وأيد هذا البحث من قبل منحة 1K01DK079019A2 (PT) من المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK.

1. البكتيريا التحضير للتلقيح ماوس يجب القيام بما يلي في ظل ظروف معقمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ واحدة 17 × 100 ملم أنابيب البولي بروبلين مع قبعات وإضافة 3 مل من وسائل الإعلام لوريا الطازجة (LB) مرق. نصائح باستخدام تعقيمها، واتخاذ بعض البكتيريا الجلسرين المجمدة الأسهم من سلالة CP1 2 و نقل كمية صغيرة من الثقافة في أنبوب يحتوي على سائل الإعلام LB. استبدال غطاء أنبوب الأوكسجين بحيث لا يزال قادرا على إدخال الأنبوب - الثقافة تحتاج إلى أن تنمو في الظروف الهوائية. أنبوب المكان عند 37 درجة مئوية في حاضنة في 220 دورة في الدقيقة تهتز بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، نقل 5 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب جديد مع 3 مل سائل الإعلام LB وتنمو في ظل ظروف ثابتة في ليلة وضحاها في حاضنة C. ° 37 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم 3 نقل 40 ميكرولتر من الثقافة في أنبوب 50 مل AA يحتوي على 40 مل كل وسائل الإعلام LB. مكان بين عشية وضحاها في 37 ° C حاضنة ثابت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل أجهزة الطرد المركزي وتعيين لC. ° 4مرة واحدة وصلت درجة الحرارة الطرد المركزي النهائي، ونقل كل ثقافة 40 مل في أنبوب الطرد المركزي 40 مل Nalgene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن أنابيب الطرد المركزي لتحقيق التوازن - ضبط مستوى الصوت مع وسائل الاعلام LB حسب الحاجة. تدور أنابيب في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف بيليه وتعليق بلطف البكتيرية في 40 مل العقيمة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.5 مع PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة طاف ووقف البكتيريا في PBS العقيمة 500 ميكرولتر. نقل الحل في أنبوب 1.5 مل microfuge. يستغرق 10 ميكرولتر من التعليق وتخفيف سنة 990 ميكرولتر من الجليد الباردة PBS. استخدام الطيف لقراءة OD 420 نانومتر لتحديد حجم اللازمة لتلقيح. لتحديد حجم مناسب من الجليد الباردة PBS تعليق بيليه في: خذ 420 نانومتر OD عدد (في مل) وطرح الحجم المقدر للالسابقين البكتيرية [بيليه. OD 420 نانومتر = 0،545، 0،075 بيليه تقريبا مل. 0،545 حتي 0،075 0،470 =]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من التعليق البكتيرية وديالعود سنة 990 PBS الجليد الباردة ميكرولتر. قراءة OD 420 نانومتر. والهدف من ذلك هو تحقيق نانومتر 420 OD قيمة لتعليق مخفف من 1،000 ± 0،010. إذا كان عدد تخفيف الخاص بك هو أعلى من هذا الهدف، إضافة المزيد من الحجم إلى تعليق واتخاذ آخر القراءة. إذا كان الرقم أقل من 0.990 تدور ثم أسفل التعليق وتكرار القراءة OD 420 نانومتر حتى الحصول على القراءة المطلوبة. </li></ol> 2. عدوى الحيوان تم شراء الفئران (5 إلى 7 أسابيع من العمر، وعشرة في كل مجموعة) من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران هي تخدير عن طريق الاستنشاق من 1-4٪ isoflurane في غرفة زجاجي ويتم رصد حتى راقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم أخذ الماوس واحد في وقت واحد لتقطير من البكتيريا عن طريق قسطرة مع البولي ايثيلين (PE10) قسطرة إبرة مثبتة في تعديل G 30 من حقنة هاميلتون الزجاج (طول 1،5-2،0 سم). يتم إدراج قسطرة لمحور الإبرة. الماوس هو PLACإد على سطحه الظهري تحت التخدير الحفاظ باستخدام مخروط الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضيب من الفأرة هو مقذوف من ضغط لطيف وكميات من مواد التشحيم ليبرالية على مسحات القطن يستخدم لتزييت مدخل مجرى البول القضيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة هو عرض تحتوي على 1 × 10 8 البكتيريا إلى مجرى البول من الفئران تخدير بعد القسطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الاحتفاظ الفئران في حالة تخدير لمدة 15 دقيقة في غرفة زجاجي بعد إدخال البكتيرية للسماح التصاق البكتيريا ومنع التبول على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع الفئران في أقفاص مرة أخرى ورصد للساعة ال 24 المقبلة. </li></ol> 3. اختبار السلوك تم اختبار الفئران قبل الإصابة (خط الأساس) وعلى أيام 3 و 7 و 14 و 21 و 28 بعد الإصابة. تم اختبار فرط التألم المشار آلام جلدية واللمس باستخدام خيوط فري فون تطبيقها على البطن وص 11،12 أخمصيegion من مخلب هند 13. وكان perfomed اختبار في وقت محدد من اليوم، يعمل منهجية موحدة واحدة اختبار مجرب من جميع الحيوانات. واستخدم اختبار أعمى من مجموعات لمكافحة القيود المفروضة على السلوك القائم على اختبار الألم في النماذج الحيوانية. تم حساب طبقت خمس الفردية فون خيوط فراي مع قوات تبلغ 0.04، 0.16، 0.4، 1.0 و 4.0 غرام (Stoelting، الولايات المتحدة الأمريكية) في البطن وتكرار الردود الانسحاب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة من التأقلم و 30 دقيقة، يتم وضع الفئران في غرف فردية زجاجي (6 × 10 سم X12) المحرز في منزل مع الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة الطابق السلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم اختبار فرط التألم المشار آلام جلدية واللمس باستخدام الخمسة فون خيوط فراي. تم تطبيق كل خيوط لثانية 1-2 مع فاصل زمني بين التحفيز من 5 ثوانى للمرة 10 المجموع، تم اختبار والشعر بترتيب تصاعدي القوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تطبيق كل خيوط لمنطقة أسفل البطن في المنطقة المحيطة في البروستاتا وكان هناك حرص على تحفيز مناطق مختلفة داخل هذه المنطقة لتجنب الحساسية أو &quot;يختتم&quot; الآثار. تم تطبيق النظام في زيادة خيوط القوة لفترات ثانية 1-2 مع لا يقل عن 5 ثوانى بين التحفيز ليصبح المجموع 10 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعتبر ثلاثة أنواع من السلوك ردا ايجابيا على تحفيز خيوط: 1) تراجع حاد في البطن. 2) لعق أو الخدش الفوري للمنطقة من التحفيز خيوط، 3) القفز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم حساب تواتر استجابة بأنه النسبة المئوية للاستجابة الإيجابية (من أصل 10، على سبيل المثال 5 ردود 10٪ 50 =) وأفيد البيانات في نسبة متوسط ​​تردد استجابة ± SE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استبعاد الحيوانات مع أكثر من 25 ردود إيجابية من إجمالي خط الأساس للدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم اختبار اللمس آلام جلدية على المنطقة الأخمصية للهند مخلب باستخدام خيوط فري فون مع قوات تبلغ 0.04، 0.16، 0.4، 1.0 و ز 4.0. تم تقييم متوسط ​​عتبة انسحاب 50٪ (5) باستخدام أعلى إلى أسفلتطبيق طريقة الاختبار حيث بدأت خيوط مع 0،04 ز عموديا على السطح الأخمصي للهند مخلب حتى خيوط تميل قليلا. تم اختبار خيوط بترتيب تصاعدي حتى لوحظ وجود استجابة إيجابية. وعرف استجابة إيجابية للخيوط والانسحاب إما حادة أو مخلب من لعق مخلب من الاختبار. عندما تم تسجيل استجابة إيجابية تم تطبيق خيوط أضعف المقبل، وإذا لوحظ وجود استجابة سلبية، ثم تم تطبيق خيوط أقوى المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم استعراض التجارب والمنهجية الموصوفة والتي وافقت عليها جامعة الحيوانية نورث وسترن الرعاية واستخدام اللجنة. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+uropathogenic+Escherichia+coli.">Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli.</a> Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).</li><li>Rudick, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uropathogenic+Escherichia+coli+induces+chronic+pelvic+pain.">Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain.</a> Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).</li><li>Pontari, M. A., Ruggieri, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+in+prostatitis/chronic+pelvic+pain+syndrome.">Mechanisms in prostatitis/chronic pelvic pain syndrome.</a> The Journal of urology. 172, 839-845 (2004).</li><li>Schaeffer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Chronic+prostatitis+and+the+chronic+pelvic+pain+syndrome.">Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome.</a> The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).</li><li>Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+prostatitis+induces+chronic+pelvic+pain.+American+journal+of+physiology.">Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology.</a> Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).</li><li>Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+acute+bacterial+prostatitis+in+genetically+distinct+inbred+strains.">Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains.</a> Urology. 66, 883-887 (2005).</li><li>Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+type+1+pili+and+effects+of+phase+variation+on+lower+urinary+tract+infections+produced+by+Escherichia+coli.">Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).</li><li>Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bedside+testing+for+chronic+pelvic+pain:+discriminating+visceral+from+somatic+pain.">Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain.</a> Pain research and treatment. 2011, 692102 (2011).</li><li>Jarrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+Cutaneous+Allodynia+in+Association+with+Chronic+Pelvic+Pain.">Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain.</a> J. Vis. Exp. (28), e1232 (2009).</li><li>Giamberardino, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscero-visceral+hyperalgesia:+characterization+in+different+clinical+models.">Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models.</a> Pain. 151, 307-322 (2010).</li><li>Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+visceral+pain+and+referred+hyperalgesia+in+the+mouse.">A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse.</a> Pain. 92, 335-342 (2001).</li><li>Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+visceral+pain+and+referred+hyperalgesia+in+Nav1.8+(SNS/PN3)-null+mice.">Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice.</a> J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).</li><li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw.">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).</li><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+inflammation+of+the+mouse+prostate.">Acute bacterial inflammation of the mouse prostate.</a> The Prostate. 72, 307-317 (2012).</li><li>Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-obese+diabetic+(NOD)+mice+are+genetically+susceptible+to+experimental+autoimmune+prostatitis+(EAP).">Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP).</a> Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).</li><li>Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testosterone+replacement+therapy+induces+spermatogenesis+and+partially+restores+fertility+in+luteinizing+hormone+receptor+knockout+mice.">Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice.</a> Endocrinology. 146, 596-606 (2005).</li><li>Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+prostatitis+after+neonatal+thymectomy+in+the+mouse.">Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse.</a> Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التهاب في البروستاتا مع الماوس UPEC يسمح للفي النمذجة الجسم الحي من الأحداث التي قد تكون لهم علاقة في التسبب في التهاب البروستاتا الجرثومي، CP / CPPS أو كحدث المهيئة في الالتهابات المزمنة. الأساليب المذكورة لإعداد البكتيرية وتقطير التعادل على مجموعة كبيرة من ال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> ثقافة أنابيب </td><td> BD الصقر </td><td> 352059 </td></tr><tr><td> LB مرق ميلر </td><td> EMD </td><td> EM1.10285.0500 </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي Nalgene </td><td> الحرارية </td><td> 3118-0050 </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> بتلر شين </td><td> NDC 11695-6776-1 </td></tr><tr><td> قسطرة إبرة 30G </td><td> هاميلتون </td><td> 91030 </td></tr><tr><td> PE10 أنابيب </td><td> BD intramedic </td><td> 427400 </td></tr><tr><td> فري فون الشعيرات </td><td> Stoelting </td><td> 58025-31 </td></tr></tbody></table>

measurement of tactile allodynia in a murine model of bacterial prostatitis

Uropathogenic الإشريكية القولونية (UPEC) هي مسببات الأمراض التي تلعب دورا هاما في التهابات المسالك البولية والتهاب البروستاتا الجرثومي 1. لقد أظهرنا مؤخرا أن UPEC دورا هاما في بدء الألم الحوضي المزمن 2، سمة من سمات التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / CPPS) 3،4. يمكن للعدوى في البروستاتا بواسطة UPEC ذات الصلة سريريا بدء وتأسيس الألم المزمن من خلال آليات التي قد تنطوي على تلف الأنسجة والشروع في آليات المناعة الذاتية 5. وثمة تحد لفهم الآلية المرضية لUPEC في البروستاتا هو عدم إمكانية الوصول النسبي للغدة البروستاتا للتلاعب. تستخدم لدينا سبق وصفها طريقة العدوى داخل الاحليل 6 إلى تقديم سلالة من UPEC السريرية في الفئران الذكور تؤسس عدوى الصاعد من البروستاتا. هنا، نحن تصف بروتوكولات لدينا لتوحيد باcterial اللقاح 7 فضلا عن إجراء القسطرة لتخدير الفئران الذكور تقطير من البكتيريا. ويتميز في المقام الأول CP / CPPS عن وجود آلام جلدية اللمس 4. واستند اختبار السلوك على مفهوم فرط التألم الجلدية الناجمة عن الألم الحشوي المشار 8-10. التركيز في الأنسجة الحشوية العصبي يقلل الألم الجلدي عتبات السماح للاستجابة للمؤثرات مبالغ فيها غير مؤلمة عادة (آلام جلدية). استخدام القوة الطبيعي أن الجلد نتيجة في الاستجابات الشاذة التي تميل إلى الزيادة مع شدة الألم الحشوي الأساسي. وصفنا المنهجية في NOD / ShiLtJ الفئران التي تستخدم الألياف فري فون لقياس آلام جلدية مع مرور الوقت عن طريق اللمس استجابة لعدوى البكتيريا واحدة مع UPEC.

<html> درسنا NOD / ShiLtj وC57BL/6J ذكور الفئران لوجود الألم المزمن على عدوى بكتيرية. وتغرس الفئران الذكور (5 إلى 7 أسابيع من العمر) بمحلول ملحي أو البكتيريا في مجرى البول (الشكل 1). أدى التحفيز الميكانيكي للمنطقة الحوض مع خيوط فري فون من الفئران C57BL/6J المالحة وغرست UPEC الفئر?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis at JoVE.com

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

قد عدوى في البروستاتا يكون عاملا مساعدا في التوسط في آلام الحوض التهاب البروستات المزمن. وصفنا الإجراء لإعداد اللقاح البكتيري موحدة، تقطير من البكتيريا في مجرى البول من الفئران الذكور ومنهجية لقياس آلام جلدية في الفئران عن طريق اللمس مع مرور الوقت.

قياس آلام جلدية اللمس في نموذج الفئران التهاب البروستاتا الجرثومي

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

measurement-tactile-allodynia-murine-model-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Views.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. قد عدوى في البروستاتا يكون عاملا مساعدا في التوسط في آلام الحوض التهاب البروستات المزمن. وصفنا الإجراء لإعداد اللقاح البكتيري موحدة، تقطير من البكتيريا في مجرى البول من الفئران الذكور ومنهجية لقياس آلام جلدية في الفئران عن طريق اللمس مع مرور الوقت.

Video: Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

في فيفو تصوير للأنواع الأكسجين التفاعلية في الفاري الجرح النموذجي

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

عزل واحد المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا التي تم إنشاؤها من نموذج موريني لعدوى المسالك البولية لتحليل خلية واحدة أسفل المجرى

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, murine models of co-infection have been the primary tool developed to explore the pathologies of both the primary and secondary infections. Despite the prevalence of this model, considerable discrepancies regarding instillation procedures, dose volumes, and efficacies are prevalent among studies. Furthermore, these efforts have been largely incomplete in addressing how the pathogen may be directly influencing disease progression post-infection. Herein we provide a precise method of pathogen delivery, recovery, and analysis to be used in murine models of secondary bacterial pneumonia. We demonstrate that intratracheal instillation enables an efficient and accurate delivery of controlled volumes directly and evenly into the lower respiratory tract. Lungs can be excised to recover and quantify the pathogen burden. Following excision of the infected lungs, we describe a method to extract high quality pathogen RNA for subsequent transcriptional analysis. This procedure benefits from being a non-surgical method of delivery without the use of specialized laboratory equipment and provides a reproducible strategy to investigate pathogen contributions to secondary bacterial pneumonia.

Here, we present methods to improve secondary bacterial pneumonia studies by providing a non-invasive route of instillation into the lower respiratory tract followed by pathogen recovery and transcript analysis. These procedures are reproducible and can be performed without specialized equipment such as cannulas, guide wires, or fiber optic cables.

نظام دقيق لإيصال مسببات الأمراض واستعادتها لنماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

قياس سرعة انتشار النبض، وقابلية التشتت والسلالة في نموذج الماوس الأبهري البطني

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

تصور المقاومة البكتيرية باستخدام تحقيقات المضادات الحيوية الفلورية

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

نموذج تصوير حديثي الولادة من تعفن الدم البكتيري السلبي للجرام

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...