الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر داولنغ (آرون Reifler، ترينت وو، أنجيلا بوستا، ويليام تيلفر) التي ساهمت في تطوير تقنية وإنتاج المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد توبمان، وقسم طب الأطفال في جامعة ميشيغان، وفي جزء من المنح المقدمة من جمعية الضمور العضلي (JJD MDA186999) والمعاهد الوطنية للصحة (JJD 1K08AR054835).

1. Coverslips إعداد بولي يسين المغلفة L-(الوقت: 1 ساعة) coverslips طلاء يسمح لتسوية ليف عضلي السريع والتصاق. هذا يمكن أداؤها أثناء الخطوة تفكك العزلة ليف عضلي (الخطوة 2 أدناه). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ووضع Parafilm على الجزء السفلي من 60 ملم طبق بتري (أي علامة تجارية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع زلات غطاء زجاجي المجهر (12 مم) على Parafilm في 60 ملم الأنسجة صحن الثقافة أو وضعها بشكل فردي في الآبار واحد من 24 لوحات جيدة. </li></ol> ملاحظة 1: هذه coverslips جولة صغيرة تساعد على التركيز أرقام ليف عضلي والحد من استخدام الأجسام المضادة الزائدة. ملاحظة 2: سوف coverslips غيرها من حجم العمل، ومع ذلك، فإن كميات الكواشف والأجنة المستخدمة هناك حاجة الى تعديلها وفقا لذلك. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 50-200 ميكرولتر من بولي-L-يسين حل (0.01٪) على كل غطاء زجاجي في طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لل coverslips للجلوس واحد على الأقل حواور في 37 درجة مئوية. وسوف تعد حضانات لا تؤثر سلبا النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بولي-L يسين حل من غطاء زجاجي ويغسل مرتين مع حد أدنى من 100 برنامج تلفزيوني 1X ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح coverslips لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips هي الآن جاهزة للmyofibers. </li></ol> ملاحظة 3: لضمان العقم، ويمكن أن يتم طلاء في غطاء وcoverslips على تعقيمها. ملاحظة 4: حافظ على طبق بتري 60 ملم مع parafilm في القاع. سيتم استخدام هذا الإعداد أثناء ليف عضلي الطلاء وimmunolabeling (في وقت لاحق الخطوات). البديل 1: بدلا من طلاء coverslips مباشرة قبل الاستخدام، ويمكن استخدام الأوراق المالية ساترة المغلفة. طبق بيتري 60 ملم تحتوي على ما لا يقل عن 2 مل بولي-L-يسين يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تحتوي على العديد من coverslips. مع هذا البديل بدء في الخطوة 1.5 لمعالجة لل coverslips لmyofibers. البديل 2: نحن أيضا coverslips معطف في بولي-L-الأورنيثين. Tله أكثر كثيفة العمالة، ولكن من المفيد للزراعة على المدى الطويل لأن coverslips المغلفة بولي-L-الأورنيثين يمكن أن يكون للأشعة فوق البنفسجية المعالجة. مع العلاج بالأشعة فوق البنفسجية وتقنية معقمة حذرا myofibers الحية يمكن عادة أن يستمر في الثقافة من 4-7 أيام. 2. تفكك الزرد الأجنة وتصفيح من Myofibers (الوقت: 1-3 ساعة) ملاحظة: بروتوكول قياسي ينطبق أفضل ل3 DPF (الإخصاب أيام آخر) الأجنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة الزرد إلى مستوى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وإزالة الكثير من أسماك المياه الزائدة وقت ممكن. عادة، 10-20 الأجنة في أنبوب، وإن كان أقل يمكن استخدامها. باستخدام أكثر من 20-25 الأجنة في كثير من الأحيان يؤدي إلى إعداد الكثافة المفرطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة chorions قبل التفكك، يدويا باستخدام ملقط # 5. بدلا من ذلك، ويتحقق إزالة المشيماء الكيميائية مع 10-15 دقيقة Pronase العلاج. عادة، لا بد من إزالة السابقة من المشيمه فقط عند تأكيد مسبق من موتمطلوب النمط الظاهري النمل أو التشكل، أو عند استخدام مراحل حيث يتم فقس الأجنة بشكل طبيعي من المشيماء بهم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900 ميكرولتر من CO 2 وسائل الإعلام المستقلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من نوع كولاجيناز الثاني والنهائي تركيز 3.125 ملغ / مل (حل الأسهم في كولاجيناز 31.25 ملغ / مل مخففة في برنامج تلفزيوني 1X) لبدء التفكك. ويمكن أيضا أن تستخدم كولاجيناز الرابع لتفارق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الأجنة على شاكر المداري، ويسحن كل 30 دقيقة في RT باستخدام P1000 Pipetman للسحن. </li></ol> ملاحظة 2: مراقبة الجنين بعناية التفكك؛ فوق أو تحت التفكك (وخاصة فوق) هي الأسباب الأكثر شيوعا لفشل البروتوكول. سوف تختلف مرات للهضم اعتمادا على شدة سحن، عدد الأجنة في الأنبوب، والعمر الأجنة. كما أنها غالبا ما تكون أقل (بالمقارنة مع أنواع البرية) لأجنة من المسوخ العضلات والهيكل العظمي. مذكرة3: متوسط ​​زمن الهضم في سن الجنين: 1 DPF = 1 ساعة، 2 DPF = 1.5 ساعة، 3 DPF = 2 ساعة، و 4 DPF = 2-2.5 ساعة. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف الهضم عندما لا الأجنة كلها واضحة، ولكن القطع الصلبة لا تزال مرئية - وهذا أمر ضروري لمنع overdigestion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي مع الأجنة فصلها في 0،8-2،3 x ج لمدة 3-5 دقيقة لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من الخلايا مكعبات وغسل 2X مع CO 2 وسائل الإعلام المستقلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة جديدة CO 2 وسائل الإعلام المستقلة ل resuspend الخلايا. 1 عادة ما تستخدم لمحضرات مل من 10-20 الأجنة. يمكن تحجيم حجم يعتمد على عدد الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة P1000، يمر الجنين تعليق من خلال مرشح 70 ميكرون. هذا يساعد على إزالة الحطام غير المرغوب فيها من الإعدادية. </li></ol> ملاحظة 4: تعليق الأجنة يمكن أن تتم تصفيته للمرة الثانية خلال مرشح 40 ميكرون إلى مزيد من إزالة الحطام غير المرغوب فيها. من الترشيح المزدوج، والانتعاش هو approximately 800 ميكرولتر من حجم ابتداء من 1 مل. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حوالي 50-100 ميكرولتر من ليف عضلي التعليق على كل بولي-L-يسين المغلفة ساترة. </li></ol> ملاحظة 5: نفذ الخطوة 2.9 في أطباق بتري مع parafilm على الجزء السفلي، الذي أعد سابقا. وParafilm تحافظ على تعليق ليف عضلي من يلوذ بالفرار لل coverslips المغلفة. الحفاظ على أطباق بتري مغطاة لمنع التبخر. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح myofibers لتسوية ما يقرب من 1 ساعة على لل coverslips المغلفة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> ملاحظة 6: ستبدأ Myofibers لتسوية في غضون 5-10 دقيقة. ومع ذلك، لمرفق ليف عضلي جيد، فمن المستحسن الحد الأدنى من 1 ساعة (1-2 ساعة). وسوف يسمح myofibers لتسوية لفترة أطول لا تضر الإعدادية. للحضانات أطول (بما في ذلك بين عشية وضحاها)، والمضادات الحيوية يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام. مع المضادات الحيوية وتقنية معقمة الثقافات الحية يمكن عادة أن يستمر لمدة 1-2 أيام. <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحية مyofibers يمكن ملاحظتها عند هذه النقطة. Myofibers من أجنة DPF 2 وبعد ذلك سوف ينظر إليها على أنها خلايا مخططة وممدود (الشكل 1). عند هذه النقطة، myofibers هي الآن جاهزة للتحليل حية أو لimmunolabeling. </li></ol> ملاحظة 7: العضلات الهيكلية من 1 DPF الأجنة لا لوحة ألياف كما ممدود ومخططة بشكل واضح. بدلا من ذلك، myoballs كبيرة مرئية. بالإضافة إلى ذلك، خلال آخر مرحلة التفكك التكوير (الخطوة 2.6)، 1 DPF بحاجة myoballs إلى أن طرد لمدة لا تقل عن 8 دقائق في 5،000 x ج لتحقيق بيليه. لتحليل الأجنة في هذه المرحلة، فمن المستحسن لاستخدام خط المعدلة وراثيا معربا عن EGFP تحديدا في العضلات والهيكل العظمي 23. وهذا سوف يسمح تحديد الخلايا من أصل العضلات مقابل مصادر أخرى. 3. مضان المناعية من تنفصل الزرد Myofibers (الوقت: حوالي 1 اليوم) 3.1. Immunolabeling <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزء منوسائل الإعلام من myofibers انضمت إلى ساترة المغلفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ أو الميثانول. لمنهاج العمل، وإزالة ½ حجم وسائل الإعلام واستبدالها مع نفس الكمية من PFA. إصلاح لمدة 10 دقيقة في RT، ثم إزالة الحجم الإجمالي، مع استبدال 50-100 ميكرولتر من PFA، وإصلاح لمدة 10 دقيقة إضافية. يمكن لتثبيت الكحول، والميثانول الجليد الباردة أو الأسيتون تطبيقها في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو 5 دقائق، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل myofibers ما لا يقل عن 3-5X مع برنامج تلفزيوني 1X أو برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى 0.1٪ توين. متوسط ​​حجم غسل هو 50-100 ميكرولتر في ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عرقلة الحل myofibers (الأسهم العمل)، واحتضان 20-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سوف عرقلة الحل تختلف اعتمادا على الأجسام المضادة الأولية والثانوية. وهما الأكثر شيوعا التي تستخدم في المختبر هي (1) برنامج تلفزيوني 1X، 2 ملغ / مل جيش صرب البوسنة، 1٪ مصل الأغنام، 0.25٪ تريتون X-100 والنهائي (2) 0.2٪ تريتون X-100، 2 ملغ / مل (0.2 ٪ BSA) و 5٪ مصل الأغنام / الماعز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عرقلة الحل وإضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في إما بتأمين حل أو برنامج تلفزيوني. احتضان myofibers بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد إما Parafilm أو التفاف ساران التفاف في طبق بتري تحتوي لل coverslips محملة ليف عضلي المغلفة مع الأجسام المضادة. يمكن إضافة قطع صغيرة من منشفة ورقية مبللة لإنشاء غرفة ترطيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الأولية من coverslips وغسل coverslips 3-5X لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني أو حل حظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة الثانوية في التركيز المناسب مخففة في برنامج تلفزيوني 1X أو عرقلة الحل لمدة 1-2 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل myofibers 3-5X في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل في RT. </li></ol> 3.2. coverslips تصاعد <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 1-2 قطرات من كاشف antifade إلى شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيك اب بعناية ساترة المغلفة وimmunolabled باستخدام ملقط ومكان (myofibers أسفل) ساترة على كاشف antifade على شريحة المجهر. </li></ol> ملاحظة 1: الانتباه إلى التوجه للجساترة oated أمر بالغ الأهمية. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1-2 Kimwipes على سطح صلب الثابت. عكس بسرعة الشريحة مع لل coverslips المغلفة يستريح على كاشف antifade ووضعه (ساترة لأسفل) على Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الضغط الخفيف إلى زوايا الشريحة المجهر لإزالة antifade الزائدة وتشكيل ختم ضيق بين الشرائح وساترة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للantifade المتبقية لتجف لمدة 5-10 دقائق على RT، ثم myofibers مستعدون للصورة (أرقام 2A وباء) أو تخزينها في 4 درجة مئوية. </li></ol> 4. خلية الحية التصوير الكالسيوم عن طريق GCaMP3 التجارب الخلية الحية لا يمكن أن يؤديها على myofibers قبل التثبيت (الخطوة التالية 2.10). يصف بروتوكول التالية التصوير الحي في التعبير عن myofibers GCaMP3 24، وهو مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا، التي أعرب عنها العضلات والهيكل العظمي محددة الزرد-α أكتين المروج (pSKM) 23. بدلا من ذلك،هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام الأصباغ مؤشر الكالسيوم مثل FURA-2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الأجنة مع pSKM: GCaMP3 بناء في مرحلة 1-2 خلايا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 3 DPF، وجمع اليرقات وإعداد myofibers كما هو موضح في المقاطع 1 و 2. تسمح myofibers الالتزام لمدة لا تقل عن 1 ساعة. لهذه التقنية، مطلوب إعداد coverslips في أطباق 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية أي وسائط الزائدة، وإضافة 300 ميكرولتر من الطازجة CO 2 وسائل الإعلام المستقلة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب. وينبغي أن تكون إيجابية myofibers GCaMP3 مرئية تحت مضان أخضر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكاميرا للتسجيل، وإذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الكافيين 30 ملم في CO 2 وسائل الإعلام المستقلة. لتحفيز الخلايا، ماصة بلطف 300 ميكرولتر من محلول مادة الكافيين في البئر تحت التكبير. في غضون 5-10 ثانية، ينبغي myofibers إيجابية GCaMP الرد على الكافيين مع الزيادة السريعة في مضان (الشكل 3). Myofibالمتطلبات البيئية قد تعاقد أيضا. من المذكرة، والكافيين يؤدي الى الافراج الكالسيوم من مخازن شبكية الهيولى العضلية 25. غيرها من العوامل، مثل بوكل 26 وryanodine 4، ويمكن استخدامها لدراسة الافراج الكالسيوم محرض. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li><li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+myoplasmic+gap:+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li><li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction.">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li><li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors:+structure,+expression,+molecular+details,+and+function+in+calcium+release.">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity:+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan:+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease.">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey.">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li><li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy.">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Zebrafish+system.">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li><li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle.">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling,+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy.">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li><li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit.">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene,+CACNB1,+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants.">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li><li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles.">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=accordion,+a+zebrafish+behavioral+mutant,+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2++pump+SERCA1.">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle.">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li><li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li><li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

الكتاب تعلن أي تضارب المصالح.

الزرد هي نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة تنمية العضلات وظيفة في الجسم الحي 25،27،28. ظهرت أنها أيضا رصيدا قيما لنمذجة أمراض العضلات البشرية 14،15،20،29. بينما اتخذت خطوات كبيرة لتعزيز استخدام وتطبيق الزرد لدراسة وظيفة العضلات وأمراض العضلات، وهناك حاجة...

العضلات والهيكل العظمي هو النسيج درجة عالية من التخصص مسؤولة عن توليد القوى مقلص اللازمة لحركية. يبدأ الانكماش من خلال عملية تعرف باسم الإثارة الانكماش (EC) اقتران الذي يحول الإشارات الكهربائية إلى إطلاق الكالسيوم من مخازن داخل الخلايا 1،2. الافراج الكالسيوم داخل الخلايا ينشط قسيم عضلي لتقصير وتوليد القوة. والعديد من مكونات محددة من الآلات الجزيئية المسؤولة عن التوسط انتقال العصبية والعضلية تقاطع 3، EC اقتران 4،5، وأكتين-الميوسين تقلصات تعتمد 6 الاستمرار في أن تكون موضوع بحث مكثف الجارية. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد البروتينات التي استقرار غشاء العضلات خلال 7،8 الانكماش والتي تتوسط بين إشارات ليف عضلي والمصفوفة خارج الخلية 7،9 ودرس بقدر كبير من التفصيل. الطفرات في عدد من الجينات الهامة للبنية العضلاتوقد تم تحديد وظيفة الثانية كأسباب للأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). هذه الأمراض، تصنيفها كما الاعتلالات العضلية الهيكلية وضمور العضلات على أساس الخصائص السريرية والنسيجية، وترتبط مع ضعف العضلات، والعجز مدى الحياة، و10،11 الوفيات المبكرة. وقد ثبت الزرد أن يكون نظاما غير المسددة لنمذجة ودراسة الأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري 8،12،13. واستخدمت ذلك للتحقق من صحة طفرات جينية جديدة 8، وتحديد جوانب جديدة من الفيزيولوجيا المرضية المرض 14،15، وتحديد النهج العلاجي الجديد 15،16. قوة الزرد لدراسة مرض في العضلات الإنسان يتصل عدد كبير من النسل، والتطور السريع للبنية العضلات وظيفة، والوضوح البصري للجنين الزرد، وسهولة التلاعب الجيني والدوائية للحمار وحشي الناميةالأسماك 17. نحن وآخرون 12،18،19 قد وضعت في الآونة الأخيرة تقنية بسيطة لعزل السريع والفعال للmyofibers من الزرد النامية. وقد مكنت هذه المنهجية في دراسة myofibers بتفصيل أكبر مما يمكن أن تقدمها تحليل الجنين كله. وقد تم استغلال هذه التقنية لتوصيف البروتين توطين التحت خلوية 20 وكذلك لتحديد الخصائص النسيجية هامة كجزء من دراسات التحقق من الصحة في النماذج المطورة حديثا المرض 21. علاوة على ذلك، يمكن بالإضافة إلى ذلك myofibers المعزولة أن تستخدم للتصوير الحي وللدراسات الكهربية 22، التقنيات التي تسمح للاستجواب الجوانب الرئيسية من وظيفة العضلات. بروتوكول محددة لليف عضلي العزلة، جنبا إلى جنب مع اثنين من الأمثلة من التجارب التحليلية اللاحقة، هو مفصل في الأجزاء المتبقية من هذه المخطوطة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>70011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independent medium</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>18045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004186</td>
			<td>Lot 41H12764</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>L5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-545-82 12CIR-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RYR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>34C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

وقد ثبت الزرد أن يكون نظام نموذجا قيما لاستكشاف وظيفة العضلات والهيكل العظمي والعضلات لدراسة الأمراض البشرية. على الرغم من العديد من المزايا التي تقدمها في الجسم الحي تحليل الهيكل العظمي والعضلات في الزرد، تصور معقد ومنظم بدقة البروتين الوسط مسؤولة عن وظيفة العضلات، وخصوصا في الأجنة كله، يمكن أن يكون مشكلة. ينبع هذا عائق من صغر حجم العضلات والهيكل العظمي الزرد (60 ميكرون)، وحجم أصغر من قسيم عضلي. نحن هنا وصف وشرح طريقة بسيطة وسريعة لعزل myofibers الهيكل العظمي من الأجنة الزرد واليرقات. نحن تشمل أيضا البروتوكولات التي توضح تقنيات إعداد المنصب مفيدة لتحليل بنية العضلات وظيفة. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل توطين immunocytochemical اللاحقة للبروتينات العضلات والهيكل العظمي والتحليل النوعي لإطلاق الكالسيوم عبر حفز التصوير الكالسيوم الخلية الحية. عموما، هذا الفيديوتنص المادة طريقة مباشرة إلى الأمام وكفاءة لعزل وتوصيف myofibers الهيكل العظمي الزرد، وهو الأسلوب الذي يوفر ممرا للدراسات اللاحقة لا تعد ولا تحصى من بنية العضلات وظيفة.

immunolabeling الفلورسنت من myofibers (الشكل 2) الصور تظهر نمط وضع العلامات الفلورية المتوقعة من myofibers immunostained بعد العزلة الناجحة والطلاء. وقد وصفت myofibers مع أي المضادة للمستقبلات ryanodine (1:100) (الشكل 2A) أو المضادة للα-actinin (1:...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations at JoVE.com

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

الزرد هي نظام لنمذجة الاضطرابات الناشئة الإنسان من العضلات والهيكل العظمي. نحن تصف طريقة سريعة وفعالة لعزل myofibers العضلات والهيكل العظمي من الزرد الجنينية واليرقات. هذه الطريقة تعطي عالية الكثافة إعداد ليف عضلي مناسبة لدراسة مورفولوجية واحد من الألياف العضلات والهيكل العظمي، والبروتين توطين التحت خلوية، وعلم وظائف الأعضاء العضلات.

تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  University of Michigan.  الزرد هي نظام لنمذجة الاضطرابات الناشئة الإنسان من العضلات والهيكل العظمي. نحن تصف طريقة سريعة وفعالة لعزل myofibers العضلات والهيكل العظمي من الزرد الجنينية واليرقات. هذه الطريقة تعطي عالية الكثافة إعداد ليف عضلي مناسبة لدراسة مورفولوجية وا...

Video: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissection من الأنسجة الجنينية العين اسماك الزرد

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

تشريح القلب في اليرقات ، اسماك الزرد الأحداث والكبار ، دانيو rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.