نشكر فومي كوبو، وتود تييلي HerwigBaier (UCSF / معهد ماكس بلانك) للحصول على المشورة بشأن التجارب السلوك وDPSS الليزر إنشاؤها؛ Heesoo كيم وCERRI كيارا من ملعب البيولوجيا العصبية للمساعدة في MBL الشيف-tdTomato التجارب؛ PetronellaKettunen (جامعة غوتنبرغ ) للتعاون الأولي على التجارب optogenetic؛ BaljitKhakh، اريك هدسون، وجون مايك باكا ميليغان (UCLA) للحصول على المشورة التقنية، وروجر تسين (جامعة كاليفورنيا سان دييغو) لبناء الشيف-tdTomato. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة (5F31NS064817) NRSA لAMSP ومنحة من NSF (RIG: 0819010) لAS.

إعداد ما يلي في وقت مبكر. 1. إعداد كابل الألياف البصرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء وحدة التخزين للكابلات الالياف بواسطة ذوبان الرقبة مدبب من ماصة باستور الزجاج أكثر من موقد بنزن لخلق زاوية ° ~ 150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قطع الأسلاك أو شفرة حلاقة، وقطع بعناية الكابلات البصرية إلى قطعتين. ينبغي لكل قطعة واحدة مع نهاية FC / PC ومحول أحد طرفي عرضة للخطر. تخزين قطعة واحدة كما كبل احتياطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجريد الكابل البصري وصولا الى الكسوة عن طريق إزالة سترة الألياف والألياف تعزيز (الشكل 1A) من 5.0 سم من نهاية قطع من الكابل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج كابلات الالياف إلى ماصة باستور المعدة. تأكد من الكابل يمكن ان تتحرك بسهولة ويخرجون من طرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الكابل البصري جاحظ من طرف ماصة باستور، وقطع بعناية وإزالة الألياف الكسوة من جميع أنحاء الألياف الزجاجية، ~ 2 مم من نهاية القطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام القلم الماس / الزجاج القاطع، نيك الألياف الزجاجية وكسر سوما يليها نهاية لإنشاء قطع نظيفة / سطح في نهاية الألياف (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الكابلات البصرية إلى ماصة باستور للتخزين. كرر الخطوة (1.6) إذا كان يحصل على نقطة وغيض من الألياف البصرية أو فواصل بشكل غير متساو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكابل البصري في موقف ماصة باستور باستخدام مياداة مجهرية (الشكل 1C). </li></ol> الإجراءات 2-8 تصف طريقة لحقن الجينات المحورة في الأجنة المطبقة عادة على التجارب الزرد كثيرة. الاختلافات على هذا الأسلوب، مثل تلك الموضحة في الفيديو إن الرب الأخرى 6، 7، 8، 9، 22 هي نفس القدر من الفعالية. 2. سحب حقن الإبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة مجتذب، وسحب أنابيب الزجاج البورسليكات في الإبر حقن اثنين مع تلميح مدبب تدريجيا. سوف الإعدادات مجتذب تختلف. (على إبرة سوتر الآلات التي نستخدمها مجتذب إعدادات: P = 500، الحرارة = 720، سحب = 50، السرعة والوقت = 70 = 150). كل إبرة مجتذب هو مختلف، حتى تحسين إعدادات مجتذب مpirically. لمزيد من الإبر مدبب، وزيادة الحرارة و / أو سحب. لإبر أقل مدبب، وزيادة الوقت و / أو سحب انخفاض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر في وعاء تخزين آمنة (أي طبق بتري مع الشريط توالت لاصقة من جانب). </li></ol> 3. صب قوالب حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب 0.5 غ الاغاروز في الجنين مل 30 / المياه الزرقاء، حتى أنه قد حلت تماما الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصب في النصف السفلي من طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قالب مستطيل مع تصاعد الآبار (الشكل 2) في الاغاروز، والحرص على تشكيل للحد من فقاعة حول الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العفن وملء طبق بتري مع الأزرق / المياه الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين تستقيم، مليئة المياه النظيفة، في درجة حرارة الغرفة لاستخدام نفس اليوم أو في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 4. جعل البلازميد الحمض النووي لحقن مزيج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع DNA البلازميد إلى تركيز من 50 نانوغرام / ميكرولتر مع أحمر الفينول 1:10 في DDH 2 O. إلىعلى سبيل المثال: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1.0 مل </td><td> بلازميد الحمض النووي (250 نانوغرام / مل) </td></tr><tr><td> 0.5 مل </td><td> الفينول الأحمر </td></tr><tr><td> 3،5 مل </td><td> DDH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن تظل مزيج DNA في درجة حرارة الغرفة في حالة استخدام فورا أو تخزينها في C ° 4 لعدة أيام. </li></ol> 5. إعداد أزواج التزاوج وينبغي أن يتم هذا المساء قبل كنت تخطط للقيام الحقن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء خزانات المياه مع نظام التربية ومكان الأسماك الذكور والإناث معا. إذا لم يكن يتم تنفيذ الحقن بمجرد تشغيل أضواء في منشأة منفصلة الأسماك الذكور والإناث مع مقسم. </li></ol> 6. (يمكن القيام أثناء انتظار الأجنة) الاستعداد للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الضغط حاقن تلاعب. تأكد من تعيين النظام إلى النبض. تبدأ مع مجموعة PULSE DURATION إلى 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على صمام الهواء وضبط ضغط حاقن لPSI 20 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نطاق تشريح على أعلى التكبير، وكسر غيض من إبرة مع ملقط أو لعبة البوكر لخلق ~ افتتاح ميكرومتر 2 (الشكل 3، فيلم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مع الإبر مزيج من DNA: 1. وضع الجانب إبرة غيض، وحتى، في مزيج الحمض النووي والسماح للإبرة ملء من عمل شعري أو 2. باستخدام تلميح طويلة تصل إلى 1-2 ماصة ميكرولتر من الحمض النووي مزيج مباشرة في الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل الإبرة مكان في مكان آمن حتى جاهزة للحقن. </li></ol> 7. جمع الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أضواء مرفق تم تشغيل، وإزالة فواصل (إن وجد). جمع الأجنة مع مصفاة / غربال الصغيرة ونقلها إلى طبق بتري مع الأزرق الطازجة / المياه الجنين. </li></ol> 8. حقن الأجنة في مرحلة الخلية 1-2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى حصاد قوالب حقن البلاستيك باستخدام ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح، ودفع برفق الأجنة فيالآبار مع ملقط أو لعبة البوكر حادة (الشكل 4، فيلم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الإبرة المحملة إلى مياداة مجهرية وموقف أكثر الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة حجم الحقن عن طريق ضبط مدة PULSE في الخطوة 1-زيادات حتى تحصل على الصوت المطلوب (~ 1 NL). يمكن معايرة ذلك مع شريحة ميكرون، كما هو موضح في الفيديو لإن الرب السابق 8 و 22، ولكن لهذه الدقة التجربة ليست ضرورية، لأن مجموعة واسعة من حجم الضخ سيؤدي إلى التعبير الملائم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن مزيج 1 ~ NL DNA في الخلية مباشرة وتكرار لجميع الأجنة. ويمكن أيضا أن DNA حقنها في صفار، ولكن هذا يميل إلى أن يكون أقل كفاءة (الشكل 5، الفيلم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجنة المحقونة من العفن باستخدام تيار لطيف من اللون الأزرق / المياه الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر حقن الأجنة في C ° 28،5 في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غير مخصبة، أجنة ميتة أو التالفة بشكل دوري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الأجنة وايال PTU بين 18-24 HPF لمنع تصبغ. </li></ol> 9. الشاشة للتعبير التحوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dechorionate يدويا باستخدام HPF 24-48 الأجنة ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير اليرقات باستخدام 0.02٪ tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر الفلورسنت تشريح وتحديد اليرقات أو مثلث التوائم مع RB التعبير الخلايا العصبية ونقل هذه إلى طبق جديد مع المياه العذبة الزرقاء / PTU الجنين. الأجنة مع التعبير متفرق في الخلايا يسهل التعرف عليها هي الأمثل، ولكن سيتم استهداف الخلايا العصبية الفردية للتنشيط مع كابل من الألياف البصرية لذلك مجموعة واسعة من كثافة التعبير مقبولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة في متجر 28.5 ° C في الظلام حتى المرحلة التجريبية المطلوبة. </li></ol> 10. تحميل ليرقات التجارب السلوك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل منخفضة 1.5٪ الاغاروز ذوبان في DDH 2 O وتخزينها في كتلة الحرارة ° 42 C لمنعها من التصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستور الزجاج، ونقل اليرقات واحدة من فرزهم في حوض(ه) من 1.5٪ الاغاروز ذوبان منخفضة مع والمياه الزرقاء / الجنين أقل قدر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات في قطرة من الاغاروز على طبق بتري الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح يرقة الموقف، حتى الظهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد عززت عندما الاغاروز، وقطع بعيدا الاغاروز مع شفرة حلاقة رقيقة (# 11 مشرط)، وترك اسفين من أجار حول يرقة بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين تخفيضات قطري في جانبي صفار؛ الحرص على عدم نيك اليرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء المنطقة المحيطة الاغاروز مع الجنين / المياه الزرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الاغاروز بعيدا عن الجذع والذيل من يرقة (الشكل 6). </li></ol> 11. إعداد الكاميرا فائقة السرعة وبرامج التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كاميرا عالية السرعة على نطاق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الكاميرا إلى جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الكاميرا عالية السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الفيديو / برامج التصوير (نحن نستخدم AOS برامج التصوير وسوف يصف الإجراءات لاستخدامه هنا، ولكن التصوير الأخرىالبرنامج هو مقبول على حد سواء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات الكاميرا وفقا لذلك (أي 1000 لقطة في الثانية (في الثانية)، 50٪ العازلة الزناد أو إعدادات المفضل الأخرى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التسجيل. </li></ol> 12. تنشيط الخلايا العصبية واحدة باستخدام الليزر نانومتر 473 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق مشجعا، والكابلات البصرية بالليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مشجعا إلى حد أقصى من 5 فولت ومدة النبضة من 5 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الليزر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر تشريح لوضع غيض من كابلات الالياف بالقرب من جسم الخلية العصبية مع وجود الشيف-tdTomato التعبير (الشكل 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم نبض الضوء الأزرق لتفعيل الخلايا العصبية الحسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين السلوك سجل باستخدام كاميرا عالية السرعة على 500 أو 1،000 لقطة في الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار التجربة على النحو المرغوب فيه، والانتظار 1 دقيقة بين كل تفعيل لتجنب التعود. (نسجل ما لا يقل عن ثلاث إجابات لكل الخلايا العصبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلىاليرقات الإفراج عنهم، وبصرف النظر نقب الاغاروز مع ملقط، مع الحرص على عدم إصابة الحيوان. يمكن أن يسمح هذا الحيوان لمواصلة تطوير ويمكن تكرار الإجراء في مرحلة قديمة لوصف تطور السلوك. ويمكن أيضا أن الجنين remounted عالية الدقة لتصوير مبائر للخلية المنشط لربط السلوك مع بنية الخلية، كما هو موضح أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقة إلى لوحة زرقاء مع ثقافة جديدة / جنين المياه. نستخدم لوحة 24 أيضا لتتبع اليرقات الفردية. </li></ol> 13. صورة الخلية العصبية (ق) مع مجهر متحد البؤر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير اليرقات مع tricaine 0.02٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل اليرقات، حتى الجانب الظهري، في ذوبان 1.2٪ الاغاروز منخفضة أو في قالب الظهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الشيف-tdTomato الخلايا العصبية مع ليزر نانومتر 543 و تصفية مناسبة وموضوعية. نستخدم الهدف 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة اليرقات من الاغاروز والعودة إلى الفرد بشكل جيد مع الأزرق / المياه الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر 28.5 ° C في في الظلام لفوrther التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم أي اهتمام المتنافسة المالية.

وقد وصفت لنا نهجا لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية RB واحد في الزرد الحية. لدينا أسلوب يستخدم للتعبير عن transgenesis عابرة البديل channelrhodopsin الموسومة fluorescently، الشيف، tdTomato 13، في الخلايا العصبية الحسية الجسدية المحددة. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا النهج لاستخدامها في غيرها...

جعلت تطوير أساليب optogenetic لتعزيز أو تثبيط الخلايا العصبية مع استثارة موجات محددة من الضوء من الممكن دراسة وظيفة للسكان متميزة من الخلايا العصبية في الدارات العصبية السيطرة على السلوك 1، 19، 21. وغالبا ما تستخدم هذه التقنية لتفعيل مجموعات من الخلايا العصبية، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتنشيط الخلايا العصبية الفردية. اليرقات الزرد هي أكثر ملاءمة لهذه الأساليب لأنها شفافة، الجهاز العصبي يتطور بسرعة، وخلق الحيوانات المعدلة وراثيا بسرعة والروتينية. ومع ذلك، لا بد من التغلب على العقبات الفنية الهامة لتحقيق موثوق واحد تفعيل الخلايا العصبية. لتحسين إجراء لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية الزرد واحد، ركزنا على الخلايا العصبية الحسية الجسدية. اليرقات الزرد كشف مجموعة متنوعة من المحفزات الحسية الجسدية باستخدام اثنين من السكان من الخلايا العصبية: مثلث التوائم الخلايا العصبية، والتي يعصب رأسه، وحية Rohon-(RB) الخلايا العصبية، وهي عصب باقي الجسم. كل الخلايا العصبية والعصب الثلاثي التوائم RB مشاريع محور عصبي الطرفية التي الفروع على نطاق واسع في الجلد للكشف عن المنبهات ومحور عصبي المركزي الذي يتصل الدوائر العصبية المصب. الحيوانات تستجيب للمس في وقت مبكر الى 21 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، مشيرا إلى أن دوائر متماسكة الحسية الجسدية شكلت 5، 18. خلال نمو اليرقات على الأقل بعض الخلايا العصبية المشبك الثلاثي التوائم وعلى RB الخلية ماوتنر لتفعيل استجابات الهروب الكلاسيكي، ولكن تراكم الأدلة تشير إلى أن هناك فئات متعددة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع أنماط مختلفة من الاتصال التي قد تثير اختلافات على سلوك الهروب 2، 4، 10 و 12 و 14 و 15 و 16 و 17. كان لدينا الدافع لتطوير هذه الطريقة لتوصيف وظيفة السلوكية لفئات مختلفة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية، ولكن من حيث المبدأ يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة وظيفة الخلايا العصبية من أي تقريبا أو السكان من الخلايا العصبية في لارفال الزرد. دوغلاس وآخرون. سبق وصفها وسيلة لتفعيل Channelrhodopsin-2-معربا عن الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع الضوء الأزرق، انتزاع السلوك هروب 3. تستخدم نهجها عنصر محسن من الجين isl1 لدفع التعبير عن ChR2-EYFP في الخلايا العصبية الحسية الجسدية. هذا التحوير، ومع ذلك، أفادت التقارير لعرض مضان ضعيفة نسبيا، وتتطلب المشاركة في حقن مراسل الثاني، UAS GFP ::، للسماح التصور من الخلايا معربا عن ChR2-EYFP. وقد استخدم هذا النهج الحصول على ردود السلوك بين 24-48 HPF، ولكن لا يمكن أبدا أن استثارة رد فعل الماضي 72 HPF. وهكذا، في حين أن هذا الأسلوب يعمل لدراسة الدوائر العصبية في مراحل اليرقات في وقت مبكر جدا (24-48 HPF)، فإنه غير كاف لوصف الدوائر العصبية واستجابات سلوكية لدى كبار السن اليرقات، عند أكثر الاستجابات السلوكية المتنوعة واضحة والدوائر العصبية هي أكثر نضجا. سعينا إلىتحسين حساسية هذه التقنية من أجل تميز وظيفة الخلايا العصبية مجموعات سكانية فرعية RB اليرقات. لتحسين التعبير استخدمنا محسن الحسية الجسدية الخاصة (CREST3) 20 لطرد التعبير عن وبه lexa-VP16 امتداد تسلسل المشغل به lexa (4xLexAop) 11 لتضخيم التعبير عن قناة ضوء تنشيط الموسومة fluorescently. هذا التكوين تضخيم التعبير عن القناة، مما يلغي الحاجة لمشاركتها في التعبير عن مراسل الثاني والسماح لنا مباشرة لتحديد الوفرة النسبية للقناة في كل الخلايا العصبية. باستخدام تسلسل به lexa / LexAop كان ميزة إضافية تتمثل في السماح لنا لتقديم التحوير إلى خطوط مراسل الزرد التي تستخدم نظام Gal4/UAS. أدى هذا التعبير عابرة التحوير في مستويات مختلفة من التعبير، ولكن عادة ما كان قويا بما يكفي لتصور كل من جسم الخلية والتوقعات من الخلايا العصبية محواري الفردية على مدى عدة أيام. لتحسين sensitivإيتي إلى النور استخدمنا ضوء تنشيط قناة الشيف، وهو البديل channelrhodopsin يتألف من الوهم من channelopsin-1 (Chop1) وchannelopsin-2 (Chop2) مع موقع كروس في حلقة الحلزون EF 13. يتم تنشيط هذه القناة في نفس الطول الموجي ChR2، ولكنها تتطلب كثافة أقل للتنشيط ضوء، مما يجعلها أكثر حساسية من غيرها من القنوات شائعة الاستخدام، بما في ذلك ChR2. وتنصهر البروتين الشيف لبروتين فلوري الأحمر، tdTomato، مما يمكننا من فحص للتعبير البروتين دون تنشيط القناة. كمصدر الضوء، كنا الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة (DPSS) الليزر بالإضافة إلى كابل من الألياف البصرية لتقديم دقة، عالية القدرة نبض أزرق خفيف إلى منطقة محددة من اليرقات. هذا سمح لنا للتركيز ضوء الليزر على الخلايا العصبية الفردية، مما يلغي الحاجة لإيجاد الحيوانات المعدلة وراثيا نادرة معربا عن الخلايا العصبيه في قناة واحدة. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على تنشيط الخلايا العصبية RB واحدة، دون الإجابة السلوكيةق مع كاميرا الفيديو عالية السرعة، والصورة الخلايا العصبية المنشط بدقة عالية مع المجهري متحد البؤر.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> المواد </td></tr><tr><td> الزجاج ماصة باستور </td><td> الصياد </td><td> 1367820B </td><td> أو ما يعادلها (10-15 مم) </td></tr><tr><td> 200 ميكرومتر الألياف البصرية </td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> التصحيح الحبل، المدة: 3 متر، انهاء: FC / PC، نهاية B: FC / PC، سترات: FT030 </td></tr><tr><td> 50 ميكرومتر الألياف البصرية </td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> التصحيح الحبل، المدة: 3 متر، انهاء: FC / PC، نهاية B: FC / PC، سترات: FT030 </td></tr><tr><td> تجريد أداة للتعديل </td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td> أو ثلاثة هول أداة تجريد (FTS4) </td></tr><tr><td> الوتد الماس الكاتب </td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> المشتعلة / براون Micropipette بولير </td><td> سوتر الآلات </td><td> P-97 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> البورسليكات أنابيب الزجاج مع خيوط </td><td> سوتر الآلات </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> حقن القالب </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> الشكل 5 </td></tr><tr><td> 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي </td><td> أي </td><td> أي </td><td></td></tr><tr><td> طبق بتري (100x15 ملم) </td><td> أي </td><td> أي </td><td></td></tr><tr><td> طبق بتري (60x15 ملم) </td><td> أي </td><td> أي </td><td></td></tr><tr><td> ضغط حاقن </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> مياداة مجهرية والمعادن موقف </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> البلاستيك القابل للتصرف ماصات </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> لعبة البوكر (حامل دبوس دبوس والحشرات) </td><td> غرامة العلوم أدوات، وشركة </td><td> 26018-17 26000-70 و </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> ملقط الجراح </td><td> غرامة العلوم أدوات، وشركة </td><td> 11255-20 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> Microloader ماصة نصائح </td><td> إيبندورف </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5 ° C الحاضنة </td><td> أي </td><td> أي </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C الحرارة كتلة </td><td> أي </td><td> أي </td><td></td></tr><tr><td> غير معقمة شفرات المشرط رقم 11 </td><td> الأدوات العلمية الدقيقة، وشركة </td><td> 10011-00 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> تشريح قتغلب </td><td> زايس </td><td> STEMI </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> الفلورسنت نطاق تشريح مع فلتر القياسية </td><td> أي </td><td> أي </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> مبائر المجهر </td><td> زايس </td><td> 510 أو 710 LSM </td><td> أو ما يعادلها مع أهداف الليزر لGFP وطلب تقديم العروض، و10X، 20X 40X و </td></tr><tr><td> كاميرا عالية السرعة </td><td> AOS تكنولوجيز، وشركة </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> 473 نانومتر ليزر محمول </td><td> الكريستال الليزر </td><td> CL-473-050 </td><td> أو أعلى السلطة، مع خيار TTL </td></tr><tr><td> S48 محفز </td><td> استرو المتوسطية، آلات العشب شركة الانقسام </td><td> S48K </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> FC / PC لكم التزاوج FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td> شمال شرق مايوإد للاتصال الكابل البصري </td></tr><tr><td> الليزر السلامة نظارات </td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> لوحات الثقافة 24 </td><td> جينيسي </td><td> 25-102 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> الاكتئاب واحد الشرائح </td><td> الصياد </td><td> S175201 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف </td></tr><tr><td> الفورية المحيط </td><td> النظم البيئية المائية </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> الميثيلين الأزرق </td><td> الصياد </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td> سيجما </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> الاغاروز </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> انخفاض نذوب الاغاروز </td><td> سيجما </td><td> A9045 </td> &lt;TD&gt; أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> PTU </td><td> سيجما </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> سيجما </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> المياه الزرقاء / جنين </td><td></td><td></td><td> 10 L DDH 2 O 0،6 ز الفوري المحيط الميثيلين الأزرق 6 قطرات </td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td></td><td></td><td> (5 ملغ / مل في بوكل M 0.2) </td></tr><tr><td> 100X PTU </td><td></td><td></td><td> 0،150 ز PTU 50 مل DDH 2 O حل في 70 ° C، ويهز في كثير من الأحيان قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية </td></tr><tr><td> 1X PTU </td><td></td><td></td><td> 1 مل 100X PTU 99 مل أزرق / أسماك المياه </td></tr><tr><td> Tricaine الأسهم الحل </td><td></td><td></td><td> 400 ملغ tricaine 97،9 DDH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2،1 مل 1M تريس، pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;TD&gt; ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 ~ متجر في 4 ° C -20 ° C أو للتخزين على المدى الطويل </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

الزرد اليرقات تظهر كنموذج لوصف وضع وظيفة الدارات العصبية البسيطة. بسبب التسميد الخارجية، التطور السريع، والشفافية، وبشكل خاص مناسبة الزرد لنهج optogenetic للتحقيق الوظيفة العصبية الدائرة. في هذا النهج، يتم التعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء في الخلايا العصبية المحددة، مما يتيح للمجرب لتنشيط أو تثبيط لهم في الإرادة، وبالتالي مساهمتها في تقييم سلوكيات معينة. تطبيق هذه الأساليب في الزرد اليرقات المفهوم بسيط ولكنه يتطلب الاستفادة المثلى من التفاصيل التقنية. نحن هنا يبرهن على وجود إجراءات التعبير عن البديل channelrhodopsin في الخلايا العصبية الحسية الجسدية اليرقات الزرد، الصور تفعيل الخلايا واحدة، وتسجيل السلوكيات الناتجة عن ذلك. من خلال إدخال بعض التعديلات على أساليب المحددة سابقا، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة للحصول الاستجابات السلوكية واحدة من الخلايا العصبية تصل تنشيطعلى الأقل 4 أيام بعد الإخصاب (DPF). على وجه التحديد، أنشأنا التحوير باستخدام الخلايا العصبية الحسية الجسدية محسن، CREST3، لدفع التعبير عن المتغير channelrhodopsin الموسومة، الشيف، tdTomato. حقن هذا التحوير في الخلية 1-مرحلة الأجنة النتائج في التعبير في الخلايا العصبية الحسية الجسدية الفسيفساء، والتي يمكن تصويرها مع المجهري متحد البؤر. تحديد الخلايا في إلقاء الضوء على هذه الحيوانات مع ضوء ليزر من DPSS نانومتر 473، يسترشد من خلال كابل من الألياف البصرية، يثير السلوكيات التي يمكن تسجيلها مع كاميرا فيديو عالية السرعة وتحليلها كميا. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة السلوكيات التي تسببها تفعيل أي الخلايا العصبية الزرد. سوف يجمع هذا النهج مع الاضطرابات الوراثية أو الدوائية تكون وسيلة قوية للتحقيق في تشكيل الدوائر وظيفة.

<html><img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. تعيين ما يصل كابلات الالياف. (A) من الطبقات كابل من الألياف البصرية. (B) كابلات الألياف البصرية في عاري ماصة باستور. (C) وضع كابلات الالياف البصرية في ماصة باستور باستخدام مياداة مجهرية. <...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

جعلت من الممكن Optogenetic تقنيات لدراسة الخلايا العصبية مساهمة محددة لسلوك. وصفنا أسلوب في الزرد اليرقات الخلايا العصبية الحسية الجسدية لتفعيل واحدة تعبر عن البديل channelrhodopsin (الشيف) مع ليزر (DPSS) الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة وتسجيل السلوكيات أثار مع كاميرا فيديو عالية السرعة.

Optogenetic تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية اسماك الزرد باستخدام الشيف-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  University of California, Los Angeles. جعلت من الممكن Optogenetic تقنيات لدراسة الخلايا العصبية مساهمة محددة لسلوك. وصفنا أسلوب في الزرد اليرقات الخلايا العصبية الحسية الجسدية لتفعيل واحدة تعبر عن البديل channelrhodopsin (الشيف) مع ليزر (DPSS) الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة وتسجيل السلوكيات أثار مع كاميرا فيديو ع?...

Video: Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

استهداف الخلايا العصبية عن طريق الجمع بين البصلة الشمية في فيفو Electroporation وGal4 محسن المستندة إلى خطوط مصيدة اسماك الزرد

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

الحسية الجسدية الإمكانيات المتعلقة الحدث من الجلد فموي وجهي تمتد تحفيز

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

إطلاق مولر خلية التنشيط في تنكس الشبكية المستحثة بالليزر ونموذج التجديد في الزرد

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

تتبع السلوك المورفولوجية اليرقات في الاستجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك الخلايا العصبية حاسة الشم

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...