המחברים מבקשים להודות לאלנה Lomakina, ריצ&#39;רד Bauserman, מרגרט יונגמן, השי וקנין, ג&#39;סיקה סניידר, כריס Striemer, Nakul Nataraj, האנג לי צ&#39;ונג, Tejas Khire, ואריק לאם על סיועם בפרויקט זה. פרויקט זה מומן על ידי NIH # PO1 HL 018208.

1. שיטות לשכת תזרים סלולרי 1.1 תא זרימה, מוצג באיור 1, נבנה כך שניתן לגדל תאים תחת גזירה של 1.0 Pa (10 / סנטימטר dyn 2) ולאחר מכן מועברים ישירות למקלט MFP3D AFM (סנטה ברברה, קליפורניה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא הזרימה היה מוכן לניסוי על ידי ניקוי תחילה את שקופיות הזכוכית בפתרון Piranha (03:01 H 2 SO 4: H 2 O 2) במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם במים מזוקקים. אז הם היו אופים ליבשים ומצופים בtriethoxy silane aminopropyl (APTES) בתא ואקום בתצהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטם סיליקון נחתך באמצעות כלי חיתוך SD צללית. זה אפשר לנו היטב לשלוט בממדים הקאמריים הזרימה לשליטה על קצב הזרימה ומאמץ גזירה בגדילת תאים. בדרך כלל, ערוץ נחתך 6.4 מ&quot;מ רחב של 19 מ&quot;מ ארוך מגיליון של סיליקון מ&quot;מ 0.4. קצב הזרימה ההכרחי לסוגיםטה מאמץ גזירה של 1.0 Pa (10 dyn / סנטימטר 2) מחושב בהנחה שהזרימה למינרית בערוץ מלבני עם המשוואה: </li></ol><img alt="משוואה 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> בי Q הוא קצב הזרימה, τ הוא מאמץ הגזירה, μ הוא הצמיגות הבינונית, מניח כאן להיות 1.0 MPA (0.01 dyn * שניות / סנטימטר 2), h הוא הגובה והרוחב הוא הרוחב של תא הזרימה . <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקטע העליון של תא הזרימה היה מתואם עם האטם בצלחת תרבית תאים ומאובטחים עם טבעת מגנטית. ההרכבה הייתה מלאה באיזופרופיל אלכוהול (IPA) לעיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת הזרימה המלאה הורכבה. יציאות הזרימה בצלחת תרבית התאים הייתם מחוברות לשסתומים משולשים. השסתומים היו קשורים לפתיחת מזרק מ&quot;ל 30s. IPA היה סמוק דרך המערכת, אז שנשטפה עם 30 מ&quot;ל של מדיום של מקוי עם 4% עגל סרום עוברי (FCS). אז המערכת הייתה מלאה ב20 מ&quot;ל של מדיום גידול תאי טכנולוגיות Vec. כיסויים הונחו על צמרות המזרקים. כובע מזרק המאגר לתפוס לו מחט במקום לזוז בינוני בחזרה למאגר ההזנה. 0.2 מסנני מיקרומטר סטריליים צורפו לפתחי כניסת האוויר בשמיכות כדי למנוע זיהום של המערכת. תא הזרימה היה אז מוכן לזריעת תאים. </li></ol> תא תרבות 1.2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים אנושיים טבור וריד האנדותל (HUVEC של) ובינוני צמיחה נרכשו מטכנולוגיות Vec (Rensselaer, ניו יורק) וגדלו למפגש בT25 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום הגידול הוסר מהבקבוקון וmonolayer של תאים משתחררים עם 2 מ&quot;ל של טריפסין 2.5%. ברגע שהתאים היו בתמיסה, trypsinization היה רווה עם תוספת של 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות תא לבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעית תא דואר הייתה centrifuged למשך 5 דקות וsupernatant הוסר. התאים היו resuspended ב 1 מ&quot;ל של מדיום תרבית תאים (המכיל סרום) להזרקה לתוך תא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית התא (0.5 מ&quot;ל, ~ 50,000 תאים) הוכנסה למזרק והזריקה לתוך תא הזרימה דרך שסתום שלוש דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הורשו להתיישב ולדבוק במצע הזכוכית ל2 שעות לפני הזרימה החלה. את התאים גודל תחת זרימה בחממה ב 37 ° C עבור 1 עד 5 ימים עד confluent. </li></ol> הכנת Cantilever 1.3 וכניסה סלולרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cantilevers AFM Tipless (NanoWorld, שוויץ) נוקו בחומצה חנקתית למשך 5 דקות ופונקציונליות עם triethoxy silane aminopropyl (APTES) בתא שיקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לפי משקל NHS-sulfo-LC-ביוטין בתמיסת מלח Buffered של האנק (HBSS) היה מוכן. את cantilevers היה שקוע בפתרון במשך 15 דקות לconjuשער silane עם N-Hydroxysuccinimide כימיה (NHS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון של מדיום חופשי ביוטין נעשה על ידי דוגר 20 מ&quot;ל של מדיום Vec טכנולוגיות תא התרבות (כולל סרום) עם 200 μl של חרוזי streptavadin עבור 12 שעות. החרוזים הוסרו מהמדיום עם מגנט והבינוני היה מסונן דרך מסנן סטרילי 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא הזרימה הוסר מצלחת תרבית התאים והתאים נשטפו 37 ° C הבינוני ביוטין חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מניות של μl 1 מתוך 2.4 מיקרומטר חרוזים מצופים בstreptavidin 1 מ&quot;ל של מדיום חופשי ביוטין היה מוכן, ו100 μl של המניות נוספת לצלחת תרבית התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזי streptavidin נאספו בשלוחה על ידי נחיתת טיפ על משטח הזכוכית לצד, לחזור בו חרוז, מיצוב השיא של השלוחה מעל החרוז, ולאחר מכן לחיצה על השלוחה למטה, אל כמה שניות החרוזות ומנוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרגישות של השלוחה הייתה מידהד ידי indenting על אזור של זכוכית חשופה ובאמצעות השיפוע העקום להגדיר סטיית הקצה כפונקציה של מתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוע הקפיץ של השלוחה חושב אזי מכיול תרמי בתוכנת MFP3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלוחה המכוילת שמשה אז לשנן את הדגימות, כפי שמוצגת באיור 2. 2.4 מיקרומטר חרוזים אלו מציעים שטח מגע גדול יותר עם תא השטח, כך שהתכונות המכאניות של שכבת glycocalyx הרכה ניתן לאתר. השלוחה הוצבה מעל תא ליד גרעין התא וגישה רכה של הקצה אל התא היה בשימוש כדי לקבוע את גובה השלוחה כ 3 מיקרומטר מעל פני שטח התא. התוכנה הוקמה במשך 20 חריצים חוזרים ונשנים בשיעור של 1 מיקרומטר / שנייה לכוח מקסימאלי של 7 NN. כ 6 שניות שחלפו בין אנשי קשר רצופים. ניתן להשתמש בתעריפים שונים של כניסה לבדיקת תכונות תלויות הזמן glycocalyx, אם כי באלה ראשוניים<html> ניסויים, רק שיעור כניסה יחידה (מיקרומטר 1 / שני) היה בשימוש. </li></ol> 2. תאורית הזחה כניסה למחצית שטח אלסטי עם מרחב של R רדיוס ניתן לתאר באמצעות תאורית הרץ שבו הכח של כניסה, F, נתונה על ידי המשוואה: <img alt="משוואה 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> איפה δ הוא עומק ההזחה ו* E הוא מודולוס המופחת של החומר נבדק (איור 3). במקרה של indenter אינסוף נוקשה לפגוע חצי מרחב אלסטי אחיד, * דואר ניתן על ידי המשוואה: <html> 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; כאשר E היא מודולוס האלסטיות וν הוא יחס פואסון של החומר. העבודה האחרונה עם פולימר סרטים נתנה השראה לפיתוח מודל שתי שכבה לקביעת מודולוס והעובי של שכבות דקות 1. אנו מיישמים את המודל הזה לביולוגיה של תא על ידי טיפול glycocalyx כסרט רך דק אחיד על פני השטח של גוף התא. שימוש במודל זה, מודולוס המופחת של המערכת הופך להיות: <img alt="משוואה 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> כאשר E GC הוא מודולוס של glycocalyx, תא הדואר הוא מודולוס של גוף התא, P, Q ו n הם קבועים אשר נקבעו באופן אמפירי מהפולימר המתאים, וZ זה נתונה על ידי המשוואה: -Together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="משוואה 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> כאשר t הוא עובי שכבת glycocalyx. סכמטי של פרמטרים אלה מוצג באיור 3. המודל הוכח להיות דרך מדויקת של קביעת מודולוס והעובי של סרט דק על מצע 1 נוקשה. משוואה זו יכולה לשמש כדי להתאים את העקומות המתקבלות מכניסה לתוך תאים כדי לקבוע מודולוס והעובי של glycocalyx האנדותל, כפי שמוצגת באיור 4.

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנחנו השתמשנו ערכים מחושבים מהמודל דו שכבתי ותאורית הרץ למודל האינטראקציה של יקוציט במחזור הדם עם קיר אנדותל. אנו כי יש לחשב את microvillus על יקוציט בקוטר של 50 ננומטר בעומס 10 PN הייתי כניסה כ 150 ננומטר לglycocalyx, רק חלק קטן מהעובי הכולל. זה מצביע על כך glycocalyx, עם מאפיינים כפי שנמ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> הבינוני של מקוי </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני צמיחת תאי אנדותל </td><td> טכנולוגיות Vec </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> תאי אדם אספו טבורי וריד אנדותל </td><td> טכנולוגיות Vec </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> JT בייקר </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> מי חמצן </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triethoxysilane </td><td> אולדריץ </td><td> 440140-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> איזופרופיל אלכוהול </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת מלח Buffered של האנק </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-ביוטין </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי Streptavadin </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> מקלט מחקר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers Tipless </td><td> Nanoworld </td><td> חץ TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> הצללית SD </td><td> Quickutz </td><td> צללית-SD </td><td></td></tr><tr><td> גומי סיליקון </td><td> סטוקוול Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 מיליליטר מזרקים </td&gt; <td> בנטון דיקינסון </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 מחטי מד </td><td> בנטון דיקינסון </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> סטים מאריכים </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> שסתומי 4 דרך </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Caps נמלי זכר / נקבה </td><td> סמית של הרפואה </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> משאבת peristaltic </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> אבובי peristaltic </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> מסננים סטריליים </td><td> מדעי חי Pall </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

ההבנה של האינטראקציה של לויקוציטים ודופן כלי הדם במהלך לכידת יקוציט מוגבל על ידי הבנה חלקית של התכונות המכאניות של שכבת פני השטח האנדותל. זה ידוע כי מולקולות דבקות על תאי דם לבנים מופצות לא אחידה ביחס למשטח 3 טופוגרפיה, הטופוגרפיה שמגבילה היווצרות קשרים עם דבק משטחים אחרים 9, וכי כוחות המגע פיסיולוגיים (≈ 5.0-10.0 PN לmicrovillus) יכולים לדחוס את microvilli כל קטן כשליש מאורך המנוחה שלהם, להגדיל את הנגישות של מולקולות על פני השטח היריב 3, 7. אנו רואים האנדותל כמבנה דו שכבתי, גוף התא הקשיח יחסית, בתוספת glycocalyx, ציפוי סוכר מגן רך על פני שטח luminal 6. הוכח שglycocalyx יכול לפעול כמחסום להפחתת הידבקות של לויקוציטים לאנדותל 4 משטח.בדו&quot;ח זה אנו מתחילים להתייחס deformability של משטחי אנדותל להבין כיצד הקשיחות המכאנית האנדותל עשויה להשפיע על היווצרות קשרים. תאי האנדותל הגדלים בתרבית סטטית אינם מבטאים glycocalyx חזק, אבל תאים שגודלו בתנאי זרימה פיסיולוגיות מתחילים המשוער glycocalyx נצפה בvivo 2. מודולוס של גוף התא האנדותל כבר נמדד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כדי להיות כ 5-20 kPa 5. עובי המבנה של glycocalyx נחקרו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 8, ומודול של glycocalyx כבר מקורב תוך שימוש בשיטות עקיפות, אבל למיטב ידיעתנו, לא חל כל דו&quot;חות רשמיים של מדידה ישירה של מודולוס glycocalyx בתאים חיים . במחקר זה, אנו מציגים ניסויים שנעשו עם הזחת רומן AFM בדיקה על תאים שכבר בתרבית בתנאים למקסם ביטוי glycocalyx למאמדידה ישירה של ke מודולוס והעובי של glycocalyx אנדותל.

<html> בניסוי טיפוסי, 20 עקומות כוח לעומת מרחקים התקבלו מאזור נתון של התא, בדרך כלל באזור perinuclear, קרוב, אבל לא על, הגרעין (בתוך ~ 2 מיקרומטר). העקומות היו מיושרות לחשבון לכל סחף מדגם על משך הזמן של המדידה ולאחר מכן בממוצע להסרת רעש שלוחה, כפי שמוצגות באיור 4. העקומות נו...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

המאפיינים המכאניים של glycocalyx אנדותל נמדדו על ידי כניסה באמצעות כדורים בגודל מיקרון על cantilevers AFM. תאי אנדותל בתרבית בתא מותאם אישית תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים לגרום ביטוי glycocalyx. נתונים נותחו באמצעות מודל סרט דק כדי לקבוע את העובי ומודולוס glycocalyx.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

quantifying-mechanical-properties-endothelial-glycocalyx-with-atomic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Views.  University of Rochester. המאפיינים המכאניים של glycocalyx אנדותל נמדדו על ידי כניסה באמצעות כדורים בגודל מיקרון על cantilevers AFM. תאי אנדותל בתרבית בתא מותאם אישית תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים לגרום ביטוי glycocalyx. נתונים נותחו באמצעות מודל סרט דק כדי לקבוע את העובי ומודולוס glycocalyx.

Video: Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

מילימטר סולם Flexural בדיקות מערכת למדידת התכונות המכאניות של הספוג הימי Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

אפיוני מכני biaxial של מסתמי הלב Atrioventricular

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...