لذلك يمكننا هذا البروتوكول من الحث على انتقالات المرحلة المرضية من TDP-43 ومعالجة عواقبها الخلوية في الخلايا العصبية الحركية الشوكية في الجسم الحي ، وهو أمر وثيق الصلة لفهم لماذا تتدهور الخلايا العصبية الحركية في ALS. نظرا للشفافية العالية ليرقات حمار وحشي ، فإن الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي مرئية مباشرة. لذلك يمكن للمرء أن يتصور السلوك الديناميكي ل TDP-43 التي تمر بمرحلة انتقالية في الخلايا العصبية الحركية الشوكية الفردية.
تقدم هذه الطريقة نموذجا حيواني جديدا ل ALS. ونحن نعتقد أن أي طريقة يمكن أن تمنع انتقال المرحلة TDP-43 الناجمة عن الضوء والتجميع في هذا النموذج ALS قد يكون مرشحا محتملا للعلاج ALS. يمكن التعبير عن البروتينات الأخرى ذات الصلة ALS مع المناطق المضطربة في جوهرها لاستكشاف السمية العصبية المرتبطة التحولات مرحلة غير طبيعية.
مفتاح النجاح في هذا النهج هو التعبير عن TDP-43 البصرية في الخلايا العصبية الحركية الشوكية على المستوى غير التكسيني. BAC transgenesis هي خطوة تستغرق وقتا طويلا، ولكن بمجرد إنشاء الأسماك المعدلة وراثيا السليم، والخطوات التالية هي أسهل نسبيا ومباشرة. للبدء، قم بتشغيل الصمام الثنائي الباعث للضوء، أو لوحة LED، باستخدام التطبيق المرتبط المثبت على جهاز لوحي أو هاتف.
بعد ذلك ، ضع مسبار الطيف في بئر فارغ من طبق من 6 آبار. ثم باستخدام التطبيق، وضبط ضوء LED إلى الطول الموجي تبلغ ذروتها في 456 نانومتر. ضع المستشعر البصري لمتر الطاقة البصرية في البئر الفارغ واضبط قوة ضوء LED.
ثم ضع الطبق مع إعداد لوحة LED في حاضنة في 28 C.For تصوير يرقات أسماك الحمار الوحشي التي تعبر عن TDP-43 optogenetic ، وإزالة الكورونات من الأسماك ذات المعدلات المزدوجة وتخديرها في المخزن المؤقت E3 الذي يحتوي على 250 جرام / مل من Tricane. بعد ذلك، سخني 1٪ درجة حرارة ذوبان منخفضة agarose تحتوي على 250 غرام / مل من الإيثيل 3-أمينوبنزوات ميثانسولفونات في 42 C.Then وضع قطرة من الآغاروز على طبق قاعدة الزجاج. يجب أن يكون قطر قطر قطرة الآجروز على شكل قبة على الطبق الزجاجي من 8 إلى 10 ملم.
بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور ، أضف السمك المخدر إلى الآغاروز على الطبق القائم على الزجاج. تقليل كمية المخزن المؤقت E3 المضافة إلى agarose جنبا إلى جنب مع الأسماك. ثم، مزيج عن طريق الأنابيب عدة مرات.
أثناء تجسيد الآغاروز ، حافظ على السمك على جانبه باستخدام إبرة حقنة ، بحيث يكون الحبل الشوكي في وضع أفقي مناسب. بعد أن توطدت agarose، إضافة بضع قطرات من العازلة E3 على الأسماك على شكل قبة agarose محمولة. باستخدام المجهر confocal مجهزة 20 مرة الغمر المياه الهدف العدسة، والحصول على سلسلة confocal z-أقسام من الحبل الشوكي.
وتشمل كلوكا على الجانب البطني من الأسماك في المناطق ذات الاهتمام كمرجع لتحديد ومقارنة شرائح العمود الفقري عبر النقاط الزمنية. بمجرد اكتمال التصوير، استخدم إبرة حقنة لكسر الآغاروز بعناية وإزالة السمك من الآغاروز. الحفاظ على مقدار الوقت الذي يتم تضمين الأسماك في الآغروز قصيرة قدر الإمكان، على الرغم من أن تضمين agarose لمدة تقل عن 30 دقيقة لا يؤثر على صلاحية الأسماك.
إضافة 7.5 مل من العازلة E3 إلى بئر واحد من طبق 6-جيدا ووضع الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة المصورة في هذا البئر. ثم ضع الطبق على لوحة LED، مع الحفاظ على تميز الطبق ولوحة LED 5 مم مع فاصل، ثم قم بتشغيل ضوء LED الأزرق. احتفظ ببعض الأسماك المعدلة وراثيا المزدوجة في طبق منفصل من 6 آبار مغطى بورق الألومنيوم لأسماك التحكم غير المحلاة.
بعد وقت الإضاءة المطلوب، صورت الحبل الشوكي للأسماك مضيئة كما هو موضح في وقت سابق. تم تصور نقل السيتوبلازمية من opTDP-43h في الخلايا العصبية الحركية الشوكية واحدة عن طريق فصل الصور Z-سلسلة المكتسبة في 48. و 72 ساعة بعد الإخصاب في كل قناة EGFP-TDP-43z و opTDP-43h.
من صور الإسقاط أقصى كثافة من EGFP-TDP-43z، خلية عصبية واحدة معزولة العمود الفقري يمكن التعرف عليها في كل من 48. و 72 ساعة بعد الإخصاب تم اختيارها. تم تعيين المناطق ذات الاهتمام التي تغطي سوماس الخلايا العصبية الحركية عن طريق تتبع حافة إشارة EGFP في 48.
و 72 ساعة بعد الإخصاب. تم رسم كثافة الفلورسنت العادية على طول المحور الرئيسي للسما. وبعد 48 ساعة من الإخصاب، تداخلت أنماط كلا الإشرتين إلى حد كبير.
وعلى النقيض من ذلك، في 72 ساعة، تم العثور على ذروة إشارة opTDP-43h في المنطقة حيث كانت إشارة EGFP-TDP-43z منخفضة، مما يشير إلى نقل السيتوبلازمي opTDP-43h. لقياس إشارات opTDP-43h و EGFP-TDP-43z قبل وبعد تحفيز الضوء الأزرق ، تم إنتاج بعض صور الإسقاط شرائح لكل قناة من نفس الصور Z-سلسلة في 48. و 72 ساعة بعد الإخصاب.
من بين الخلايا الأربع mnr2b+التي تم التحقيق فيها، عرضت الخلية 1 بشكل خاص إشارة EGFP-TDP-43z المشبعة. تم حساب المبالغ النسبية من opTDP-43h إلى EGFP-TDP-43z بقسمة قيمة RFP على قيمة GFP. الخلايا 2 إلى 4 عرض انخفاض مستويات opTDP-43h بعد إضاءة الضوء الأزرق.
من المهم تقليل الوقت الذي يتم تضمين الأسماك في الآغروز للحفاظ على صحتهم. من خلال ضبط كثافة ومدة إضاءة LED ، نتحكم في انتقال مرحلة TDP-43 بطريقة منظمة مؤقتة ، والتي يمكن أن تساعد في تشريح تطور انتقال مرحلة TDP-43 المرضية في الخلايا العصبية الحركية.
