Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Carl June (Universidade da Pensilvânia) para ajudar a geração e fornecimento de clone AAPC # 4 e Dr. Perry Hackett (Universidade de Minnesota) para obter ajuda com o sistema SB. Conceder um apoio: Cancer Center Núcleo Grant (CA16672); SR1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome Fundo; Gillson Longenbaugh Foundation; Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas; CLL Global Research Foundation; Departamento de Defesa; Imóveis de Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fundo de Imunoterapia Leucemia, Instituto de Terapia personalizado do câncer, leucemia e linfoma Sociedade; Fundação de Pesquisa linfoma; Irmã MDACC da Instituição Rede Fundo; Miller Foundation; Sr. Herb Simons; Sr. e Sra. Joe H. Scales, o Sr. Thomas Scott; Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer, Fundação de Pesquisa Pediátrica Câncer; assistanc Produçãoe para terapias celulares (PACT), William Lawrence e Fundação Blanche Hughes Infância.

<html> Dia 0 ou Antes 1. Isolamento de células mononucleares (MNC) de PB e UCB <ol><li> Diluir PB com igual volume, e UCB com quatro volumes de PBS-EDTA. </li><li> Lentamente sangue camada diluída (25 ml) em Ficoll (12 ml) num tubo de centrifugação de 50 ml (s) e centrifugar a 400 xg durante 30 - 40 minutos (sem travagem). </li><li> Recolher e transferir a fracção de células mononucleares (interface) utilizando uma pipeta de transferência para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Trazer o volume até 50 ml com PBS-EDTA e centrifugar a 450 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante, gentilmente re-suspender o sedimento de células (s) em 50 ml de meio de cultura completo (CCM) e, centrifugar a 400 xg durante 10 min. </li><li> Delicadamente ressuspender e piscina as pelotas de células em CCM e realizar uma contagem de células usando Trypan método de exclusão de azul (Cellometer, programa PBMC). </li><li> EMN pode agora ser utilizado para a electroporação (Nucleofection) ou criopreservados para utilização futura. </li></ol>título &quot;&gt; 2 Preparação. das Células T para Electroporation no dia 0 <ol><li> Se usar MNC criopreservado, rapidamente descongelar células suficientes para uma escala total de electroporação (2 x 10 8 a adição ~ 20% para levar em conta a perda de células durante a centrifugação e 2 horas de incubação) em banho de água a 37 ° C. Se estiver usando o recém isolado MNC avançar para o passo 2.3. </li><li> Gentilmente re-suspender as células e transferir para um tubo de centrifugação de tamanho adequado (s) pré-aquecida continha completa Fenol livre de cultura meio RPMI (PF-RPMI) e centrifugar a 200 xg durante 10 min (no freio), sobrenadante aspirado. </li><li> Re-suspender o MNC no PF-RPMI, realizar uma contagem de células (Cellometer) e transferir as células para um recipiente de tamanho adequado das células de cultura (s) a uma concentração de 10 6 células / ml. </li><li> Incubar em 37 humidificada ° C / 5% CO 2 incubadora durante 2 horas ± 30 minutos. </li><li> Transferir o MNC para tubo de centrífuga estéril (s), rotação a 200 xg durante 5 min (sem travões), aspirar o sobrenadante e r suavementee-suspender e combinar o sedimento de células (s) em meio RPMI-PF. </li><li> Realizar uma contagem de células (Cellometer) e calcular o volume de suspensão de células necessária (2 x 10 8 MNC). </li><li> Transferir o volume calculado para um tubo de centrifugação estéril de 50 mL e centrifugação a 200 xg durante 10 min (sem travagem). </li><li> Aspirar o sobrenadante para que nenhuma mídia residuais continua e suavemente volte a suspender tocando lateral do tubo. </li></ol> 3. Eletroporação (Nucleofection) de MNC (Processo de escala completa 10 Usando Cuvetes) no Dia 0 <ol><li> Pré-incubar uma placa de 12 poços estéreis com 10 poços, contendo 4 ml de RPMI morno PF-37 em uma humidificado ° C / 5% CO 2 incubadora. </li><li> Preparar e pré-aquecer a Lonza Solução Nucleofector kit de células T humanas (reconstituído por instruções do fabricante, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) a temperatura ambiente em um gabinete de Biossegurança (BSC). </li><li> Prepare a solução Nucleofector / master mix DNA por adding ul 100 de completada solução Nucleofector, 15 ug de transposão (superenrolado DNA plasmídeo designado como CD19RCD28/pSBSO) e 5 ug de transposase (superenrolado DNA do plasmídeo designado por pCMV-SB11) por reacção / cuvete. </li><li> Dispersa-se o sedimento de células (do passo 2.8) batendo suavemente na parte lateral do tubo de centrifugação e re-suspensão em solução Nucleofection master mix / DNA (concentração celular final: 2 x 10 7 células/100 uL). </li><li> Transferir cuidadosamente 100 ul da suspensão de células (do passo 3.4) para cada um de dez (10) cuvettes Nucleofection Lonza, tendo cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Toque a cuvete uma vez, e utilizando o programa electroporate U-014 (para as células T não estimuladas). </li><li> Transferir as cuvetes e a placa de 12 poços (Passo 3.1), para o BSC. </li><li> Colher as células electroporadas a partir de cada cuvete, usando uma pipeta de transferência Amaxa ponta fina, por adição de ~ 500 uL de meio de cultura pré-aquecido a partir do correspondente poço (placa de 12 poços preparadas em Step 3,1) e voltar a placa a 37 ° C humidificado / 5% de CO 2 incubadora durante 2 horas ± 30 minutos. </li><li> Seguindo a incubação de 2 horas da colheita, e transferir as células de todas as cavidades de um tubo de centrífuga estéril. </li><li> Lave as células por centrifugação a 140 xg durante 8 minutos, a temperatura ambiente, sem travão, aspirar e desprezar o sobrenadante, de modo que nenhum meio residual cobre o pellet celular. </li><li> Dispersa-se o pellet celular batendo suavemente na parte lateral do tubo da centrífuga e suavemente re-suspender em CCM para obter uma suspensão de célula única. </li><li> Realizar a contagem de células e ajuste a concentração celular a 10 6 células / ml em CCM. </li><li> Transferir a suspensão de célula para célula frasco de cultura (s) e colocados no incubador durante a noite. </li><li> Passos do processo 2,1-3,8 foram repetidas para o controle: EGFP transfectadas células (5 x 10 6 células / cuvete com 5 ug Amaxa controle EGFP plasmídeo super-enrolado, pmaxGFP). </li></ol> º dia de 1 de 1 e SubsequenteCiclos de estimulação 4. Análise de Expressão CAR por citometria de fluxo no 1 º dia <ol><li> Colher as células electroporadas e realizar uma contagem de células utilizando Trypan método de exclusão de azul (hemocitômetro). </li><li> Células de manchas (1-2 x 10 6) com o anticorpo específico para CD3, CD4, CD8, e de IgG humana Fcy (como uma medida da expressão CAR). </li><li> Adquirir células em FACS Calibur e analisar os dados utilizando software FCS Express para calcular a expressão do CAR. <ol><li> Calcule células + carro na cultura pela fórmula: (N º de Total de células viáveis) x (CAR% + células) = Número de carro + células </li></ol></li></ol> 5. Preparação de AAPC (clone # 4) no Dia 1. AAPC (clone # 4) foram derivadas de células K562 (linha parental Obtido a partir de American Type Culture Collection) com Co-express T Molecule célula desejada Co-estimulação <ol><li> Descongelar uma alíquota congelada de AAPC 100 Gy irradiada em um 37 °; C banho de água. </li><li> As células são lavadas duas vezes por centrifugação a 400 xg, 10 min em CCM e contados utilizando Cellometer (exclusão Trypan azul). </li><li> Calcular o número de AAPC viável necessário para a estimulação: (Número de carro + células) x 2 = N º de AAPC irradiado exigido </li></ol> 6. AAPC mediada por estimulação do CAR + Células T no dia 1 Início do 1 º e ciclos de estimulação subseqüentes <ol><li> Misturar as células electroporadas (expressando CAR) e γ-irradiado AAPC (clone # 4) em um recipiente estéril numa proporção de 1:2 (células CAR +: AAPC viável) em CCM. <ol><li> Note-se a relação de AAPC é ajustado para a expressão de CAR baseado em citometria de fluxo no dia após a electroporação. </li></ol></li><li> Adicionar IL-21 (30 ng / ml) à suspensão de células. </li><li> Alíquota em T-75 cm 2 frasco (s) e / ou bolsas de Vida Vue cultura a uma concentração de 10 6 células / ml, e retornar para o incubatou. </li></ol> Dias 3, 5 7. Continuação de Cultura CAR + Células T <ol><li> Realizar uma mudança de meio media, reabastecer IL-21, e manter as células T a uma concentração de 10 6 células / ml. </li></ol> Dia 7 8. Fim do ciclo de estimulação Primeiro AAPC mediada <ol><li> Células colheita, contar e mancha para CD3, CD4, CD8, e Fcy (CAR) e vá para a etapa 10.1. </li></ol> 9. Depleção de células CD56 + (geralmente entre 7 e 14 dias após a electroporação) <ol><li> Executar uma depleção de CD56 usando esferas paramagnéticas se CD56 + CD3 linfócitos neg ≥ 10%. </li></ol> Ciclos de estimulação # 2, # 3, # 4 e correspondente aos dias 8 → 14, Dias 15 → 21, e dias 22 → 28 10. Adição recursiva da AAPC para propagar as células T a números Clinicamente-suficientes <ol><li> Repita o stimulation processo (4 vezes), tal como descrito nos passos 4,3-8,1. </li><li> Adicionar IL-2 (50U/ml) para as culturas que começam nos dias 7, 14 e 21, e em seguida, em cada mudança de mídia (três vezes por semana, em um horário de segunda a quarta-feira e sexta-feira). </li><li> Criopreservar (arquivo) excesso de células T, conforme necessário. <ol><li> As células T congeladas usando congelador taxa controlada. </li></ol></li></ol> Dia 28 11. Fim do ciclo de estimulação Última AAPC mediada: Células T Colheita <ol><li> Criopreservar células T para testes de libertação e de infusão. </li></ol>

<ol>
	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Transposon e sistemas de transposase, tais como a partir de 12,19 piggyBac e SB 18,20-22, são não-virais abordagens para a terapia genética, que são uma alternativa aos viral mediada por transdução do CAR grau clínico + células T. O SB foi escolhido como o sistema de transferência de genes com base no seu potencial para a terapia de gene humano 1,6,23. Nós desenvolvemos as tecnologias duais de SB transposição (para introduzir um CAR) e adição de γ recursiva irradiado AAPC (para recuperar as células T geneticamente modificadas que expressam estavelmente um CAR) para servir como plataforma de tecnologias para o fabrico de células T específicas para TAA em conformidade com cGMP para a Fase I / II de ensaios (Figura 4). Após 28 dias (quatro ciclos de 7 dias de estimulação) de co-cultura sobre γ-irradiado AAPC, que são tipicamente capazes de produzir, pelo menos, ~ 10 10 geneticamente modificados células T adequado para aplicações em seres humanos. Conforme necessário, ciclos de estimulação adicional pode ser realizada to gerar grandes números de células T geneticamente modificadas. Além disso, se as células menos CAR + T são necessários, a aproximação a electroporação e propagação pode ser reduzida para menos empregando cuvetes e levar adiante, apenas um conjunto de sub-das células T expandidas numericamente para ciclos subsequentes de proliferação de AAPC, no início de cada ciclo de estimulação. A maioria da electroporação e propagadas as células T colhidas para perfusão estavelmente expressam o CAR. A conseqüência de células CD4 + e CD8 + T que expressam nossa CAR 2 ª geração incluem as células com um fenótipo de memória / ingênuo e apresentam três características de re-direcionado especificidade. Em primeiro lugar, as células geneticamente modificadas especificamente T lisam alvos CD19 +, por outro lado, produzem IFN-γ em resposta a células CD19 + do estimulador e, em terceiro lugar, se proliferam em resposta a CD19 + células alimentadoras, todos de uma maneira dependente da CAR 13,18. Nossa abordagem para integrcomeu um transgene CAR por eletro-transferência de plasmídeos não-virais de DNA a partir do sistema SB pode ser realizado em repouso células T primárias derivadas de PB e UCB. Nós e outros autores geneticamente modificado células K562 para servir como AAPC para propagar eficientemente números clinicamente suficiente de células T para infusão de 24,25. A AAPC e ambiente de cultura de tecidos (por exemplo, a adição de IL-21) foram foram modificadas para gerar paciente e doador-derivado de células CD19-T específicas para a infusão após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (Tabela 1) 13,18. Nós podemos produzir CAR + células T de PB simplesmente obtidas por punção venosa que evita o custo, desconforto e inconveniência de se obter a partir de PB MNC por aférese. A capacidade de derivar um grande número de células T + CAR de pequenos números de MNC é particularmente atraente para a infusão de células T após transplante alogénico da UCB. O pequeno tamanho e anonimato do doador neonatal impede re-Aceder a este indivíduo em um ponto de tempo mais tarde, e apenas um número limitado de colheita MNC estão disponíveis como material de partida para a fabricação de células T para evitar interferir com a hematopoiese. Outros avanços para o processo de fabricação estão em andamento para incluir um dispositivo de electroporação elevado rendimento acoplado com um biorreactor WAVE totalmente fechada para minimizar a manipulação. No agregado, o SB e AAPC plataformas são atraentes para gerar CD19 específico CAR + células T que podem ser adaptados para gerar grandes números de células T geneticamente modificadas que podem reconhecer alternativas da superfície celular TAAs em conformidade com cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagentes </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> DNA expressando GFP plasmídeo (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> APV-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol livre de RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino Hyclone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> IL-21 humana recombinante </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 recombinante humano (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de células T humanas (Solução Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS Reagente CD56 </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugado com FITC para rato mAb específico para CD3 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-conjugado com o mAb de rato específico para CD4 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 conjugadopara rato mAb específico para CD8 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugados com F (ab &#39;) 2 de fragmento de anticorpo de cabra específico para o humano Fcy </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Descartáveis </td></tr><tr><td> Placa de 12 poços </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 balão </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Sacos de Cultura </td><td> Vue Vida </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 tubo de centrífuga ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Equipamentos </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> Visão Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend Centrífuga RT </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Congelador taxa controlada </td><td> Cunha </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiador </td><td> CIS bio Internacional </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Expressão de moléculas (endógena e Introduzido) </td></tr><tr><td> Linha Celular </td> &lt;Nome&gt; td comum </td><td> Tipo de célula </td><td> Moléculas expressas </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expresso com a membrana ligada a IL-15 </td></tr></tbody></table> Meios de cultura completos (CCM) (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 FBS a 10% 1% GlutaMAX Tampão de Citometria de Fluxo (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) PBS FBS 2% 0,1% Azida de sódio </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

A potência das células de grau clínico T pode ser melhorado através da combinação de terapia de genes com a imunoterapia de engendrar um produto biológico, com o potencial de reconhecimento (i) superior de antigénios associados a tumores (TAAs), (ii) após a infusão de persistência, (iii) potencial de migração para o local do tumor, e (iv) a capacidade de reciclar as funções efectoras dentro do microambiente do tumor. A maioria das abordagens para a manipulação genética de células T modificadas para aplicação em seres humanos usaram lentivírus dos retrovírus e para a expressão estável de CAR 1-3. Esta abordagem, apesar de compatível com Boas Práticas de Fabricação (BPF), pode ser caro, uma vez que conta com a produção e liberação de clínica-grade vírus recombinante a partir de um número limitado de unidades de produção. A transferência de plasmídeos electro-não-virais é uma alternativa atraente para a transdução de ADN uma vez que as espécies podem ser produzidos ao grau clínico em cerca de 1/10 de o custo de recombinformiga vírus GMP-grade. Para melhorar a eficiência da integração nos adaptamos Bela Adormecida (SB) transposon e transposase para aplicação humana 4-8. O nosso sistema SB utiliza dois plasmídeos de ADN, que consistem de um transposão que codifica para um gene de interesse (por exemplo, 2 ª geração CD19 específico transgene CAR, designado CD19RCD28) e uma transposase (por exemplo, SB11), que insere o transgene no dinucleótido TA repete 9-11 . Para gerar números suficientes de clinicamente geneticamente modificados células T que usamos K562 células derivadas de antigénios artificiais que apresentam (AAPC) (clone # 4) modificados para expressar um TAA (por exemplo, CD19), assim como as moléculas de co-estimulação de células T CD86, CD137L, uma ligada à membrana versão de interleucina (IL) -15 (péptido fundido a modificação região Fc de IgG4) e CD64 (Fc-receptor γ 1) para o carregamento de anticorpos monoclonais (mAb) 12. Neste relatório, demonstrar os procedimentos que podem ser realizados em compliance com cGMP para gerar CD19 específico CAR + células T adequadas para aplicação em seres humanos. Isto foi conseguido através da electro-transferência síncrona de dois plasmídeos de ADN, de um transposão SB (CD19RCD28) e uma transposase SB (SB11) seguido por recuperação de integrantes estáveis ​​pelas adições cada-7-dia (ciclo de estimulação) de γ-irradiado AAPC (clone # 4), na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 13. Tipicamente quatro ciclos (28 dias de cultura contínua) são realizadas para gerar números clinicamente atraentes de células T que expressam estavelmente o CAR. Esta metodologia de fabrico de grau clínico de células T específicas para CD19 pode ser aplicada a células T derivadas do sangue periférico (PB) ou sangue de cordão umbilical (UCB). Além disso, esta abordagem pode ser aproveitado para gerar células T para diversos tipos de tumores, emparelhando a especificidade do CAR introduzida com a expressão do TAA, reconhecido pela CAR, na AAPC.

Relatamos que a transferência de electro-de cosmídeos e propagação de células T em γ-irradiado AAPC pode ser usado para gerar números clinicamente atraentes de células T derivadas de PB e UCB para aplicações em seres humanos. Estas células T geneticamente modificadas de expressar uma CAR introduzida que reconhece o CD19 TAA, independente do complexo de histocompatibilidade principal. Os plasmídeos derivados de SB DNA para expressar o transposão (i), uma 2 ª geração CAR (CD19RCD28) que os sinais por meio de CD28 e CD3 ε-14, e (ii) transposase, SB11 15, foram descritos anteriormente 13, 16,17 . Os plasmídeos utilizados no presente estudo foram produzidas comercialmente por Waisman unidade de biomanufatura clínica (Madison, WI). A AAPC (clone # 4), derivada de células K562 (linha parental obtida American Type Culture Collection), co-express de células T desejados moléculas co-estimuladoras (cada molécula introduzida em 3 a 90% na superfície das células de AAPC),como previamente descrito 12. Aqui, mostramos que as células T específicas para CD19 podem ser gerados a partir de células mononucleares (MNC) a partir de derivados PB ou SB UCB utilizando transposição para introduzir o CAR, seguido pela adição de AAPC para numericamente expandir as células T de uma forma dependente do CAR (Figuras 1 , 4) 13,18. Dez cuvetes (2x10 7 MNC / cuvete) são electroporados para cada destinatário, utilizando 15 ug de ADN do plasmídeo (CD19RCD28/pSBSO) que codifica para a transposão (CAR) e 5 ug de ADN do plasmídeo (pCMV-SB11) que codifica para a transposase (SB11). O número de cubetas pode ser reduzido se MNC estão limitando ou reduzidas para o trabalho de laboratório. O dia da electroporação é definido como &quot;0 Dia&quot; ciclo de estimulação # 1. Como controles para a citometria de fluxo e as condições de cultura, as células T autólogas são electroporated simulado (sem ADN de plasmídeo) e numericamente expandido em γ-irradiado AAPC (clone # 4) que tinha sido pré-carregada com OKT3 para atravessar link-CD3 das células T para sustentar proliferação. Nós routinely avaliar a eficiência de electrotransferência e viabilidade das células T no dia após a electroporação (Figura 2B). A expressão de GFP de controlo de ADN de plasmídeo (designado pmaxGFP) e CAR, neste ponto de tempo inicial reflicta a expressão da proteína a partir do plasmídeo integrado e epissomal. Normalmente, o dia após a eletroporação medimos expressão EGFP em ~ expressão 60% e CARRO em ~ 40% (Figura 2) com T viabilidade celular entre 40-50%. Adições recursivas de γ-irradiado AAPC, na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 recuperar as células T que expressam estavelmente CARRO (CD19RCD28). CD3 neg células CD56 + NK estão esgotados a partir da cultura usando esferas paramagnéticas CD56-específicos, se a percentagem das células NK é ≥ 10% e, especialmente, se a percentagem de CAR expressado nas células T é baixa. Isto impede que o esgotamento rápido crescimento excessivo das células NK, que interfere com a capacidade de sustentar a AAPC proliferation da CAR + células T. Em certas ocasiões, a depleção de células NK de CAR + células T é realizada durante os últimos dois ciclos de estimulação, mas introduz-se uma perda de células desejadas devido a co-expressão de CD56 em alguns CAR + células T. As células T foram cultivadas em um sistema funcionalmente fechado usando sacos de cultura Vue Vida passado dia 14. Um subconjunto de células geneticamente modificadas e propagadas T são tipicamente criopreservadas no Dia 14 ou Dia 21 (fim dos ciclos de estimulação # 2 ou # 3) de co-cultura em AAPC para servir como uma fonte de material de arquivo para análises futuras e ser descongelado, se problemas imprevistos posteriormente ocorrer durante o processo de fabricação. As células T são tipicamente colhidas em ou cerca do dia 28 de cultura (Figura 3) que expressam rotineiramente&gt; CAR de 90% e são&gt; 80% de viabilidade (Figura 2C e D). Nós já haviam demonstrado que, após quatro semanas de co-cultura sobre AAPC a média de expansão vezes maior de células T CD3 + é 19.800 ± 11.313 com CA<html> R expressão + sendo 90% ± 7,5 13. Estas células T são criopreservadas e sofrer em processo e testes de liberação que informa sobre a segurança e potencial terapêutico do produto fabricado. Testes de liberação é realizada em conformidade com as alterações laboratoriais clínicos de melhora (CLIA) para gerar um certificado de análise antes da infusão para destinatários em ensaios clínicos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figura 1. Passos delineando o processo de electroporate e propagar CAR + células T de PB e UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg / &quot;/&gt; Figura 2. Caracterização das células T geneticamente modificadas de PB. (A) A expressão de GFP no Dia 0 do ciclo de estimulação primeiro a avaliar a eficiência da transferência de genes. A expressão de CD19-specific CARRO (CD19RCD28), tal como avaliado por citometria de fluxo em células CD3 +, CD8 + e células T CD4 + em (B), aproximadamente, 24 horas após a electroporação e (C) 28 dias após a co-cultura em AAPC. Expressão semelhante da CAR foi observado com as células T derivadas de SCU. (D) Cinética de expressão CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figura 3. Propagação da PB-derived CAR+ T células Rate. De expansão numérica de células CD3 + e + CAR células T derivadas de PB repetido por co-cultura em γ-irradiada na presença de AAPC solúvel recombinante humano IL-2 e IL-21. Setas ascendentes indicam as adições de γ-irradiado AAPC que marcam o início de cada ciclo de estimulação. Células UCB derivado carro + T apresentam taxas semelhantes de expansão numérica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figura 4. Esquemática do processo de fabricação usando SB e sistemas AAPC modificar geneticamente e propagar CAR + células T derivadas de PB e UCB. CD19 específico CAR + células T foram geradas pela transferência de electro-SB-derivados plasmídeos de ADN super-enrolado e subsequente co-cultura em K562-derived AAPC (clone # 4), na presença of IL-2 humana recombinante solúvel e IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> A origem das células T </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> Infusão de células T </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> # IND </td></tr><tr><td> Autólogo (paciente derivado) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Depois de transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Alogênico (doador-derivada) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Após o transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Alogênico (doador-derivada) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Após o transplante alogênico de sangue de cordão umbilical </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabela 1. Os ensaios clínicos, sob os auspícios da FDA em MDACC para infundir CD19 específico CAR células T + propagado em AAPC. As células T são prestados específico para CD19 através da expressão forçada de SB transposon codifica para uma CAR 2 ª geração, CD19RCD28 designado, que os sinais através de CD28 e CD3-ε. ** Teste descrito na referência 5.

Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando o<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Sistema (SB) para introduzir CD19 específico CAR e propagação seletivo em designer de antígeno CD19 + células artificiais apresentando.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K visualizações.  U.T. MD Anderson Cancer Center. As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando o A Bela Adormecida Sistema (SB) para introduzir CD19 específico CAR e propagação seletivo em designer de antígeno CD19 + células artificiais apresentando.

Vídeo: Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood