فإن الكتاب أود أن أشكر ايلينا Lomakina، Bauserman ريتشارد، يانغمان مارغريت، فاكنين شاي، جيسيكا سنايدر، Striemer كريس، ناتاراج ناكول، هونغ تشونغ لى، Khire تيجاس، ولام اريك لمساعدتهم في هذا المشروع. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة # 018208 PO1 HL.

1. طرق 1،1 غرفة تدفق خلية تم بناء غرفة تدفق A، كما هو موضح في الشكل رقم 1، بحيث يمكن أن تنمو الخلايا تحت القص من 1.0 باسكال (10 DYN / سم 2) ونقل بعد ذلك مباشرة إلى اللجوء MFP3D AFM (سانتا باربارا، CA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أعدت غرفة تدفق للتجربة عن طريق تنظيف لأول مرة الشرائح الزجاجية في حل البيرانا (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) لمدة 15 دقيقة ثم غسل ولهم الماء المقطر. وبعد ذلك إلى خبز جاف والمغلفة مع triethoxy أمينو سيلاني (APTES) في فراغ غرفة الترسيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما قطع طوقا سيليكون باستخدام أداة قطع SD صورة ظلية. هذا سمح لنا للسيطرة على أبعاد الغرفة ناعما تدفق للسيطرة على معدل التدفق وإجهاد القص خلال نمو الخلايا. عادة، وقطعت قناة 6.4 ملم 19 ملم واسعة من قبل فترة طويلة من ورقة من السيليكون ملم 0.4. معدل التدفق اللازمة لأجناسالشركة المصرية للاتصالات ليتم احتساب إجهاد القص من 1.0 باسكال (10 DYN / سم 2) على افتراض تدفق الصفحي في قناة مستطيلة مع المعادلة: </li></ol><img alt="المعادلة 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> حيث Q هي معدل التدفق، τ هو إجهاد القص، μ هو لزوجة المتوسط، يفترض هنا هي 1.0 ميجا باسكال (0.01 * DYN ثانية / سم 2)، H ارتفاع وث هو العرض للغرفة تدفق . <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم محاذاة قطعة الأعلى للغرفة مع تدفق حشية في الخلية طبق الثقافة وتأمين مع عصابة المغناطيسي. وقد شغل الجمعية مع ايزوبروبيل (IPA) لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تجميعها في نظام التدفق الكامل. تم ربط المنافذ تدفق في الخلية طبق الثقافة لثلاثي الصمامات. تم توصيل الصمامات لفتح 30 حقنة ملق. تم مسح IPA من خلال النظام الذي كان يغسل بعد ذلك مع 30 مل من المتوسط ​​مكوي مع 4٪ مصل العجل الجنين (FCS). وقد شغل ثم النظام مع 20 مل من المتوسط ​​تكنولوجيز المزيد نمو الخلايا. وضعت أغطية على قمم من الحقن. كان غطاء خزان الحقنة الصيد إبرة في المكان لنقل متوسطة عودة إلى خزان تغذية. كانت تعلق العقيمة مرشحات ميكرون 0.2 إلى مداخل الهواء في أغطية لمنع تلوث النظام. كان غرفة جاهزة للتدفق ثم بذر الخلية. </li></ol> 1،2 خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم شراء خلايا بطانة الأوعية الدموية الوريد السري (في HUVEC) والمتوسطة النمو من تقنيات المزيد (رينسيلار، NY) ونمت لالتقاء في قارورة T25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمت إزالة المتوسطة النمو من القارورة وأحادي الطبقة من الخلايا التي تم إصدارها مع 2 مل من التربسين 2.5٪. مرة واحدة كانت الخلايا في الحل، وتطفئ trypsinization مع إضافة 10 مل من مستنبت الخلية إلى القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التم طرد ه التعليق الخلية لمدة 5 دقائق وتمت إزالة طاف. ومعلق الخلايا في 1 مل من مستنبت الخلية (التي تحتوي على مصل) للحقن في غرفة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تحميل التعليق الخلية (0.5 مل، = 50،000 الخلايا) في حقنة وحقنها في غرفة تدفق من خلال صمام ثلاثي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سمح للخلايا لتسوية الالتزام والركيزة الزجاج لمدة 2 ساعة قبل بدأ التدفق. ونمت الخلايا تحت تدفق في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 5 أيام حتى متموجة. </li></ol> 1.3 إعداد الكابولي والمسافة البادئة الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تنظيف Tipless الكابولي AFM (NanoWorld، سويسرا) في حامض النيتريك لمدة 5 دقائق و functionalized مع triethoxy أمينو سيلاني (APTES) في غرفة ترسيب البخار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A حل من 5 ملغ / مل وزنا NHS-LC-سلفو البيوتين في محلول ملح هانك التخزين المؤقت (HBSS) أعدت. وغمرت المياه في الكابولي في حل لمدة 15 دقيقة لconjuبوابة سيلاني مع الكيمياء (NHS) N-Hydroxysuccinimide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقدم حل وسط البيوتين مجانا من احتضان 20 مل من تقنيات المزيد خلية ثقافة المتوسط ​​(بما في ذلك المصل) مع 200 ميكرولتر من الخرز لمدة 12 ساعة streptavadin. تم إزالة حبات من المتوسطة مع المغناطيس وتصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.22 ميكرون العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمت إزالة غرفة تدفق من الخلية طبق الثقافة وتم غسلها الخلايا في 37 ° C البيوتين خالية المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتم إعداد محلول المخزون من 1 ميكرولتر من 2.4 ميكرومتر الخرز المغلفة مع streptavidin في 1 مل من المتوسط ​​مجانا البيوتين، وإضافة 100 ميكرولتر من الأسهم إلى الخلية طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كان قد تم اعتقالهم الخرز Streptavidin حتى مع ناتئ من الهبوط على سطح تلميح الزجاج بالقرب من التراجع، وحبة، وتحديد المواقع ذروة ناتئ على حبة، ومن ثم الضغط على أسفل ناتئ على عدة ثواني حبة ويستريح ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كان لحساسية ناتئ التدبيرد من الطعج على منطقة من الزجاج عارية واستخدام المنحدر من منحنى لضبط انحراف الطرف بوصفها وظيفة من الجهد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تم حساب ثابت الربيع للناتئ من المعايرة الحرارية في البرنامج MFP3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واستخدمت بعد ذلك لمعايرة ناتئ مسافة بادئة للعينات، كما هو مبين في الشكل 2. هذه الخرز 2،4 ميكرومتر توفر مساحة أكبر اتصال مع سطح الخلية بحيث يمكن الكشف عن الخواص الميكانيكية للطبقة ناعمة الكنان السكري. وكان وضعه في ناتئ فوق خلية بالقرب من نواة الخلية ونهج الناعمة تم استخدام تلميح إلى الخلية لضبط ارتفاع حوالي 3 ميكرومتر ناتئ فوق سطح الخلية. تم تعيين البرنامج لمدة 20 الانبعاجات المتكررة بمعدل 1 ميكرومتر / ثانية إلى أقصى قوة من ن ن 7. ما يقرب من 6 ثوانى المنقضي بين اتصالات المتعاقبة. فمن الممكن استخدام معدلات مختلفة من المسافة البادئة لاختبار المعتمدة على الوقت خصائص الكنان السكري، على الرغم من هذه الأولية<html> التجارب، فقط تم استخدام معدل المسافة البادئة واحد (1 ميكرومتر / ثانية). </li></ol> 2. المسافة البادئة نظرية ويمكن وصف المسافة البادئة إلى مرونة نصف مساحة مع دائرة نصف قطرها R مجال استخدام نظرية هيرتز حيث يتم إعطاء قوة المسافة البادئة، F، عن طريق المعادلة: <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> حيث δ هو عمق المسافة البادئة و* E هو معامل تخفيض من المواد تحت الاختبار (الشكل 3). في حالة وجود إندينتر شديدة تؤثر بلا حدود موحدة مرنة نصف الفضاء، وتعطى من قبل E * المعادلة: <html> 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; حيث E هو معامل المرونة وν هي نسبة بواسون للمادة. وقد ألهم عمل مؤخرا مع الأفلام البلاستيكية ووضع نموذج الطبقة الثانية لتحديد معامل وسمك الأغشية الرقيقة 1. نحن نطبق هذا النموذج لبيولوجيا الخلية عن طريق معالجة الكنان السكري كفيلم موحدة لينة رقيقة على سطح خلايا الجسم. باستخدام هذا النموذج، وانخفاض معامل يصبح النظام: <img alt="المعادلة 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> حيث E هو معامل GC من الكنان السكري، E الخلية هي معامل جسم الخلية، P، Q و N هي الثوابت التي تم تحديدها تجريبيا من البوليمر تناسبها، وتعطى من قبل Z المعادلة: -together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="المعادلة 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> حيث t هو سمك طبقة الكنان السكري. ويرد التخطيطي من هذه المعلمات في الشكل 3. وقد تبين النموذج ليكون وسيلة دقيقة لتحديد معامل وسمك طبقة رقيقة على صلابة الركيزة 1. ويمكن استخدام هذه المعادلة لتناسب منحنيات تم الحصول عليها من المسافة البادئة في الخلايا لتحديد معامل وسمك بطانة الكنان السكري، كما هو موضح في الشكل 4.

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

استخدمنا القيم المحسوبة من النموذج طبقتين ونظرية هيرتز في تصميم نموذج التفاعل من الكريات البيض في الدم مع الجدار البطانية. وحسبنا أن زغيبة على الكريات البيض التي يبلغ قطرها 50 نانومتر تحت تحميل PN 10 ونحو 150 نانومتر البادئة في الكنان السكري، سوى جزء ضئيل من مجموع سمك. هذ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> مكوي والمتوسطة </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> البطانية متوسطة نمو الخلايا </td><td> المزيد تكنولوجيا </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> تجميع الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان </td><td> المزيد تكنولوجيا </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الكبريتيك </td><td> JT بيكر </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> ماء الأوكسجين </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-أمينو) triethoxysilane </td><td> الدريتش </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> الآيزوبروبيل الكحول </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> هانك محلول الملح التخزين المؤقت </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> سلفو NHS-LC-البيوتين </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> الخرز Streptavadin </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> اللجوء بحوث </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless الكابولي </td><td> Nanoworld </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> صورة ظلية SD </td><td> Quickutz </td><td> صورة ظلية-SD </td><td></td></tr><tr><td> سيليكون المطاط </td><td> ستوكويل Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 مل المحاقن </TD&gt; <td> بنتون ديكنسون </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> الإبر قياس 18 </td><td> بنتون ديكنسون </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> تمديد مجموعات </td><td> هوسبيرا </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4 طريقة الصمامات </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> قبعات ميناء ذكر / أنثى </td><td> سميث الطبية </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> تحوي مضخة </td><td> واتسون، مارلو </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> تحوي أنابيب </td><td> واتسون، مارلو </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> مرشحات معقمة </td><td> بظلالها علوم الحياة </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

ويقتصر فهمنا للتفاعل الكريات البيض وجدار الوعاء الدموي أثناء التقاط الكريات البيض من فهم غير مكتمل الخصائص الميكانيكية للطبقة السطحية البطانية. من المعروف أن توزع جزيئات الالتصاق على الكريات البيض غير موحد بالنسبة لتضاريس سطح 3، أن يحد من تضاريس لاصقة تشكيل السندات مع غيرها من الأسطح 9، وأن القوات اتصال الفسيولوجية (≈ 5،0 حتي 10،0 في زغيبة PN) يمكن ضغط زغيبات على أنها اقل من ثلث طولها يستريح، وزيادة إمكانية الوصول إلى جزيئات على سطح معارضة 3 و 7. ونحن نعتبر أن البطانة كهيكل لمدة الطبقات، جسم الخلية جامدة نسبيا، بالإضافة إلى الكنان السكري، وطلاء لينة واقية السكر على سطح اللمعية 6. وقد تبين أن الكنان السكري يمكن أن تكون بمثابة حاجز للحد من التصاق الكريات البيض من السطح إلى 4 البطانية.في هذا التقرير أن نبدأ في معالجة التشوه من السطوح البطانية لفهم كيفية صلابة البطانية الميكانيكية قد تؤثر على تشكيل السندات. الخلايا البطانية التي تزرع في ثقافة ساكنة لا تعبر عن الكنان السكري قوية، ولكن الخلايا نمت في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية تبدأ في الكنان السكري التقريبي لوحظ في الجسم الحي 2. وقد تم قياس معامل للجسم الخلية البطانية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) ليكون يقرب من 5 إلى 20 كيلو باسكال 5. وقد تم دراسة سمك وهيكل الكنان السكري باستخدام المجهر الإلكتروني 8، وتم يقترب من معامل للالكنان السكري باستخدام أساليب غير مباشرة، ولكن على حد علمنا، لم تكن هناك أي تقارير منشورة من القياس المباشر للمعامل الكنان السكري في الخلايا الحية . في هذه الدراسة، نقدم تجارب المسافة البادئة التي مع التحقيق الذي تجريه AFM الرواية على الخلايا التي تم زرعها في ظروف لتحقيق أقصى قدر من التعبير عنها لأماه الكنان السكريقياسات كه المباشر للمعامل وسمك بطانة الكنان السكري.

<html> في تجربة نموذجية، تم الحصول على 20 القوة-VS-المسافة من منحنيات منطقة معينة من الخلية، وعادة في المنطقة محيط بالنواة، القريب، ولكن لم يكن في النواة (داخل ميكرومتر 2 ~). تم تنسيق منحنيات حساب أي انحراف العينة خلال مدة القياس ومن ثم بلغ متوسط ​​الضجيج لإزالة ناتئ، كما ه?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

تم قياس الخصائص الميكانيكية للالكنان السكري من المسافة البادئة باستخدام البطانية المجالات ميكرون الحجم على الكابولي AFM. تم زراعة الخلايا البطانية في غرفة مخصصة في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية للحث على التعبير الكنان السكري. وقد تم تحليل البيانات باستخدام نموذج رقيقة لتحديد سمك الكنان السكري ومعامل.

قياس الخواص الميكانيكية للالكنان السكري غشائي مع مجهر القوة الذرية

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

quantifying-mechanical-properties-endothelial-glycocalyx-with-atomic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Views.  University of Rochester. تم قياس الخصائص الميكانيكية للالكنان السكري من المسافة البادئة باستخدام البطانية المجالات ميكرون الحجم على الكابولي AFM. تم زراعة الخلايا البطانية في غرفة مخصصة في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية للحث على التعبير الكنان السكري. وقد تم تحليل البيانات باستخدام نموذج رق?...

Video: Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

في الموقع خارطة الخواص الميكانيكية لالأغشية الحيوية التي تتبع الجسيمات Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

توليف الهلاميات المائية مع خصائص المضادة للحشف والأغشية لتنقية المياه

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

نظام ملليمتر اختبار العاطفة مقياس لقياس الخواص الميكانيكية للاسفنج البحري سبيكوليس

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

بياكسيال الخصائص الميكانيكية لصمامات القلب بي

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

تطبيق المجهر القوة الذرية للكشف عن هشاشة العظام في وقت مبكر

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...