Ringraziamo Fumi Kubo, Tod Thiele e HerwigBaier (UCSF / Max-Planck-Institut) per un parere sulla sperimentazione dei comportamenti e di laser DPSS impostati; Heesoo Kim e Chiara Cerri dal Corso di MBL Neurobiologia per l&#39;assistenza nella Chef-tdTomato esperimenti; PetronellaKettunen (Università di Göteborg ) per la collaborazione iniziale di esperimenti optogenetic, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca e John Milligan (UCLA) per un parere tecnico, e Roger Tsien (UCSD) per il cuoco-tdTomato costruire. Questo lavoro è stato supportato da una (5F31NS064817) premio NRSA a AMSP e una borsa di studio dalla NSF (RIG: 0.819.010) ad AS.

Preparare la seguente prima del tempo. 1. Preparare Optic Cable <ol><li> Creare un contenitore per il cavo ottico fondendo il collo rastremata di una pipetta Pasteur di vetro su un becco Bunsen per creare un angolo di ~ 150 °. </li><li> Utilizzando un cutter filo o una lametta, tagliare con cautela il cavo ottico in due pezzi. Ogni pezzo deve avere una estremità con un FC / adattatore PC ed una estremità esposta. Conservare un pezzo come un cavo di riserva. </li><li> Spelare il cavo ottico verso il rivestimento rimuovendo la giacca fibre e le fibre di rinforzo (Figura 1A) da 5,0 centimetri di fine taglio del cavo. </li><li> Inserire il cavo ottico in preparato pipetta Pasteur. Assicurarsi cavo può facilmente muoversi dentro e fuori della punta della pipetta. </li><li> Con cavo ottico che sporge dalla punta della pipetta Pasteur, tagliare con attenzione e rimuovere rivestimenti in fibra di tutto in fibra di vetro, ~ 2 mm dal fine taglio. </li><li> Utilizzando una penna / vetro tagliatore di diamanti, nick la fibra di vetro e rompere off fine di creare un taglio netto / superficie alla fine della fibra (Figura 1B). </li><li> Ritrarre ottica in pipetta Pasteur per la conservazione. Ripetere il punto (1,6), se punta della fibra ottica viene tagliato o si rompe in modo non uniforme. </li><li> Cavo ottico in posizione pipetta Pasteur utilizzando un micromanipolatore (Figura 1C). </li></ol> Procedure 2-8 descrivono un metodo per l&#39;iniezione di transgeni in embrioni in generale da molti esperimenti zebrafish. Variazioni su questo metodo, come quelli descritti in altri video jove 6, 7, 8, 9, 22 sono ugualmente efficaci. 2. Tirare aghi da iniezione <ol><li> Utilizzando un estrattore ago, tirare tubi in vetro borosilicato in due aghi da iniezione con una punta gradualmente ridotta. Impostazioni Puller varia. (Su un estrattore ago Sutter Instruments usiamo impostazioni: P = 500, calore = 720, Pull = 50, = 70 Velocità e Tempo = 150). Ogni estrattore ago è diverso, quindi ottimizzare le impostazioni puller emempiricamente. Per ulteriori aghi conici, aumentare il calore e / o Pull. Per aghi meno conici, aumentare il tempo e / o Pull diminuzione. </li><li> Aghi Conservare in un contenitore sicuro (ad esempio una piastra di Petri con nastro laminato, fuori lato adesivo). </li></ol> 3. Versare stampi ad iniezione <ol><li> Sciogliere 0,5 g di agarosio in 30 ml embrione / acqua blu, fino agarosio si è completamente sciolto. </li><li> Versare in metà inferiore di una piastra di Petri. </li><li> Posizionare stampo rettangolare con montaggio pozzetti (Figura 2) in agarosio, facendo attenzione a limitare la formazione di bolle intorno ai pozzi. </li><li> Lasciare agarosio a solidificare. </li><li> Rimuovere stampo e riempire piastra di Petri con blu / acqua embrione. </li><li> Conservare in posizione verticale, riempita con acqua pulita, a temperatura ambiente per il giorno stesso o a 4 ° C per un uso futuro. </li></ol> 4. Fare Mix plasmide DNA per preparazioni iniettabili <ol><li> Diluire DNA plasmidico ad una concentrazione di 50 ng / ml con 1:10 rosso fenolo in DDH 2 O. PerEsempio: <table border="1"><tbody><tr><td> 1,0 ml </td><td> DNA plasmidico (250 ng / ml) </td></tr><tr><td> 0,5 ml </td><td> rosso fenolo </td></tr><tr><td> 3,5 ml </td><td> DDH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Mix DNA può essere conservato a temperatura ambiente se utilizzare immediatamente o conservato a 4 ° C per diversi giorni. </li></ol> 5. Impostare Coppie di accoppiamento Questo dovrebbe essere fatto la sera prima avete intenzione di fare iniezioni. <ol><li> Riempire vasche di allevamento con l&#39;acqua del sistema e luogo pesci di sesso maschile e femminile insieme. Se le iniezioni non può essere eseguita appena luci accende nella struttura, separata pesce maschio e femmina con un divisore. </li></ol> 6. Preparati per iniezioni (può essere fatto in attesa di embrioni) <ol><li> Accendere la pressione dell&#39;iniettore rig. Assicurarsi che il sistema è impostato su DC. Inizia con il set di durata dell&#39;impulso a 1. </li><li> Aprire la valvola AIR eRegolare la pressione iniettore a ~ 20 psi. </li><li> Utilizzando un ambito dissezione con il massimo ingrandimento, rompere punta dell&#39;ago con una pinza o un poker per creare un 2 micron di apertura ~ (Figura 3, Movie 1). </li><li> Riempire aghi con mix di DNA: 1. Posizionando il, lato punta dell&#39;ago in alto, nel mix DNA e lasciando l&#39;ago riempire per azione capillare o 2. Utilizzando un lungo raggiungere punta di pipettare 1-2 microlitri del DNA miscelare direttamente nell&#39;ago. </li><li> Luogo pieno ago in un luogo sicuro fino al momento di iniettare. </li></ol> 7. Raccogliere embrioni <ol><li> Dopo impianto luci si sono rivolti, rimuovere divisori (se applicabile). Raccogliere gli embrioni con un colino / setaccio piccolo e trasferirli in una capsula di Petri con blu dolce / acqua embrione. </li></ol> 8. Iniettare embrioni allo Stage cella 1-2 <ol><li> Trasferimento embrioni raccolti per stampi ad iniezione con una pipetta di plastica. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, spingere delicatamente embrioni inpozzetti con forcipe o un poker smussato (Figura 4, Movie 2). </li><li> Inserire l&#39;ago caricato in un micromanipolatore e la posizione più embrioni. </li><li> Calibrare volume di iniezione regolando la durata dell&#39;impulso di 1 step con incrementi fino a raggiungere il volume desiderato (~ 1 nl). Questo potrebbe essere tarato con un vetrino micrometrico, come descritto in un video precedenti Giove 8, 22, ma per questo esperimento precisione non è necessaria, poiché una vasta gamma di volumi di iniezione comporterà espressione adeguata. </li><li> Iniettare ~ 1 nl DNA miscelare direttamente nella cella e ripetere per tutti gli embrioni. DNA può anche essere iniettato nel tuorlo, ma tende ad essere meno efficiente (Figura 5, Movie 3). </li><li> Rimuovere gli embrioni iniettati da stampo con una leggera corrente di blu / acqua embrione. </li><li> Conservare iniettato embrioni a 28,5 ° C al buio. </li><li> Rimuovere non fecondate, gli embrioni morti o periodicamente. </li><li> Trattare embrioni with PTU tra 18-24 HPF per prevenire la pigmentazione. </li></ol> 9. Schermo per espressione del transgene <ol><li> Manualmente dechorionate 24-48 embrioni HPF con pinze. </li><li> Anestetizzare larve con 0,02% tricaine. </li><li> Utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione, identificare larve con RB o un&#39;espressione neurone trigeminale e trasferirli in un nuovo piatto fresco con PTU blu / embrione acqua. Embrioni con scarsa espressione in cellule facilmente identificabili sono ottimali, ma singoli neuroni saranno destinati per l&#39;attivazione di un cavo a fibre ottiche così un&#39;ampia gamma di densità espressione è accettabile. </li><li> Embrioni Conservare a 28.5 ° C al buio fino a quando desiderato fase sperimentale. </li></ol> 10. Montare larve per esperimenti di comportamento <ol><li> Fai 1,5% bassa fusione agarosio in DDH 2 O e conservare in un blocco termico 42 ° C per evitare che la solidificazione. </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, trasferimento uno dei pre-screening larve in una vascae del 1,5% di agarosio a bassa fusione con un minimo di blu / embrione acqua possibile. </li><li> Trasferire larve in una goccia di agarosio su una piccola scatola di Petri. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, posizione larva fino dorsale. </li><li> Quando agarosio si è solidificato, tagliare via la agarosio con una lama di rasoio sottile (bisturi # 11), lasciando un cuneo di agar intorno alla larva intera. </li><li> Fare due tagli diagonali ai lati del tuorlo, prendere attenzione a non intaccare la larva. </li><li> Riempire l&#39;area circostante l&#39;agarosio con embrione / acqua blu. </li><li> Tirare agarosio lontano dal tronco e coda della larva (Figura 6). </li></ol> 11. Preparare ad alta velocità della fotocamera e software di imaging <ol><li> Montare ad alta velocità, fotocamera sulla dissezione portata. </li><li> Collegare la fotocamera al computer. </li><li> Accendere il computer. </li><li> Attiva telecamera ad alta velocità. </li><li> Apri video / software di imaging (Usiamo software di imaging AOS e descrivere le procedure per l&#39;utilizzo di qui, ma imagingIl software è ugualmente accettabile). </li><li> Regolare le impostazioni della fotocamera di conseguenza (vale a dire 1.000 fotogrammi al secondo (fps), tampone di trigger 50% o altre impostazioni preferite). </li><li> Avviare la registrazione. </li></ol> 12. Attivare singoli neuroni con un laser 473 nm <ol><li> Allega stimolatore, laser e ottica. </li><li> Accendere stimolatore. </li><li> Impostare stimolatore ad un massimo di 5 volt e una durata di impulso di 5 msec. </li><li> Accendere il laser secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Utilizzare un microscopio da dissezione per posizionare la punta del cavo ottico vicino al corpo cellulare di un neurone con lo chef-tdTomato espressione (Figura 6). </li><li> Consegnare impulso di luce blu per attivare neurone sensoriale. </li><li> Record comportamento utilizzando un telecamera ad alta velocità fissato a 500 o 1.000 fotogrammi al secondo. </li><li> Ripetere esperimento come desiderato, in attesa 1 minuto tra ogni attivazione per evitare assuefazione. (Si registra un minimo di tre risposte per ogni neurone). </li><li> Alarve di rilascio, indagare separatamente agarosio con una pinza, facendo attenzione a non ferire l&#39;animale. Questo animale può essere consentito di sviluppare ulteriormente e la procedura può essere ripetuta in una fase precedente per caratterizzare sviluppo del comportamento. L&#39;embrione può anche essere rimontato per alta risoluzione confocale della cella attivata per correlare il comportamento con struttura cellulare, come descritto di seguito. </li><li> Trasferimento larva di piastra di coltura con il blu dolce / acqua embrione. Usiamo una piastra a 24 pozzetti per tenere traccia delle larve individuale. </li></ol> 13. Immagine Neuron (s) con un microscopio confocale <ol><li> Anestetizzare larve con 0,02% tricaine. </li><li> Monte larve, dorso alto, in basso fuso 1,2% agarosio o in uno stampo dorsale. </li><li> Immagine chef-tdTomato neuroni con un laser a 543 nm e filtro equo ed obiettivo. Usiamo un obiettivo 20x. </li><li> Rimuovere larve di agarosio e tornare al benessere individuale con il blu / acqua embrione. </li><li> Conservare a 28.5 ° C al buio per il further analisi. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Abbiamo descritto un approccio per l&#39;attivazione dei neuroni optogenetic RB singole in zebrafish vivo. Il nostro metodo utilizza transgenesi transitoria per esprimere una variante fluorescente tag channelrhodopsin, chef-tdTomato 13, in specifici neuroni somatosensoriali. Questo approccio potrebbe essere facilmente adattato per l&#39;uso nelle popolazioni larvali zebrafish altre cellule. Utilizzando questo approccio abbiamo costantemente suscitato risposte comportamentali 34-48...

Lo sviluppo di metodi optogenetic per promuovere o inibire l&#39;eccitabilità neuronale con lunghezze d&#39;onda definite di luce ha permesso di studiare la funzione di distinte popolazioni di neuroni nei circuiti neurali che controllano il comportamento 1, 19, 21. Questa tecnica viene spesso utilizzato per attivare gruppi di neuroni, ma può anche essere utilizzato per attivare i singoli neuroni. Larve Zebrafish sono particolarmente suscettibili di questi metodi in quanto sono trasparenti, il loro sistema nervoso si sviluppa rapidamente, e la creazione di animali transgenici è veloce e di routine. Tuttavia, notevoli ostacoli tecnici da superare per ottenere l&#39;attivazione affidabile singolo neurone. Per ottimizzare la procedura per l&#39;attivazione dei neuroni optogenetic zebrafish singoli, ci siamo concentrati sui neuroni somatosensoriali. Larve Zebrafish rilevare una varietà di stimoli somatosensoriali con due popolazioni di neuroni: i neuroni del trigemino, che innervano la testa, e ROHON-Beard (Rb) neuroni che innervano il resto del corpo. Ogni neurone trigeminale e RB proietta un assone periferico che si dirama lungo in pelle di individuare stimoli e un assone centrale che si connette a valle circuiti neurali. Animali risponde al tocco Già il 21 ore post-fecondazione (HPF), indicando che i circuiti coerenti somatosensoriali si sono formati 5, 18. Durante lo sviluppo larvale, almeno un po &#39;di sinapsi del trigemino e RB neuroni sulla cellula di Mauthner di attivare risposte di fuga classici, ma accumulando evidenza suggerisce che ci sono più classi di neuroni somatosensoriali con diversi modelli di connettività che possono suscitare variazioni sul comportamento di fuga 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. La motivazione per lo sviluppo di questo metodo è di caratterizzare la funzione del comportamento di diverse classi di neuroni somatosensoriali, ma questo approccio potrebbe in linea di principio essere usato per studiare la funzione del neurone o qualsiasi popolazione di neuroni in larval zebrafish. Douglass et al. Precedentemente descritto un metodo per l&#39;attivazione channelrhodopsin-2-esprimono neuroni somatosensoriali con luce blu, suscitando comportamento di fuga 3. Il loro approccio utilizzato un elemento enhancer del gene isl1 per guidare l&#39;espressione di CHR2-EYFP nei neuroni somatosensoriali. Questo transgene, tuttavia, è stato segnalato per visualizzare fluorescenza relativamente debole, richiedendo co-iniezione di un secondo reporter, UAS :: GFP, per permettere la visualizzazione di cellule esprimenti CHR2-EYFP. Questo approccio è stato utilizzato per ottenere risposte comportamentali tra 24-48 HPF, ma non potrebbe mai ottenere una risposta Dopo 72 HPF. Così, mentre questo metodo funziona per studiare circuiti neurali nelle fasi larvali molto precoci (24-48 HPF), è inadeguato per la caratterizzazione di circuiti neurali e le risposte comportamentali in età superiore larve, quando più risposte diverse comportamentali sono evidenti e circuiti neurali sono più maturi. Abbiamo cercato dimigliorare la sensibilità di questa tecnica per caratterizzare la funzione delle sottopopolazioni di neuroni RB larvali. Per migliorare l&#39;espressione abbiamo utilizzato un somatosensoriale-specifico enhancer (CREST3) 20 per guidare l&#39;espressione di LexA-VP16 e un tratto di sequenze operatore lexA (4xLexAop) 11 per amplificare l&#39;espressione di una fluorescenza etichettato fotoattivabile canale. Questa configurazione amplificato espressione del canale, eliminando la necessità di co-esprimere un secondo reporter e che ci permette di determinare direttamente l&#39;abbondanza relativa del canale in ogni neurone. Utilizzando il LexA / LexAop sequenza avuto l&#39;ulteriore vantaggio di consentire di introdurre il transgene in linee reporter di zebrafish che utilizzano il sistema Gal4/UAS. Espressione transitoria di questo transgene portato a diversi livelli di espressione, ma di solito era abbastanza robusto per visualizzare sia il corpo cellulare e le proiezioni assonali dei singoli neuroni per diversi giorni. Per ottimizzare la sensibilitàlità alla luce abbiamo usato la luce attivata canale chef, una variante channelrhodopsin costituito da una chimera di channelopsin-1 (Chop1) e channelopsin-2 (Chop2) con un sito di crossover a elica ciclo EF 13. Questo canale è attivato alla stessa lunghezza d&#39;onda CHR2, ma richiede una minore intensità di luce per l&#39;attivazione, il che rende più sensibili di altri canali comunemente utilizzati, compresi CHR2. La proteina chef era fusa alla proteina fluorescente rossa, tdTomato, che ci permette di selezionare per l&#39;espressione della proteina senza attivare il canale. Come sorgente luminosa, abbiamo utilizzato un diodo pompato a stato solido (DPSS) laser accoppiato ad un cavo in fibra ottica per fornire una precisa, potente impulso di luce blu per una regione specifica delle larve. Questo ha permesso di concentrare la luce laser sui neuroni individuali, eliminando la necessità di trovare rare animali transgenici che esprimono il canale in un singolo neurone. Usando questo approccio, siamo stati in grado di attivare i neuroni RB singoli, registrare risposta comportamentales con una telecamera ad alta velocità video e immagine i neuroni attivati ​​ad alta risoluzione con microscopia confocale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiale </td></tr><tr><td> Vetro pipetta Pasteur </td><td> Pescatore </td><td> 1367820B </td><td> o equivalente (10-15 mm di diametro) </td></tr><tr><td> 200 micron fibra ottica </td><td> Thorlabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patch cord, Lunghezza: 3 m, Fine A: FC / PC, End B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Fibra da 50 micron ottica </td><td> Thorlabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patch cord, Lunghezza: 3 m, Fine A: FC / PC, End B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Regolabile Stripping Tool </td><td> Thorlabs </td><td> AFS900 </td><td> o tre fori Stripping Tool (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamante Wedge scriba </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipetta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Tubi di vetro borosilicato con filamento </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Iniezione stampo </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Figura 5 </td></tr><tr><td> Centrifuga da 1,5 ml provette </td><td> Qualsiasi </td><td> Qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> Petri (100x15 mm) </td><td> Qualsiasi </td><td> Qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> Petri (60x15 mm) </td><td> Qualsiasi </td><td> Qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> Pressione iniettore </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Micromanipolatore e metallo cavalletto </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Pipette di plastica usa e getta </td><td> FISHERBRAND </td><td> 13-711-7 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Poker (supporto del perno e perno Insect) </td><td> Bene Scienza Strumenti, Inc. </td><td> 26018-17 e 26000-70 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Bene Scienza Strumenti, Inc. </td><td> 11255-20 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Microloader puntali per pipette </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5 ° C incubatore </td><td> qualsiasi </td><td> qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C di calore di blocco </td><td> Qualsiasi </td><td> Qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> Lame di bisturi non sterili # 11 </td><td> Belle Strumenti Scientifici, Inc. </td><td> 10011-00 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Dissezione sfar fronte </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Fluorescente portata dissezione con filtro standard </td><td> Qualsiasi </td><td> qualsiasi </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 o 710 </td><td> o obiettivi equivalenti con i laser per la GFP e RFP, e 10x, 20x e 40x </td></tr><tr><td> Ad alta velocità della fotocamera </td><td> AOS Technologies, Inc. </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> 473 nm laser portatile </td><td> Cristallo laser </td><td> CL-473-050 </td><td> o potenza superiore, con opzione TTL </td></tr><tr><td> S48 Stimolatore </td><td> Astro-Med, Inc. Grass divisione strumento </td><td> S48K </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> FC / PC FC / PC manicotto di accoppiamento </td><td> Thorlabs </td><td> ADAFC1 </td><td> Maggio need per il collegamento del cavo ottico </td></tr><tr><td> Sicurezza laser Occhiali </td><td> Thorlabs </td><td> LG10 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> 24 piastre di coltura </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Diapositive depressione singoli </td><td> Pescatore </td><td> S175201 </td><td> O equivalente </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Istantanea oceano </td><td> Ecosistemi acquatici </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Blu di metilene </td><td> Pescatore </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Low Melt agarosio </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; o equivalente </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> blu acqua / embrione </td><td></td><td></td><td> 10 L DDH 2 O 0,6 g istantanea Ocean 6 gocce di blu di metilene </td></tr><tr><td> rosso fenolo </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml in 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml DDH 2 O sciogliere a 70 ° C, agitare spesso aliquota e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml blu / pesci d&#39;acqua </td></tr><tr><td> Tricaine soluzione stock </td><td></td><td></td><td> 400 mg tricaine 97,9 DDH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml 1M Tris, pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; aggiustare il pH a ~ 7.0 negozio a 4 ° C o -20 ° C per una conservazione a lungo termine </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Zebrafish larvali stanno emergendo come modello per descrivere lo sviluppo e la funzione di semplici circuiti neurali. Grazie alla loro fecondazione esterna, rapido sviluppo, e la traslucenza, zebrafish sono particolarmente adatti per gli approcci optogenetic indagare funzione neurale circuito. In questo approccio, fotosensibili canali ionici sono espressi in neuroni specifici, consentendo lo sperimentatore per attivare o inibire a volontà e quindi valutare il loro contributo a specifici comportamenti. L&#39;applicazione di questi metodi in zebrafish larvale è concettualmente semplice, ma richiede l&#39;ottimizzazione dei dettagli tecnici. Qui mostriamo una procedura per esprimere una variante channelrhodopsin in larve di zebrafish neuroni somatosensoriali, singole cellule foto-attivazione, e la registrazione dei comportamenti che ne derivano. Introducendo alcune modifiche ai metodi precedentemente stabiliti, questo approccio può essere utilizzato per ottenere risposte comportamentali da singoli neuroni attivati ​​finoad almeno 4 giorni dopo la fecondazione (DPF). In particolare, abbiamo creato un transgene con un neurone somatosensoriale enhancer, CREST3, per guidare l&#39;espressione del tag channelrhodopsin variante, lo chef-tdTomato. Iniettando questo transgene in 1-cell risultati embrioni allo stadio di espressione mosaico nei neuroni somatosensoriali, che può essere ripreso con microscopia confocale. Illuminante identificato le cellule di questi animali con la luce di un laser 473 nm DPSS, guidati attraverso un cavo in fibra ottica, suscita comportamenti che possono essere registrati con una telecamera ad alta velocità e video analizzati quantitativamente. Questa tecnica potrebbe essere adattato per i comportamenti di studio suscitato attivando ogni neurone zebrafish. La combinazione di questo approccio con perturbazioni genetiche o farmacologici sarà un potente strumento per studiare la formazione di circuiti e la funzione.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Cavo ottico impostato. (A) Livelli di un cavo in fibra ottica. (B) cavo in fibra ottica in Stripped una pipetta Pasteur. (C) del cavo in fibra ottica in pipetta Pasteur posizionata utilizzando un micromanipolatore. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Iniezione stampo m...

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic tecniche hanno permesso di studiare il contributo dei neuroni specifici comportamenti. Descriviamo un metodo in zebrafish larvale per l&#39;attivazione di singoli neuroni somatosensoriali che esprimono una variante channelrhodopsin (Chef) con un diodo-pompato allo stato solido (DPSS) laser e registrare i comportamenti suscitate con una telecamera ad alta velocità video.

Attivazione Optogenetic di zebrafish neuroni somatosensoriali con Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  University of California, Los Angeles. Optogenetic tecniche hanno permesso di studiare il contributo dei neuroni specifici comportamenti. Descriviamo un metodo in zebrafish larvale per l'attivazione di singoli neuroni somatosensoriali che esprimono una variante channelrhodopsin (Chef) con un diodo-pompato allo stato solido (DPSS) laser e registrare i comportamenti suscitate con una telecamera ad alta velocità video.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

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Neuroscienze

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Optogenetic Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Optogenetic risonanza magnetica funzionale

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

Potenziali evento-correlati somatosensoriali da Pelle Orofacial Stretch Stimolazione

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...