המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר קרל יוני (אוניברסיטת פנסילבניה) לעזרה ביצירה ומתן שיבוט aAPC # 4 ו ד&quot;ר פרי אקט (אוניברסיטת מינסוטה) לעזרה עם מערכת SB. תמיכת גרנט: מרכז הסרטן Core גרנט (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); אלברט J וורד קרן; בורוז Wellcome קרן; Gillson Longenbaugh קרן; מניעת הסרטן ומכון מחקר של טקסס; CLL הגלובלי קרן מחקר; משרד ההגנה; עזבון Noelan L. Bibler; הארי ט Mangurian בן, קרן לוקמיה חיסונית; מכון לריפוי בסרטן אישית; וקמיה ולימפומה אגודה; קרן מחקר לימפומה; אחותו של MDACC הרשת המוסדית הקרן; מילר הקרן; מר רב סימונס; מר וגברת ג&#39;ו ח הסולמות; מר תומס סקוט; הקרן הלאומית לחקר הסרטן, קרן לחקר סרטן בילדים; Assistanc הפקהדואר לטיפולים תאיים (PACT); קרנה של בלאנש יוז ילדי ויליאם לורנס ו.

<html> יום 0 או לפני 1. בידוד של תאי mononuclear (MNC) מPB וUCB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל PB עם נפח שווה, וUCB עם ארבעה כרכים של PBS-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט דם שכבה מדולל (25 מ&quot;ל) על Ficoll (12 מ&quot;ל) בצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל (הים) ו צנטריפוגות XG ב 400 במשך 30-40 דקות (ללא בלמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולהעביר את החלק היחסי של תאי mononuclear (ממשק) באמצעות פיפטה העברת צינור צנטריפוגה טריה 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את הנפח ל 50 מ&quot;ל עם PBS-EDTA וסרכזת ב450 XG למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, עדינות מחדש להשעות את התא הגלול (הים) ב 50 מ&quot;ל של מדיה מלאת תרבות (CCM) ו, צנטריפוגה XG ב 400 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות מחדש להשעות וברכת הכדורים הסלולריים בCCM ולבצע ספירת תאים באמצעות שיטת הדרה כחולה Trypan (Cellometer, תכנית PBMC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MNC כעת ניתן להשתמש עבור electroporation (Nucleofection) או cryopreserved לשימוש עתידי. </li></ol>הכותרת &quot;&gt; 2. הכנת תאי T עבור electroporation ביום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בMNC cryopreserved, להפשיר תאים מספיק מהר לelectroporation היקף מלא (2 x 10 8 הוסיף ~ 20% לחשבון לאובדן תא במהלך צנטריפוגה ודגירת שעה 2) 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. אם משתמש מבודד טרי MNC ממשיך לשלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות מחדש להשעות ולהעביר תאים לצינור צנטריפוגה בגודל המתאים (ים) הכיל פנול חינם RPMI תרבות תקשורת מחוממת מראש שלמה (PF-RPMI) וצנטריפוגה XG ב 200 במשך 10 דקות (לא בלמים), supernatant aspirate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות MNC בPF-RPMI, לבצע ספירת תאים (Cellometer) ולהעביר את התאים לכלי בגודל המתאים תא תרבות (הים) בריכוז של 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב37 humidified ° C CO / 5% 2 חממה ל± 2 שעות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MNC לצינור סטרילי צנטריפוגה (הים), ספין ב 200 XG למשך 5 דקות (ללא ברקסים), לשאוב supernatant ועדינות rהדואר להשעות ולשלב תא הגלולה (ים) בPF-RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים (Cellometer) ולחשב את הנפח של השעית התא הנדרש (2 x 10 8 MNC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הנפח מחושב לצינור סטרילי 50 מ&quot;ל צנטריפוגה וספין ב 200 XG למשך 10 דקות (ללא בלמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant כך שאין אמצעי תקשורת שיורית נשאר ועדינות מחדש להשעות ידי קשה הצד של צינור. </li></ol> 3. Electroporation (Nucleofection) של MNC (תהליך בהיקף מלא באמצעות 10 cuvettes) ביום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירת צלחת סטרילית 12-היטב עם 10 בארות המכילות 4 מ&quot;ל של חם PF-RPMI ב37 humidified ° C CO / 5% 2 חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן וערכה מראש החמה Lonza Nucleofector פתרון האנושית תא T (מחדש להוראות יצרן, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com)</a> לטמפרטורת הסביבה בbiosafety קבינט (BSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסת Nucleofector / מיקס מאסטר DNA ידי Addin100 גרם של פתרון μl Nucleofector שיושלם, 15 מיקרוגרם של transposon (DNA פלסמיד supercoiled יועד כCD19RCD28/pSBSO) ו 5 מיקרוגרם של transposase (DNA פלסמיד supercoiled יועד כpCMV-SB11) לתגובה / קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את התא הגלול (מצעד 2.8) על ידי קשה בצד של צינור צנטריפוגה עדינות ומחדש להשעות בתמהיל Nucleofection פתרון / DNA אב (ריכוז תאים סופי: 2 x 10 7 cells/100 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר 100 μl של השעית התא (מצעד 3.4) לכל אחד מ( 10) 10 cuvettes Nucleofection Lonza, להיות זהיר, כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קש קובט פעם אחת, ובאמצעות תכנית electroporate U-014 (לתאי T unstimulated). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את cuvettes והצלחת 12-היטב (שלב 3.1) לBSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את תאי electroporated מכל קובט באמצעות פיפטה העברת מחט דקה Amaxa, על ידי הוספה ~ 500 μl של מדיום התרבות מראש התחמם ממקביל היטב (צלחת 12-התכוננה היטב בסנאטעמ &#39;3.1) ולהחזיר את הצלחת ל37 humidified ° C CO / 5% 2 חממה ל± 2 שעות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 2-HR הדגירה, הקציר ולהעביר את התאים מכל הבארות לצינור צנטריפוגות סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 140 דקות ל8, טמפרטורת הסביבה, לא בלם ולשאוב ולהשליך supernatant כך ששום מדיום שיורים מכסה תא הגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את תאי הגלולה ידי קשה בצד של צינור צנטריפוגה בעדינות ובעדינות מחדש להשעות בCCM להשיג השעית תא בודדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים ולהתאים את ריכוז תא ל10 6 תאים / מ&quot;ל בCCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השעית תא לבקבוק תא התרבות (הים) ומקום בחממה בן הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלבי תהליך 2.1-3.8 היו חוזרים לבקרה: תאי EGFP-transfected (5 10/6 תאי x קובט עם 5 מיקרוגרם Amaxa השליטה EGFP supercoiled פלסמיד, pmaxGFP). </li></ol> יום 1 של 1 ובלאחרמחזורי גירוי 4. ניתוח של ביטוי CAR על ידי זרימת cytometry על יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את תאי electroporated ולבצע ספירת תאים באמצעות שיטת הדרה הכחולה Trypan (hemocytometer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם (1 2 לx 10 6) עם נוגדן ספציפי לCD3, CD4, CD8, ונוגדנים אנושיים Fcγ (כמדידה של ביטוי מכונית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תאי FACS Calibur ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנת Express FCS לחשב ביטוי של מכונית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב + תאי CAR בתרבות על ידי הנוסחא: (מס &#39;של תאי קיימא סה&quot;כ) x (מכונת% + תאים) = מספר של רכב + תאים </li></ol></li></ol> 5. הכנת aAPC (שיבוט המס &#39;4) ביום 1. aAPC (שיבוט # 4) נגזרו מK562 תאים (קו ההורים השג מאוסף תרבות סוג אמריקאי) למולקולת Co-Express הרצוי T Cell שיתוף גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר aliquot של aAPC הקפוא 100 Gy המוקרן ב37 מעלות; אמבט מי C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפים פעמים על ידי צנטריפוגה XG ב 400, 10 דקות בCCM וספרו באמצעות Cellometer (הדרה הכחולה Trypan). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מספר aAPC קיימא נדרש לגירוי: (מס &#39;של מכונית + תאים) x 2 = מספר של aAPC המוקרן נדרשים </li></ol> 6. גירוי aAPC בתיווך של מכונית + תאי T ביום החל מיום 1 של 1 ו מחזורי גירוי עוקבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב תאי electroporated (מבטא CAR) וaAPC γ-מוקרן (שיבוט המס &#39;4) במכל סטרילי בכל יחס של 1:02 (+ תא CAR: aAPC קיימא) בCCM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב יחס aAPC מותאם לביטוי CAR מבוסס על הזרימה cytometry היום לאחר electroporation. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף IL-21 (30 ng / ml) להשעית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot בT-75 סנטימטר 2 בקבוק (הים) ו / או שקיות תרבות חי Vue בריכוז של 10 6 תאים / מ&quot;ל ולחזור לincubatאו. </li></ol> 3, 5 ימים 7. תרבות מתמשכת של מכונית + תאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שינוי חצי תקשורת, לחדש IL-21, ולשמור על תאי T בריכוז של 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> יום 7 8. סוף מחזור הגירוי aAPC בתיווך הראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי קציר, לספור וכתם לCD3, CD4, CD8, וFcγ (CAR) והמשיכו לשלב 10.1. </li></ol> 9. דלדול של תאי CD56 + (בדרך כלל בין 7 ל 14 ימים לאחר electroporation) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע CD56 דלדול באמצעות חרוזים פאראמגנטיים אם CD56 + CD3 ימפוציטים NEG ≥ 10%. </li></ol> מחזורי גירוי # 2, # 3, # 4 ומקבילים לימי 8 → 14, ימים אחרונים 15 → 21, וימים 22 → 28 10. תוספת רקורסיבית של aAPC להפץ תאי T למספרים קליניים מספיקים- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור stimulatioתהליך n (4 פעמים), כמתואר בצעדים 4.3-8.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף IL-2 (50U/ml) לתרבויות המתחילות בימים 7, 14 ו 21, ולאחר מכן בכל שינוי מדיה (שלוש פעמים בשבוע, ביום שני, רביעי ויום שישי לוח זמנים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryopreserve (ארכיון) תאי T עודפים במידת הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי T הוקפאו באמצעות מקפיא קצב מבוקר. </li></ol></li></ol> 28 יום 11. סוף מחזור הגירוי aAPC בתיווך האחרון: תאי T קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryopreserve תאי T לבדיקת שחרור ועירוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מערכות transposase, כגון מpiggyBac 12,19 וSB 18,20-22, Transposon וגישות שאינן נגיפים לריפוי גנטי שאלטרנטיבה לתמרת ויראלי בתיווך של מכונת כיתה קלינית + תאי T. SB נבחר כמערכת העברת הגנים המבוססת על הפוטנציאל שלו לריפוי גנטי אנושי 1,6,23. אנחנו פתחנו את הטכנולוגיות הכפולות של טרנספוזיציה SB (להציג CAR) ובנוסף רקורסיבית של aAPC γ-מוקרן (כדי לאחזר תאי T מהונדס גנטי ביציבות להביע CAR) לשמש כפלטפורמת טכנולוגיות בייצור תאי T TAA ספציפיים בעמידה עם cGMP לשלב I / II של ניסויים (איור 4). לאחר 28 יום (ארבעה מחזורי גירוי 7-יממה) של שיתוף התרבות בaAPC γ-מוקרן, אנחנו בדרך כלל מסוגלים להפיק לפחות ~ 10 10 תאים T מהונדס גנטי מתאימים ליישומי אדם. בהתאם לצורך, מחזורי גירוי נוספים יכולים להתבצע to לייצר מספר גדול יותר של תאי T מהונדס גנטי. יתר על כן, אם תאי T CAR פחות + יש צורך, הגישה לelectroporation והתפשטות וניתן לשנות בחזרה העסקת cuvettes פחות וביצוע סט משנה רק מתאי T התרחב מספרי לסיבובים הבאים של התפשטות על aAPC קדימה בתחילתו של כל מחזור גירוי. רוב electroporated ומופץ תאי T שנקטפו לעירוי ביציבות להביע את המכונית. התולדה של CD4 + ו CD8 + תאי T מבטאים CAR הדור nd 2 שלנו כוללת תאים עם פנוטיפ זיכרון / נאיבי ולהציג 3 סימני היכר של ייחוד מחדש ביים. ראשית, תאי T המהונדס גנטי ספציפיים lyse CD19 + מטרות, ושנית, לייצר IFN-γ בתגובה לCD19 + תאי ממריץ ושלישיים, מתרבים בתגובה לCD19 + תאים מזינים, כולם באופן CAR תלוי 13,18. הגישה שלנו לintegrאכלתי transgene CAR על ידי אלקטרו העברת פלסמידים DNA שאינם נגיפיים ממערכת SB יכול להתבצע בתאי T רדומים עיקריים הנגזרים מPB וUCB. אנחנו ואחרים שינה K562 תאים גנטיים לשמש כaAPC ליעילות קלינית להפיץ מספרים מספיקים של תאי T-לעירוי 24,25. AAPC וסביבת תרביות רקמה (לדוגמה: התוספת של IL-21) כבר הותאמו ליצירת מטופל והתורם נגזר-CD19 תאי T ספציפיים לעירוי לאחר השתלת תאי הגזע hematopoietic (לוח 1) 13,18. אנחנו יכולים לייצר מכונית + תאי T מPB פשוט מתקבלים על ידי venipuncture אשר ימנע את העלות, אי נוחות וחוסר הנוחות של קבלת MNC מPB ידי אפרזיס. היכולת להפיק כמויות גדולות של מכונית + תאי T ממספר קטן של MNC במיוחד מושכת ליציקת תאי T לאחר אלוגנאית UCB השתלה. הגודל ואנונימיות קטן של תורם היילודים מונעים מחדש-גישה לאדם זה בנקודת זמן מאוחר יותר, ורק מספר מוגבל של נקטף MNC זמין כחומר מוצא לייצור התאים T כדי להימנע מלהפריע לhematopoiesis. התקדמות נוספת בתהליך הייצור היא כרגע בעיצומו שיכלול מכשיר electroporation תפוקה גבוהה בשילוב עם bioreactor גל סגור לגמרי כדי למזער טיפול. במצטבר, SB וaAPC פונים פלטפורמות ליצירת מכונת CD19 ספציפית + תאי T שניתן להתאים לייצר מספר רב של תאי T מהונדס גנטי שיכול לזהות TAAs החלופי על פני קרום תא בעמידה בcGMP.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים </td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגים </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> GFP להביע פלסמיד דנ&quot;א (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (ערכה) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> סיגמא </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> חינם פנול RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי Hyclone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> IL-21 האנושי רקומביננטי </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 רקומביננטי האנושי (Proleukin) </td><td> נוברטיס </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> קיט התא T אנושי (פתרון Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD56 מגיב CliniMACS </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC מצומדות לעכבר MAB ספציפי לאדם CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC מצומדות לעכבר ספציפי מאב לCD4 אדם </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 מצומדותלעכבר MAB ספציפי לאדם CD8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-מצומד ל-F (ab &#39;) 2 בר של נוגדנים ספציפיים לאדם שעיר Fcγ </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> יזיד הנתרן </td><td> סיגמא </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Disposables </td></tr><tr><td> צלחת 12-היטב </td><td> קורנינג </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 סנטימטר 2 בקבוק </td><td> קורנינג </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> שקיות תרבות </td><td> Vue חיים </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> צינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sטרונג&gt; ציוד </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector השני </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> חזון Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה Sorvall המקרא RT </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> מקפיא קצב מבוקר </td><td> פלנר </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS ביו הבינלאומי </td><td> IBL-437-C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> ביטוי של מולקולות (אנדוגני והציג) </td></tr><tr><td> קו סלולרי </td> &lt;td&gt; שם נפוץ </td><td> סוג התא </td><td> מולקולות הביעו </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> שיבוט 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP שיתוף הביע-עם קרום חייב IL-15 </td></tr></tbody></table> מדיה תרבות שלמה (CCM) (מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 30 ימים) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% GlutaMAX מאגר cytometry זרימה (מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 30 ימים) PBS 2% FBS יזידו נתרן 0.1% </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

העצמה של תאי T קליני כיתה ניתן לשפר על ידי שילוב של טיפול גנטי עם טיפול חיסוני למהנדס מוצר ביולוגי עם הפוטנציאל להכרה מעולה (אני) של אנטיגנים הקשורים גידול (TAAs), (ii) התמדה לאחר עירוי, (iii) פוטנציאל להגירה לאתרי גידול ויכולת (ד) למחזר פונקציות מפעיל במייקרו הגידול. רוב הגישות למניפולציה גנטית של תאי T המהונדס ליישום אנושי השתמשו רטרווירוס וlentivirus לביטוי היציב של CAR 1-3. גישה זו, אם כי בקנה אחד עם פרקטיקת ייצור טובה נוכחית (GMP), יכול להיות יקרה כמו שהיא מסתמכת על הייצור ושחרורו של וירוס רקומביננטי קליני כיתה ממספר מוגבל של מתקני ייצור. העברת אלקטרו של פלסמידים nonviral היא חלופה מושכת לתמרה מאז ניתן לייצר מיני DNA לכיתה קלינית בכ 1/10 ה עלות recombinוירוס הנמלה GMP בכיתה. כדי לשפר את היעילות של שילוב התאמנו יפהפה נרדמים (SB) transposon וtransposase ל4-8 יישום אנושיים. מערכת SB שלנו משתמשת בשני פלסמידים DNA שמורכבים מtransposon קידוד לגן של עניין (2 דור nd למשל transgene CAR-CD19 ספציפי, המיועדים CD19RCD28) וtransposase (למשל SB11) אשר מוסיף לtransgene dinucleotide ת&quot;א חוזר 9-11 . כדי לייצר מספר קליני מספיק של תאי T-מהונדס גנטי שאנו משתמשים בתאי K562-derived מלאכותיים מציגי אנטיגן (aAPC) (שיבוט # 4) השונים להביע TAA (למשל CD19), כמו גם את מולקולות costimulatory תאי T CD86, CD137L, גרסת קרום נכנס של (IL) אינטרלוקין -15 (פפטיד התמזג לאזור Fc modified IgG4) וCD64 (FC-γ קולט 1) לטעינה של נוגדנים חד שבטי (MAB) 12. בדו&quot;ח זה, אנו מדגימים את ההליכים שיכולים להתבצע בcompliaNCE עם cGMP לייצר מכונת CD19 + תאים ספציפיות המתאימים ליישום אנושי T. זה הושג על ידי אלקטרו העברה סינכרונית של שני פלסמידים DNA, SB transposon (CD19RCD28) וSB transposase (SB11) ואחרי שהליפה של integrants היציב על ידי תוספות כל-7-היום (מחזור גירוי) של aAPC γ-מוקרן (שיבוט המס &#39;4) בנוכחות של IL-2 המסיס רקומביננטי האנושי ו-IL-21 13. בדרך כלל 4 מחזורים (28 ימים של התרבות הרציפה) הם התחייבו לייצר מספר קליני מושך-של תאי T שמבטאים יציבות הרכב. מתודולוגיה זו לייצור תאי T קליני כיתה CD19 ספציפיים יכולה להיות מיושמת על תאי T שמקורם הדם היקפי (PB) או דם טבורים (UCB). יתר על כן, גישה זו ניתן לרתום ליצירת תאי T לסוגי גידולים שונים על ידי זיווג הספציפי של המכונית שהוצגה בביטוי של TAA, מוכר על ידי המכונית, בaAPC.

אנו מדווחים כי העברה של אלקטרו פלסמידים DNA והתפשטות של תאי T על aAPC γ-מוקרן יכולה לשמש ליצירת מספרים קליניים מושכים-של תאי T הנגזרים מPB וUCB עבור יישומי אדם. תאי T המהונדסים גנטי אלה מבטאים CAR הציג שמכיר TAA CD19, העצמאי מורכב histocompatibility גדול. את פלסמידים DNA SB-derived להביע (אני) transposon, CAR דור 2 nd (CD19RCD28) כי אותות באמצעות CD28 וCD3-ε 14, ו (ב) transposase, SB11 15, כבר תאר בעבר 13, 16,17 . את פלסמידים השתמשו במחקר הנוכחי היו מיוצרים באופן מסחרי על ידי מתקן Biomanufacturing קליני ויסמן (מדיסון, ויסקונסין). AAPC (שיבוט המס &#39;4), המופק מתאי K562 (קו הורי המתקבל מאוסף תרבות סוג אמריקאי), מולקולות שיתוף מפורש הרצויות T סלולריים שיתוף של גירוי (כל מולקולה הציגה ב3 90% על פני תא של aAPC),כפי שתואר קודם לכן 12. כאן אנו מראים כי תאי T CD19 ספציפיים יכולים להיות שנוצרו מתאי mononuclear (MNC) נגזרים מPB או UCB באמצעות טרנספוזיציה SB להציג את המכונית ואחרי תוספת של aAPC מספרי כדי להרחיב את תאי T באופן CAR תלוי (איורים 1 , 4) 13,18. עשר cuvettes (2x10 7 MNC / קובט) הם electroporated עבור כל נמען באמצעות 15 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד (CD19RCD28/pSBSO) קידוד לtransposon (CAR) ו5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (pCMV-SB11) קידוד לtransposase (SB11). מספר cuvettes יכול להיות מופחת אם MNC מגביל או טפס חזרה לעבודה במעבדה. יום electroporation מוגדר &quot;0 ימים&quot; של מחזור גירוי # 1. כפקדים לתנאי תרבות cytometry זרימה, תאי T autologous הם electroporated המדומה (ללא DNA פלסמיד) ומספריים הרחיבו aAPC γ-מוקרן (שיבוט # 4) שטעון מראש עם OKT3 לקישור לחצות CD3 לקיים תא T התפשטות. אנו routinely להעריך את היעילות של electrotransfer וכדאיות של תאי T היום לאחר electroporation (איור 2 ב &#39;). הביטוי של EGFP מ-DNA השליטה פלסמיד (מיועד pmaxGFP) ורכב בנקודת זמן ראשוני זה משקף ביטוי חלבון ממשולב וepisomal פלסמיד. בדרך כלל, היום לאחר electroporation אנו מודדים את ביטוי EGFP ב ~ 60% וCAR ביטוי ב ~ 40% (איור 2 א) בכדאיויות תא T בין 40-50%. נוסף רקורסיבית של aAPC γ-מוקרן בנוכחות של IL-2 המסיסים רקומביננטי אדם וIL-21 לאחזר תאי T מבטאים יציבות רכב (CD19RCD28). CD3 NEG CD56 + תאי NK מתרוקנים מהתרבות באמצעות חרוזים פאראמגנטיים CD56 ספציפיים אם אחוז תאי NK אלה הוא ≥ 10% ובמיוחד אם אחוז CAR הביע על תאי T הוא נמוך. דלדול זה מונע צמיחת יתר המהירה של תאי NK אשר מפריעה ליכולת של aAPC כדי לקיים proliferation של רכב + תאי T. בהזדמנות, דלדול של תאי NK ממכונית + תאי T נעשה בשני המחזורים האחרונים הגירוי, אבל זה מציג את אובדן של תאים רצויים עקב ביטוי המשותף של CD56 על מכונית כלשהי + תאי T. תאי ה-T גדלו במערכת סגורה פונקציונלית שימוש בתיק תרבות חי Vue עבר יום 14. תת קבוצה של תאי T המהונדס גנטי והם מופצים בדרך כלל בcryopreserved יום 14 או יום 21 (סוף מחזורי גירוי # 2 או מס &#39;3) של שיתוף התרבות בaAPC לשמש כמקור לחומר בארכיון לניתוחים עתידיים ולהיות מופשר אם בעיות לא צפויות בהמשך להתרחש בעת תהליך הייצור. תאי T נקצרים בדרך כלל יום או כ 28 יום של התרבות (איור 3) שקבע מפורש&gt; CAR 90% והם&gt; 80% קיימא (האיור 2C, ד). הראינו בעבר, שאחרי ארבעה שבועות של שיתוף התרבות בaAPC-הרחבה פי הממוצע של CD3 + תאי T היא 19800 ± 11313 עם CA<html> R + ביטוי להיות 90% ± 7.5 13. תאי T אלו cryopreserved ועוברים בתהליך בדיקות ושחרור שמודיעה על הבטיחות והפוטנציאל טיפולי של המוצר המיוצר. בדיקות שחרור מתבצעת בעמידה בתיקוני מעבדה קליניים לשיפור (CLIA) ליצירת תעודת ניתוח לפני העירוי לנמענים בניסויים קליניים. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> צעדים המתווים את התהליך לelectroporate ולהפיץ CAR + תאי T מPB וUCB. איור 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. אפיון של תאי T מהונדס גנטי מPB. () ביטוי של EGFP ביום 0 מחזור הגירוי הראשון להעריך את היעילות של העברת גנים. ביטוי של CAR-CD19 הספציפי (CD19RCD28) כפי שהוערך על ידי cytometry הזרימה בCD3 +, CD8 + ותאי T מסוג CD4 + ב( ב &#39;) כ 24 שעות לאחר electroporation ו( ג) 28 ימים לאחר שיתוף התרבות בaAPC. ביטוי דומה של מכונית נצפה עם תאי T-UCB נגזרים. (ד) קינטיקה של ביטוי CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> איור 3. התפשטות של CAR PB-derived+ T תאים. קצב ההתרחבות מספרית של CD3 + וCAR + תאי T הנגזרים מPB על ידי שיתוף התרבות חזרה על aAPC γ-מוקרן בנוכחות אנושית רקומביננטי המסיס IL-2 ו-IL-21. חיצים כלפי מעלה מצביעים על ההוספות של aAPC γ-מוקרן המציינות את תחילתו של כל מחזור גירוי. תאי T CAR UCB נגזר + מציגים שיעורים דומים של התרחבות מספרית. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> איור 4. סכמטי של תהליך הייצור באמצעות מערכות aAPC SB והגנטי כדי לשנות ולהפיץ CAR + תאי T הנגזרים מPB וUCB. CAR CD19 ספציפי + תאי T נוצרו על ידי העברה של אלקטרו פלסמידים SB-נגזר supercoiled DNA ושיתוף התרבות הבאה על aAPC K562-derived (שיבוט המס &#39;4) בנוכחות oו IL-2 רקומביננטי אדם המסיס וIL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="5"> מקור התא T </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> עירוי תאי T </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> (מטופל נגזר) ** autologous </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> לאחר השתלה עצמית hematopoietic בתאי גזע </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> אלוגנאית (תורם נגזר-) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> לאחר השתלה אלוגנאית hematopoietic בתאי גזע </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><tד&gt; 14577 </td></tr><tr><td> אלוגנאית (תורם נגזר-) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> לאחר השתלת דם טבורים אלוגנאית </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * טבלה 1. ניסויים קליניים בחסות ה-FDA בMDACC להחדיר מכונת CD19 ספציפית + תאי T מופצים בaAPC. תאי T ספציפי ניתנים לCD19 דרך ביטוי כפוי של SB transposon קידוד לרכב דור nd 2, CD19RCD28 המיועד, שאותות באמצעות CD28 וCD3-ε. ** משפט מתואר בהתייחסות 5.

Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

תאי T מבטאים רצפטור אנטיגן chimeric CD19 ספציפי (CAR) הם חדורים כטיפול investigational של ממאירויות B-cell בניסויים בריפוי הגנטי הראשונים ב-האנושיים שלנו. אנו מתארים שינוי גנטי של תאי T באמצעות<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; מערכת (SB) להציג CAR CD19 ספציפי והפצה סלקטיבית על מעצב CD19 + תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K Views.  U.T. MD Anderson Cancer Center. תאי T מבטאים רצפטור אנטיגן chimeric CD19 ספציפי (CAR) הם חדורים כטיפול investigational של ממאירויות B-cell בניסויים בריפוי הגנטי הראשונים ב-האנושיים שלנו. אנו מתארים שינוי גנטי של תאי T באמצעות יפהפה נרדם מערכת (SB) להציג CAR CD19 ספציפי והפצה סלקטיבית על מעצב CD19 + תאי מציגי אנטי?...

Video: Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...