Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Carl giugno (Università della Pennsylvania) per aiuto produzione, fornitura clone AAPC # 4 e il dottor Perry Hackett (University of Minnesota) per ottenere assistenza con il sistema SB. Concessione del sostegno: Cancer Center nucleo Grant (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), SPORE (CA136411); Albert J Ward Fondazione; Burroughs Wellcome Fondo; Gillson Longenbaugh Foundation; la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas; CLL Global Research Foundation, Dipartimento della Difesa, Tenuta di Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fondo per l&#39;immunoterapia leucemia, Institute of Cancer Therapy personalizzati, Leukemia and Lymphoma Society, Research Foundation linfoma; MDACC sorella di istituzione della rete Fondo; Miller Foundation, Mr. Herb Simons, il signor e la signora Joe H. Scales, il signor Thomas Scott, Fondazione Nazionale per la Ricerca sul Cancro; Pediatric Cancer Research Foundation; assistenza ed Produzionee per le terapie cellulari (PACT), William Lawrence e Fondazione Blanche Hughes bambini.

<html> Giorno 0 o Prima 1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da PB e UCB <ol><li> Diluire PB con un volume uguale, e UCB con quattro volumi di PBS-EDTA. </li><li> Lentamente sangue strato diluito (25 ml) sul Ficoll (12 ml) in una provetta da centrifuga da 50 ml (s) e centrifugare a 400 xg per 30 - 40 min (frenatura). </li><li> Raccogliere e trasferire la frazione di cellule mononucleate (interfaccia) con una pipetta di trasferimento in una nuova centrifuga tubo da 50 ml. </li><li> Portare il volume a 50 ml con PBS-EDTA e centrifugare a 450 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet (s) in 50 ml di mezzo di coltura completo (CCM), e centrifugare a 400 xg per 10 min. </li><li> Risospendere delicatamente e la piscina il pellet di cellule in CCM ed eseguire una conta delle cellule con il metodo di esclusione blu Trypan (Cellometer, programma PBMC). </li><li> MNC può ora essere utilizzato per elettroporazione (Nucleofection) o crioconservati per un uso futuro. </li></ol>titolo &quot;&gt; 2. Preparazione di cellule T per elettroporazione al giorno 0 <ol><li> Se si utilizza crioconservato MNC, scongelare rapidamente le cellule sufficienti per una elettroporazione fondo scala (2 x 10 8 aggiunta di ~ 20% per tenere conto di perdita di cellule durante la centrifugazione e 2 ore di incubazione) a 37 ° C bagnomaria. Se si utilizzano appena isolati MNC passare al punto 2.3. </li><li> Risospendere delicatamente e trasferire le cellule a un tubo da centrifuga di dimensioni adeguate (s) contenuta preriscaldata Complete Fenolo-Free coltura RPMI supporti (PF-RPMI) e centrifugare a 200 xg per 10 min (senza freno), sovranatante aspirato. </li><li> Risospendere il MNC in RPMI-PF, eseguire una conta cellulare (Cellometer) e trasferire le cellule a un recipiente di dimensioni adeguate coltura cellulare (s) ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li><li> Incubare in un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per 2 h ± 30 min. </li><li> Trasferire il MNC per provetta da centrifuga sterile (s), rotazione a 200 xg per 5 min (senza freni), aspirare il supernatante e delicatamente re-sospendere e combinare il pellet cellulare (s) in RPMI-PF. </li><li> Eseguire una conta cellulare (Cellometer) e calcolare il volume della sospensione cellulare richiesta (2 x 10 8 MNC). </li><li> Trasferire il volume calcolato per un tubo da 50 ml sterile da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 10 min (senza freno). </li><li> Aspirare il supernatante in modo che nessun media residua e delicatamente risospendere toccando lato del tubo. </li></ol> 3. Elettroporazione (Nucleofection) di MNC (Process Scala con 10 cuvette) il giorno 0 <ol><li> Pre-incubare a 12 sterile piastra con 10 pozzetti contenenti 4 ml di RPMI caldo PF-in un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore. </li><li> Preparare e pre-riscaldare la soluzione Lonza Nucleofector umano T Kit cella (ricostituito secondo le istruzioni del produttore, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) a temperatura ambiente in un cabinet sicurezza biologica (BSC). </li><li> Preparare la soluzione Nucleofector / master mix DNA adding 100 pl di soluzione integrata Nucleofector, 15 pg di trasposoni (DNA plasmidico superavvolto designato come CD19RCD28/pSBSO) e 5 pg di transposasi (DNA plasmidico superavvolto designato come pCMV-SB11) per reazione / cuvetta. </li><li> Disperdere il pellet di cellule (dal punto 2.8) battendo leggermente il lato della provetta da centrifuga e risospendere in Nucleofection soluzione / master mix di DNA (concentrazione finale cella: 2 x 10 7 cells/100 pl). </li><li> Cautela trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare (dal punto 3.4) a ciascuno dei dieci (10) Cuvette Nucleofection Lonza, facendo attenzione a evitare bolle. </li><li> Toccare la cuvetta una volta, e electroporate utilizzando il programma U-014 (per non stimolate le cellule T). </li><li> Trasferire le cuvette e dei 12 pozzetti (Fase 3.1) al BSC. </li><li> Raccogliere le cellule elettroporate da ciascuna cuvetta con una multa Amaxa pipetta punta, aggiungendo ~ 500 microlitri della pre-riscaldato terreno di coltura dal pozzetto corrispondente (12-pozzetti preparata in Step 3.1) e restituire la piastra ad un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per 2 h ± 30 min. </li><li> Seguendo il 2-h di incubazione, raccolto e trasferire le cellule da tutti i pozzetti in una provetta da centrifuga sterile. </li><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 140 xg per 8 min, temperatura ambiente, senza freno e aspirare ed eliminare il surnatante in modo che nessun residuo medio copre il pellet. </li><li> Disperdere il pellet cellulare delicatamente la parte della provetta da centrifuga e delicatamente risospendere in CCM per ottenere una sospensione di cellule singole. </li><li> Effettuare conteggio delle cellule e regolare la concentrazione cellulare a 10 6 cellule / ml in CCM. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare al pallone di coltura cellulare (s) e posto in incubatrice durante la notte. </li><li> Fasi di processo 2,1-3,8 sono state ripetute per controllo: EGFP cellule trasfettate (5 x 10 6 cellule / cuvetta con 5 pg Amaxa controllo EGFP plasmide superavvolto, pmaxGFP). </li></ol> 1 ° giorno del 1 ° e successiviStimolazione Cicli 4. Analisi di espressione CAR mediante citometria di flusso al giorno 1 <ol><li> Raccogliere le cellule elettroporate ed eseguire una conta di cellule utilizzando Trypan metodo di esclusione blu (emocitometro). </li><li> Colorazione (da 1 a 2 x 10 6) con anticorpi specifici per CD3, CD4, CD8, e umana IgG Fcy (come misura di espressione CAR). </li><li> Acquisire celle FACS Calibur e analizzare i dati utilizzando FCS software Express per calcolare espressione di CAR. <ol><li> Calcola le cellule + AUTO in coltura con la formula: (Numero di cellule vitali totali) x (AUTO% + cellule) = N. di CAR + cellule </li></ol></li></ol> 5. Preparazione di AAPC (clone # 4) al giorno 1. AAPC (clone # 4) sono stati derivati ​​da cellule K562 (linea parentale Ottenuto da American Type Culture Collection) di Co-express Desiderato cellule T Co-stimolatorio Molecule <ol><li> Scongelare una aliquota di congelati 100 AAPC Gy irradiato a 37 °, C acqua del bagno. </li><li> Le cellule vengono lavate due volte mediante centrifugazione a 400 xg, 10 min in CCM e contati utilizzando Cellometer (esclusione Trypan blu). </li><li> Calcolare il numero di AAPC vitali necessari per la stimolazione: (Numero di auto + cellule) x 2 = Numero di AAPC irradiato richiesta </li></ol> 6. AAPC-mediata stimolazione del CAR + cellule T al Day 1 Inizio del 1 ° e successivi cicli di stimolazione <ol><li> Mescolare le cellule esprimono elettroporate (CAR) e γ-irradiati AAPC (clone # 4) in un contenitore sterile con un rapporto di 1:2 (CAR + cella: vitale AAPC) in CCM. <ol><li> Si noti il rapporto AAPC è regolato per l&#39;espressione di CAR base citofluorimetria il giorno dopo l&#39;elettroporazione. </li></ol></li><li> Aggiungi IL-21 (30 ng / ml) alla sospensione cellulare. </li><li> Aliquotare in T-75 cm 2 pallone (s) e / o borse Vue Vita coltura ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml e tornare alla incubato. </li></ol> Giorni 3, 5 7. Cultura Continua CAR + cellule T <ol><li> Eseguire un mezzo-media cambiamento, ricostituire IL-21, e mantenere le cellule T ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li></ol> 7 ° giorno 8. Fine del primo AAPC-mediata ciclo di stimolazione <ol><li> Cellule Harvest, contare e colorare per CD3, CD4, CD8, e Fcy (CAR) e passare al punto 10.1. </li></ol> 9. L&#39;esaurimento delle cellule CD56 + (di solito tra 7 e 14 giorni dopo l&#39;elettroporazione) <ol><li> Eseguire un CD56 esaurimento utilizzando perline paramagnetiche se CD56 + CD3 linfociti neg ≥ 10%. </li></ol> Cicli di stimolazione # 2, # 3, # 4 e corrispondenti a Giorni 8 → 14, giorno 15 → 21, e giorni 22 → 28 10. L&#39;aggiunta ricorsiva di AAPC propagazione delle cellule T con i numeri clinicamente sufficienti <ol><li> Ripetere la stimulatioprocesso n (4 volte), come descritto nelle fasi 4,3-8,1. </li><li> Aggiungi IL-2 (50U/ml) alle culture che iniziano nei giorni 7, 14 e 21, e quindi ad ogni cambio dei media (tre volte alla settimana, su un Lunedi-Mercoledì-Venerdì orario). </li><li> Crioconservare (archivio), le cellule T in eccesso, se necessario. <ol><li> Le cellule T congelate utilizzando congelatore Pilotato dalla frequenza. </li></ol></li></ol> Giorno 28 11. Fine Ultimo AAPC-mediata del ciclo di stimolazione: cellule T Harvest <ol><li> Crioconservare le cellule T per il test di rilascio e infusione. </li></ol>

<ol>
	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Trasposone e sistemi trasposasi, come da piggyBac 12,19 e 18,20-22 SB, sono non-virali approcci alla terapia genica che sono un&#39;alternativa al virale mediata trasduzione di grado clinico CAR + cellule T. La SB è stato scelto come il sistema di trasferimento genico basato sul suo potenziale per la terapia genica umana 1,6,23. Abbiamo sviluppato le tecnologie duali di trasposizione SB (introdurre un CAR) e aggiunta ricorsiva di γ-irradiati AAPC (per recuperare geneticamente modificati cellule T che esprimono stabilmente un CAR) per servire come tecnologie di piattaforma per la fabbricazione di TAA-specifiche cellule T in conformità con cGMP per la fase I / II (Figura 4). Dopo 28 giorni (quattro-sette giorni cicli di stimolazione) di co-coltura su γ-irradiati AAPC, ci sono tipicamente in grado di generare almeno ~ 10 10 cellule geneticamente modificate T adatto per applicazioni umane. Se necessario, ulteriori cicli di stimolazione può essere intrapresa to generare un maggior numero di cellule T geneticamente modificate. Inoltre, se meno CAR + cellule T sono necessari, l&#39;approccio alla elettroporazione e propagazione può essere ridotto impiegando meno cuvette e riporto solo un sottoinsieme delle cellule T espanse numericamente per successivi cicli di proliferazione AAPC all&#39;inizio di ciascun Stimolazione ciclo. La maggior parte dei elettroporate e propagato cellule T raccolte per infusione esprimono stabilmente il CAR. La conseguenza di CD4 + e CD8 + cellule T che esprimono il nostro 2 AUTO di seconda generazione includono cellule con una memoria / ingenuo fenotipo e presentano tre caratteristiche di ri-diretto specificità. In primo luogo, le cellule T geneticamente modificate appositamente lisare CD19 + obiettivi, in secondo luogo, produrre IFN-γ in risposta a CD19 + cellule stimolatrici e in terzo luogo, proliferano in risposta a CD19 + cellule di alimentazione, il tutto in un CAR-dipendente 13,18. Il nostro approccio alla integrmangiato un transgene CAR per elettro-trasferimento non virali plasmidi di DNA dal sistema SB può essere intrapresa in cellule T quiescenti primarie derivate da PB e UCB. Noi e altri hanno modificato geneticamente cellule K562 per servire come AAPC per diffondere in modo efficiente i numeri clinicamente sufficiente di cellule T per infusione 24,25. Il AAPC e cultura ambiente tissutale (ad esempio l&#39;aggiunta di IL-21) sono stati sono stati modificati per generare paziente e donatore-CD19-derivato cellule T specifiche per infusione dopo cellule staminali ematopoietiche trapianto (Tabella 1) 13,18. Possiamo produrre CAR + cellule T dei PB semplicemente prelevati da una vena che evita il costo, il disagio, e l&#39;inconveniente di ottenere MNC da PB mediante aferesi. La possibilità di ricavare un gran numero di CAR + cellule T di un numero limitato di MNC è particolarmente interessante per l&#39;infusione delle cellule T dopo trapianto allogenico UCB. Le piccole dimensioni e l&#39;anonimato del donatore neonatale osta re-Accesso a questa persona in un punto secondo momento e solo un numero limitato di MNC raccolte sono disponibili come materiale di partenza per la produzione delle cellule T per evitare interferenze con ematopoiesi. Ulteriori progressi del processo di fabbricazione sono in corso di includere un dispositivo ad alta velocità elettroporazione accoppiato con un bioreattore WAVE completamente chiusa per ridurre al minimo la movimentazione. In totale, la SB e AAPC si appellano piattaforme per generare CD19-specifica CAR + cellule T che possono essere adattati per generare un gran numero di cellule T geneticamente modificate in grado di riconoscere alternative superficie cellulare TAA in conformità alle cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> DNA che esprimono GFP plasmide (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolo gratuita RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone siero fetale bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Umana ricombinante IL-21 </td><td> Peprotech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Umana ricombinante IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Umano delle cellule T Kit (Soluzione Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reagente </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-coniugato con il mouse mAb specifiche per l&#39;uomo CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-topo coniugato a mAb specifici per CD4 umano </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-coniugatoal mouse mAb CD8 specifiche per l&#39;uomo </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-coniugato a F (ab &#39;) 2 di capra frammento di anticorpo specifico per Fcy umana </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Monouso </td></tr><tr><td> 12-pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 matraccio </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura borse </td><td> Vue Vita </td><td> 290C, 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml centrifuga tubo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Attrezzatura </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Vision Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legenda RT Centrifuga </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Tasso congelatore controllata </td><td> Pialla </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS bio internazionale </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> L&#39;espressione di molecole (endogena e Introdotto) </td></tr><tr><td> Linea cellulare </td> &lt;td&gt; Nome comune </td><td> Tipo di cella </td><td> Molecole espresse </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-espresso con membrana legato IL-15 </td></tr></tbody></table> Terreni di coltura completi (CCM) (conservati a 4 ° C per un massimo di 30 giorni) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% glutamax Flusso Buffer Citometria (conservati a 4 ° C per un massimo di 30 giorni) PBS 2% FBS 0,1% sodio azide </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

La potenza della clinica-grade cellule T può essere migliorata combinando la terapia genica con immunoterapia per ingegnerizzare un prodotto biologico con il potenziale per superiore (i) riconoscimento di antigeni tumore-associati (TAA), (ii) dopo infusione persistenza, (iii) possibilità di migrazione ai siti tumorali, e (iv) capacità di riciclare le funzioni effettrici nel microambiente tumorale. Maggior approcci alla manipolazione genetica di cellule T ingegnerizzate all&#39;applicazione umana hanno usato retrovirus e lentivirus per l&#39;espressione stabile di CAR 1-3. Questo approccio, anche se compatibile con le attuali buone prassi di fabbricazione (GMP), può essere costoso in quanto si basa sulla produzione e il rilascio di clinica-grade virus ricombinante da un numero limitato di impianti di produzione. L&#39;elettro-trasferimento di plasmidi virali è un&#39;alternativa interessante per trasduzione poiché specie di DNA possono essere prodotti a grado clinico a circa 1/10 di costo di recombinant GMP-grade virus. Per migliorare l&#39;efficienza di integrazione abbiamo adattato Sleeping Beauty (SB) trasposone e trasposasi per l&#39;uomo 4-8 applicazioni. Il nostro sistema SB utilizza due plasmidi che consistono di un trasposone codificante per un gene di interesse (ad esempio, 2 nd generazione CD19-specifico transgene CAR, designato CD19RCD28) e una trasposasi (es. SB11) che inserisce il transgene nel dinucleotide TA ripete 9-11 . Per generare numeri clinicamente sufficiente di cellule T geneticamente modificate usiamo K562 cellule derivate artificiali presentanti antigene (AAPC) (clone # 4) modificate per esprimere una TAA (es. CD19) nonché le cellule T molecole costimolatorie CD86, CD137L, un legato alla membrana versione di interleuchina (IL) -15 (peptide fuso modified IgG4 regione Fc) e CD64 (recettore Fc γ-1) per il caricamento di anticorpi monoclonali (mAb) 12. In questo rapporto, dimostriamo le procedure che possono essere intraprese in compliance con cGMP per generare CD19-specifica CAR + cellule T adatto per l&#39;applicazione sull&#39;uomo. Questo è stato ottenuto il sincrono elettro-trasferimento di due plasmidi, un trasposone SB (CD19RCD28) e una trasposasi SB (SB11) seguite da recupero di integranti stabili dai ogni-7-giorni aggiunte (ciclo di stimolazione) di γ-irradiati AAPC (clone # 4) in presenza di solubile IL-2 ricombinante umana e IL-21 13. Tipicamente 4 cicli (28 giorni di coltura continua) sono impegnati a generare numeri clinicamente interessanti di cellule T che esprimono stabilmente il CAR. Questa metodologia di produzione clinico-grado CD19-specifiche cellule T possono essere applicati a cellule T derivate da sangue periferico (PB) o sangue del cordone ombelicale (UCB). Inoltre, questo approccio può essere sfruttata per generare cellule T per diversi tipi di tumore con l&#39;associazione la specificità del CAR introdotto con l&#39;espressione del TAA, riconosciuto dal CAR, sulla AAPC.

Si segnala che elettro-trasferimento di plasmidi di DNA e propagazione di cellule T su γ-irradiati AAPC può essere utilizzato per generare numeri clinicamente interessanti di cellule T derivate da PB e UCB per applicazioni umane. Queste cellule geneticamente modificate T esprimere un CAR introdotto che riconosce il TAA CD19, indipendente complesso maggiore di istocompatibilità. L&#39;SB-derivati ​​plasmidi DNA per esprimere il (i) trasposone, un CAR generazione 2 ° (CD19RCD28) che i segnali attraverso CD28 e CD3-ε 14, e (ii) trasposasi, SB11 15, sono stati descritti in precedenza 13, 16,17 . I plasmidi utilizzati in questo studio sono stati prodotti commercialmente da Fondo Biomanufacturing Waisman Clinica (Madison, WI). Il AAPC (clone # 4), derivato da cellule K562 (linea parentale ottenuto da American Type Culture Collection), co-esprimono desiderato cellule T molecole co-stimolatorie (ogni molecola introdotta 3 90% sulla superficie cellulare di AAPC),come precedentemente descritto 12. Qui mostriamo che CD19-specifiche cellule T possono essere generati da cellule mononucleate (MNC) derivati ​​da PB o UCB utilizzando trasposizione SB per introdurre il CAR seguita da aggiunta di AAPC numericamente per espandere le cellule T in un modo dipendente CAR (figure 1 , 4) 13,18. Dieci cuvette (2x10 7 MNC / cuvetta) sono elettroporata per ciascun destinatario usando 15 pg di DNA plasmidico (CD19RCD28/pSBSO) codificante per trasposoni (CAR) e 5 mg di DNA plasmidico (pCMV-SB11) codificante per transposasi (SB11). Il numero di cuvette può essere ridotto se MNC stanno limitando o ridimensionato per il lavoro di laboratorio. Il giorno di elettroporazione è definito come &quot;0 Day&quot; del ciclo di stimolazione # 1. Come controlli per citometria di flusso e condizioni di coltura, cellule T autologhe sono finto elettroporata (senza DNA plasmidico) e numericamente esteso su γ-irradiati AAPC (clone # 4) che erano stati pre-caricato con OKT3 per reticolare CD3 per sostenere cellule T proliferazione. We routinely valutare l&#39;efficienza di electrotransfer e la vitalità delle cellule T il giorno dopo l&#39;elettroporazione (Figura 2B). L&#39;espressione di EGFP dal DNA plasmide di controllo (designato pmaxGFP) e CAR, a questo punto tempo iniziale riflette l&#39;espressione della proteina dal plasmide integrato e episomale. In genere, il giorno dopo l&#39;elettroporazione si misura l&#39;espressione EGFP a ~ espressione 60% ​​e CAR al ~ 40% (Figura 2A) con la vitalità delle cellule T tra il 40-50%. Aggiunte ricorsive di γ-irradiati AAPC in presenza di solubile IL-2 ricombinante umana e IL-21 recuperare le cellule T che esprimono stabilmente CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + cellule NK sono esaurite dalla coltura mediante CD56-specifici perline paramagnetiche se la percentuale di queste cellule NK è ≥ 10% e soprattutto se la percentuale di CAR espresso sulle cellule T è bassa. Questo impedisce l&#39;esaurimento rapida crescita eccessiva di cellule NK che interferisce con la capacità di sostenere il AAPC proliferation di CAR + cellule T. In occasione, deplezione delle cellule NK da auto + cellule T è effettuato nel corso degli ultimi due cicli di stimolazione, ma questo introduce una perdita di cellule desiderate a causa di co-espressione di CD56 su alcuni CAR + cellule T. Le cellule T sono state coltivate in un sistema funzionalmente chiuso con Vue borse cultura della vita passata Giorno 14. Un sottoinsieme delle cellule geneticamente modificate e propagato T sono in genere crioconservati al giorno 14 o il giorno 21 (fine dei cicli di stimolazione # 2 o # 3) di co-coltura su AAPC per servire come fonte di materiale d&#39;archivio per future analisi e di essere scongelati in caso di problemi imprevisti in seguito si verificano durante il processo di fabbricazione. Le cellule T sono in genere raccolti il o intorno al giorno 28 di cultura (Figura 3) che normalmente esprimono AUTO&gt; 90% e sono&gt; 80% vitali (Figura 2C, D). Abbiamo precedentemente dimostrato che, dopo quattro settimane di co-coltura in AAPC media piega-espansione delle cellule T CD3 + è 19.800 ± 11.313 con CA<html> R espressione + essendo il 90% ± 7.5 13. Queste cellule T vengono crioconservati e sottoposti in-process e il rilascio di prodotti che informa sulla sicurezza e l&#39;efficacia terapeutica del prodotto finito. Test di rilascio è effettuato in conformità alle modifiche Clinical Laboratory Improvement (CLIA) per generare un certificato di analisi prima dell&#39;infusione in riceventi sulle sperimentazioni cliniche. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figura 1. Passaggi che delineano il processo di electroporate e propagare CAR + cellule T da PB e UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Caratterizzazione delle cellule T geneticamente modificate da PB. (A) Espressione di EGFP al giorno 0 del ciclo di stimolazione primi a valutare l&#39;efficienza di trasferimento genico. L&#39;espressione di CD19-specifica CAR (CD19RCD28) valutata mediante citometria a flusso su CD3 +, CD8 + e cellule T CD4 + a (B) circa 24 ore dopo l&#39;elettroporazione e (C) 28 giorni dopo la co-coltura su AAPC. Espressione simile di CAR è stato osservato con UCB cellule derivate T. (D) Cinetica di espressione CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figura 3. Propagazione della PB-derivato CAR+ T cellule. Tasso di espansione numerica di CD3 + e + CAR cellule T derivate da PB da ripetute co-coltura su γ-irradiati AAPC in presenza di ricombinante umano solubile IL-2 e IL-21. Le frecce verso l&#39;alto indicano le aggiunte di γ-irradiati AAPC che segnano l&#39;inizio di ogni ciclo di stimolazione. UCB di derivazione CAR + cellule T mostrano tassi simili di espansione numerica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figura 4. Schema del processo di fabbricazione con SB e sistemi AAPC di modificare geneticamente e propagare CAR + cellule T derivate da PB e UCB. CD19-specifica CAR + cellule T sono state generate da elettro-trasferimento di SB-derivati ​​plasmidi DNA superavvolto e successive co-coltura il K562-derived AAPC (clone # 4) in presenza of IL-2 ricombinante umana solubile e IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> Cella sorgente T </td><td width="9"> Trasposone * </td><td width="9"> Trasposasi </td><td width="26"> Cellule T infusione </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologo (paziente-derivato) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto autologo di cellule staminali ematopoietiche trapianto </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allogenico (donatore-derivati) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche trapianto </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allogenico (donatore-derivati) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto allogenico di sangue del cordone ombelicale </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabella 1. Gli studi clinici sotto l&#39;egida della FDA a MDACC di infondere CD19-cellule T specifiche CAR + propagate su AAPC. Le cellule T sono resi specifici per CD19 attraverso l&#39;espressione forzata di SB trasposone che codifica per una CAR 2 ° generazione, CD19RCD28 designato, che i segnali attraverso il CD28 e CD3-ε. ** Prova descritto in riferimento 5.

Watch this Scientific Journal Video about Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood at JoVE

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Cellule T CD19-che esprimono un recettore chimerico specifico antigene (CAR) sono infusi come trattamento sperimentale di tumori maligni delle cellule B nelle nostre prove gene first-in-umani terapia. Descriviamo modificazione genetica delle cellule T con il<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; (SB) sistema per introdurre CD19-specifica CAR e la propagazione selettiva su cellule antigene CD19 Designer + artificiali che presentano.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K Views.  U.T. MD Anderson Cancer Center. Cellule T CD19-che esprimono un recettore chimerico specifico antigene (CAR) sono infusi come trattamento sperimentale di tumori maligni delle cellule B nelle nostre prove gene first-in-umani terapia. Descriviamo modificazione genetica delle cellule T con il Bella Addormentata (SB) sistema per introdurre CD19-specifica CAR e la propagazione selettiva su cellule antigene CD19 Designer + artificiali che presentano.

Video: Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood