키트) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70,026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 무료 RPMI-1640 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone 태아 소 혈청 </td><td> 열 과학 </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE 헬스 케어 Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 IL-2 (Proleukin) </td><td> 노바티스 </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 T 세포 키트 (Nucleofector 솔루션) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 시약 </td><td> Miltenyi </td><td> 70,206 </td><td></td></tr><tr><td> 인간의 3 번 CD에 마우스적인 mAb 특정에 FITC-복합 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 CD4에 대한 마우스적인 mAb의 특정에 APC-복합 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 - 복합인간의 CD8에 마우스적인 mAb 특정에 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> F (AB &#39;) 인간에 대한 구체적인 염소 항체 2 조각으로 PE-복합 Fcγ </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Azide </td><td> 시그마 </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Disposables </td></tr><tr><td> 12 잘 판 </td><td> 코닝 </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75cm 2 플라스크 </td><td> 코닝 </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> 문화 가방 </td><td> VUE 생활 </td><td> 290C, 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML의 원심 분리기 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; 장비 </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Cellometer 비전 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall 전설 RT 원심 분리기 </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> 제어 속도 냉동기 </td><td> 대패질하는 사람 </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS 바이오 국제 </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 분자의 표현 (내생 및 소개) </td></tr><tr><td> 셀 라인 </td> &lt;TD&gt; 일반 명 </td><td> 셀 유형 </td><td> 분자 표현 </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP - IL15.CD19 </td><td> 복제 사 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP 막과 공동 표현은 IL-15을 행 </td></tr></tbody></table> 전체 문화 미디어 (CCM) (최대 30 일까지에 대해 4 ° C에 저장) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1퍼센트 GlutaMAX 유동 세포 계측법 버퍼 (최대 30 일까지에 대해 4 ° C에 저장) PBS 2퍼센트 FBS 0.1 % 나트륨 Azide </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

임상 급 T 세포의 효력은 종양 - 관련 항원의 탁월한은 (i) 인식 (TAAs), 주입 후 (II) 끈기 (III)의 가능성이있는 생물학적 제품을 처리하기 위해 immunotherapy과 유전자 치료를 조합하여 향상시킬 수 있습니다 종양이 사이트 마이그레이션 및 종양 microenvironment 내에서 효과기 기능을 재활용 (IV) 능력에 대한 잠재적. 인간 응용 프로그램에 대한 설계 T 세포의 유전자 조작에 가장 접근은 차량 1-3의 안정 표현 레트로 바이러스와 lentivirus를 사용했습니다. 이 생산 시설의 제한된 수의에서 임상 수준의 재조합 바이러스의 제조 및 출시에 의존으로이 방법은,하지만 현재 좋은 제조 관행 (GMP)을 준수은 비용이 많이들 수있다. DNA의 종 10분의 1 일 recombin의 비용 약의 임상 학년으로 생성 될 수 있기 때문에 nonviral plasmids의 전자 전송은 전달에 대한 매력적인 대안입니다개미 GMP 수준의 바이러스. 우리가 인간의 응용 4-8에 뷰티 (SB) transposon과 transposase 잠자는 숲속의 적응 통합의 효율성을 향상시킬 수 있도록 지원합니다. 우리 SB 시스템은 관심의 유전자 (CD19RCD28 지정 예 2 차 생성 CD19 특정 자동차 transgene)와 TA의 다이 뉴클레오타이드에 transgene이 9-11를 반복 삽입 transposase (예 : SB11)에 대한 코딩 transposon로 구성이 DNA의 plasmids를 사용 . 우리가 TAA (예 : CD19)뿐만 아니라 T 세포 costimulatory 분자 CD86, CD137L을 표현하도록 수정 K562-파생 인공 항원 제시 세포를 (aAPC) (클론 # 4)을 사용하여 유전자 변형 T 세포의 임상 - 충분한 숫자를 생성하려면 단클론 항체의로드에 대한 인터루킨 (IL) -15 (펩타이드는 수정 IgG4 FC 영역에 융합) 및 CD64 (FC-γ 수용체 1) 막 바인딩 된 버전 (적인 mAb) 12. 이 보고서에서, 우리는 complia에서 수행 할 수있는 절차를 설명과 nce CD19 별 CAR + 인간 응용 프로그램에 적합한 T 세포를 생성 할 수 cGMP. 이것은 γ-방사능 aAPC의 모든 - 7 일 추가 (자극을주기)에 의해 안정 integrants의 검색에 이어 두 DNA의 plasmids, SB transposon (CD19RCD28)와 SB transposase (SB11)의 전자 전달 동기에 의해 달성되었다 (클론 # 4) 수용성 재조합 인간 IL-2 및 IL-21 13의 존재 인치 일반적으로 4 사이클 (연속 문화 28 일)이 안정적으로 차를 표현 T 세포의 임상 - 매력적인 번호를 생성하기 위해 수행됩니다. 제조 임상 급 CD19 특정 T 세포에이 방법론은 말초 혈 (PB) 또는 탯줄 혈액 (UCB)에서 파생 된 T 세포에 적용 할 수 있습니다. 또한이 접근 방식은 aAPC에서 자동차로 인정 TAA, 표현과 소개 자동차의 특이성을 페어링하여 다양한 종양 유형에 대한 T 세포를 생성 할 무력화 할 수 있습니다.

우리는 DNA의 plasmids과 γ-방사능 aAPC에서 T 세포의 전파 전자 송금이 인간 응용 프로그램 PB와 UCB에서 파생 된 T 세포의 임상 - 매력적인 번호를 생성하기 위해 사용될 수 있다는보고합니다. 이러한 유전자 변형 T 세포는 주요 histocompatibility 복합 독립적 인 TAA CD19을 인식 도입 차를 표현한다. SB-파생 DNA의 plasmids은 CD28와 3 번 CD-ε 14 신호, 그리고하는 것은 (II) transposase, SB11 15가 이전에 13 설명되어있는은 (i) transposon, 2 차 생성 CAR (CD19RCD28), 16,17를 표현하는 . 현재 연구에서 사용 된 plasmids은 Waisman 임상 Biomanufacturing 시설 (매디슨, WI)에 의해 상업적으로 생산되었다. K562 세포 (미국 유형 문화 컬렉션에서 얻은 부모의 선), 공동 명시 원하는 T 세포 공동 stimulatory 분자 (aAPC의 세포 표면 3 90% 각 도입 분자)에서 파생 aAPC (클론 # 4),로 이전 12 설명했다. 여기 CD19 특정 T 세포는 PB 나 UCB 숫자 자동차에 의존 방식으로 T 세포를 (그림 1 확대 aAPC의 추가 다음 차를 소개 SB의 전위를 사용하여에서 파생 mononuclear 세포 (MNC)에서 생성 될 수 있다고 보여 4) 13,18. 열 큐벳 (2x10 7 MNC / 큐벳)이 transposon (CAR)에 대한 코딩 플라스미드 DNA의 15 μg (CD19RCD28/pSBSO)와 transposase (SB11)에 대한 코딩 플라스미드 DNA의 5 μg (pCMV-SB11)를 사용하여 각받는 사람에 대한 electroporated 있습니다. MNC는 제한하거나 실험실 작업에 다시 크기를 조정하는 경우 큐벳의 수는 감소 될 수있다. electroporation의 날은 자극주기 # 1의 &quot;주 0&quot;로 정의됩니다. 유동 세포 계측법과 문화 조건에 대한 컨트롤로, autologous T 세포는 가짜 electroporated합니다 (DNA 플라스미드 제외) 숫자 상호 링크에는 3 번 CD에 T 세포를 유지하기 위해 OKT3가 미리로드 된 γ-방사능 aAPC (클론 # 4)에 확대 확산. 우리 연구outinely electrotransfer와 일 electroporation 후 T 세포 (그림 2B)의 생존 능력의 효율성을 평가. 초기 시점에서 제어 DNA 플라스미드 (pmaxGFP 지정) 및 차에서 EGFP의 표현은 통합 episomal 플라스미드의 단백질 표현을 반영합니다. 일반적으로, 일 electroporation은 우리가 40-50% 사이의 T 세포 생존 능력과 ~ 40 % (그림 2A)에서 ~ 60 %와 CAR 표현에서 EGFP 발현을 측정합니다. 수용성 재조합 인간 IL-2 및 IL-21의 존재에 γ-방사능 aAPC의 재귀 추가는 안정적으로 차 (CD19RCD28)를 표현하는 T 세포를 검색합니다. 3 번 CD 제외 CD56 + NK 세포는 이러한 NK 세포의 비율이 T 세포에 표현 CAR의 비율이 낮은 경우 특히 ≥ 10 %와 경우 CD56 별 상자성체의 비즈를 사용하여 문화의 고갈됩니다. 이 고갈은 proliferatio을 유지하기 위해 aAPC의 능력을 방해 NK 세포의 급속한 전면에 자라 난을 방지자동차의 N + T 세포. 상황에서 CAR + T 세포에서 NK 세포의 고갈은 지난 2 자극을주기 동안 수행하지만,이 일부 CAR + T 세포에서 CD56의 공동 표현으로 인해 원하는 세포의 손실을 소개하고 있습니다. T 세포는 하루에 14 지난 Vue는 생활 문화 봉투를 사용하여 기능적으로 닫힌 체계에서 재배되었다. 유전자 변형 및 전파 T 세포의 일부는 일반적으로 미래의 분석에 대한 보관 자료의 원천 역할을하고 할 aAPC의 공동 문화의 날 14 일 21 일 (자극주기의 끝 # 2 또는 # 3)에 cryopreserved 아르 예상치 못한 문제가 이후 제조 과정에서 발생하는 경우 해동. T 세포는 일반적으로 (그림 3)에 나 문화의 날 28 수확됩니다 정기적으로 명시&gt; 90 % CAR이며&gt; 80% 가능한 (그림 2C, D). 우리는 이전에 aAPC의 공동 문화 4 주 후 3 번 CD의 평균 접이식 확장 + T 세포는 19,800입니다 것으로 나타났습니다 ± CA로 11,313을<html> R + 표현의 90 %되는 ± 7.5 13. 이 T 세포는 cryopreserved와의 프로세스와 안전 및 제조 제품의 치료 가능성에 알려 릴리스 테스트를 받아야 있습니다. 릴리스 테스트는 사전 임상 실험에 수신자로 주입으로 분석 증명서를 생성하는 임상 실험실 개선 개정 (CLIA)을 준수 실시됩니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> 그림 1. CAR + PB와 UCB에서 T 세포를 electroporate하고 전달하는 과정을 요약 단계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. PB에서 유전자 변형 T 세포의 특성화. 유전자 전달의 효율성을 평가하는 첫번째 자극주기의 날 0시 EGFP의 (A) 표현. CD19 별 CAR의 표현 (CD19RCD28가)와 같은 +, CD8 +와 CD4 + electroporation 후 (B) 약 24 시간과 (C) 28일 aAPC의 공동 문화 이후의 T 세포에는 3 번 CD에 유동 세포 계측법에 의해 평가합니다. 차에서 비슷한 표현은 UCB-파생 T 세포로 관찰되었다. (D) 자동차 표현의 동력학이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> 그림 3. PB-파생 차의 전파3 번 CD +와 CAR + 재조합 인간 IL-2 용해와 IL-21의 존재에 γ-방사능 aAPC에 반복 공동 문화 PB에서 파생 된 T 세포의 숫자 확장 + T 세포. 평가. 위쪽 화살표는 각 자극주기의 시작을 표​​시하는 γ-방사능 aAPC의 추가를 나타냅니다. UCB-파생 CAR + T 세포는 숫자 확장과 비슷한 속도를냅니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> 4 그림. 유전자 자동차를 수정하고 전파하는 SB와 aAPC 시스템을 사용하여 제조 공정의 개략도는 + PB와 UCB에서 파생 된 T 세포. CD19 별 CAR + T 세포는 SB-파생 supercoiled DNA의 plasmids과 공동 문화 이후의 전자 전송에 의해 생성 된 존재하는 O에서 K562-파생 aAPC (클론 # 4)에F 재조합 인간 가용성 IL-2 및 IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T 세포 소스 </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> T 세포 주입 </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologous (환자 파생) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> autologous 조혈 줄기 세포 이식 후 </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14,193 </td></tr><tr><td> Allogeneic (기증자 - 파생) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><tD&gt; 14,577 </td></tr><tr><td> Allogeneic (기증자 - 파생) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> allogeneic 탯줄 혈액 이식 후 </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001년에서 1022년까지 </td><td> 14,739 </td></tr></tbody></table> * 표 1. MDACC에서 FDA의 후원하에 임상 시험은 CD19 특정 차를 불러 일으킬 수 + T 세포는 aAPC에 전파. T 세포는 SB transposon이 2 차 생성 CAR에 대한 코딩 집행 표현, 지정 CD19RCD28, 그 CD28과 3 번 CD-ε을 통해 신호를 통해 ​​CD19에 대한 특정 표시됩니다. ** 체험은 인용 발명 5에 설명되어 있습니다.

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Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을 설명<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em디자이너 CD19 + 인공 항원 제시 세포에 CD19 별 자동차 및 선택적 전파를 소개하는&gt; (SB) 시스템.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K 조회수.  U.T. MD Anderson Cancer Center. CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을 설명 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 시스템.

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