저자는 기술의 개발 및 원고의 생산에 기여 다울 링 실험실의 구성원 (아론 Reifler, 트렌트 워, 안젤라 부스타, 윌리엄 Telfer)을 감사드립니다. 이 작품은 터 브먼 연구소, 미시간 대학에서 소아과와 근육질 영양 장애 협회 (JJD MDA186999)과 국립 보건원 (JJD 1K08AR054835)에서 교부금에서 일부에 의해 투자되었다.

1. 폴리-L-라이신의 제조 코팅 Coverslips는 (시간 : 1 시간) 코팅 coverslips는 빠른 근섬유의 정착 및 접착 할 수 있습니다. 이 근섬유의 분리 (아래 단계 2)의 분리 단계에서 수행 할 수있다. <ol><li> 잘라 60mm 페트리 접시 (모든 브랜드)의 바닥에 파라 필름을 배치합니다. </li><li> 60mm 조직 배양 접시에 파라 필름에 현미경 커버 유리 전표 (12mm 직경)를 배치 또는 24 - 웰 플레이트의 하나의 우물에 개별적으로 배치합니다. </li></ol> 주 1 :이 작은 원형의 coverslips는 근섬유 숫자를 집중 초과 항체의 사용을 줄일 수 있습니다. 주 2 : 다른 크기의 coverslips는 작동하지만, 사용되는 시약 및 배아의 볼륨을 적절하게 조정해야합니다. <ol start="3"><li> 피펫 페트리 접시에 각각의 커버 유리에 폴리-L-라이신 솔루션 (0.01 %)의 50 ~ 200 μL. </li><li> 커버 슬립이 적어도 하나의 호를 앉을 수37 ° C에서 통해 UR 이상 배양 부정적인 결과에 영향을주지 않는다. </li><li> 커버 유리로부터 폴리-L-라이신의 용액을 제거하고 100 ㎕의 PBS 1X의 최소 회 씻는다. </li><li> 커버 슬립이 건조하도록 허용합니다. </li><li> 커버 슬립 지금 근섬유에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 주 3 : 불임을 보장하기 위해, 코팅은 후드 및 멸균의 coverslips에 수행 할 수 있습니다. 주 4 : 바닥에 파라 필름과 60mm 페트리 접시를 유지합니다. 이 설정은 근섬유 도금 immunolabeling (이후 단계) 동안 사용됩니다. 대안 1 : 대신 사용하기 직전에 코팅 커버 슬립으로, 코팅 coverslip에 재고가 사용할 수 있습니다. 2 ㎖ 폴리-L-라이신의 최소를 포함하는 60mm 페트리 접시는 수많은 커버 슬립을 포함하는 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이 대안 근섬유의 커버 슬립을 처리하는 단계 1.5에서 시작합니다. 대안 2 : 우리는 또한 폴리-L-오르니 틴의 코트 커버 슬립. 티자신의 집중보다 노동이지만, 폴리-L-오르니 틴 코팅 커버 슬립은 UV 처리 할 수​​ 있기 때문에 장기 배양하는 데 유용합니다. UV 처리 및주의 살균 기술로 라이브 근섬유는 일반적으로 4~7일 문화를 유지할 수있다. 2. 근섬유의 제브라 피쉬 배아 및 도금 (: 1 ~ 3 시간 시간)의 해리 참고 : 표준 프로토콜 3 DPF (일 포스트 수정) 배아에 가장 적용됩니다. <ol><li> 표준 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 제브라 피쉬 배아를 전송하고 가능한 한 많은 초과 물고기의 물을 제거합니다. 통상적으로, 비록 덜 튜브 당 10-20 배아가 사용될 수있다. 이상 20-25 배아를 사용하는 것은 종종 과도한 밀도 제제 초래한다. <ol><li> 수동 5 집게 #을 사용하여, 이전의 해리에 chorions를 제거합니다. 또한, 화학 융모막 제거는 10 ~ 15 분 프로 나제​​ 치료로 얻을 수있다. 일반적으로, 융모막의 이전 제거는 필요할 때 MUT의 사전 확인개미 표현형이나 형태가 필요합니다, 또는 단을 사용하는 경우 태아가 자연스럽게 자신의 융모막에서 부화되는 곳. </li></ol></li><li> 태아가 들어있는 튜브에 CO 2 독립적 인 매체 900 μl를 추가합니다. </li><li> 100 콜라게나 유형 II의 μL, 최종 농도 3.125 ㎎ / ㎖ 분리를 시작합니다 (31.25 ㎎ / 1X PBS에 희석 ML의 주식 콜라게나 솔루션)를 추가합니다. 콜라게나 제 IV는 해리에 사용될 수있다. </li><li> 진탕에 배아를 회전 및 분쇄를위한 P1000 Pipetman를 사용하여 실온에서 매 30 분을 씹다. </li></ol> 주 2 : 조심스럽게 배아 분리를 모니터링, (특히 이상) 이상 또는 해리에서 프로토콜 실패의 가장 일반적인 이유는 다음과 같습니다. 소화에 시간이 분쇄, 튜브 당 배아의 수, 배아의 연령의 강도에 따라 달라질 수 있습니다. 또한 골격 근육 돌연변이 체에서 태아에 대한 (야생 유형에 비해) 적을 수있다. 주의3 : 배아 연령 당 평균 소화 시간 = 1 시간 1 DPF, 2 DPF = 1.5 시간, 3 DPF = 2 시간, 그리고 = 2-2.5 시간 4 DPF. <ol start="5"><li> 더 전체 배아를 볼 수 없습니다, 그러나 고체 조각은 여전히 볼 수 있습니다 때 소화를 중지 -이 overdigestion을 방지하는 것이 필수적입니다. </li><li> 펠렛 세포에 3 ~ 5 분 동안 0.8-2.3 XG에 해리 배아와 원심 분리기 튜브. </li><li> 펠렛 세포 상층 액을 제거하고 CO 2 독립적 인 미디어에 배를 세척한다. </li><li> 세포를 재현 탁 신선한 CO 2 독립적 인 미디어를 추가합니다. 1 ㎖는 일반적으로 10 ~ 20 배아의 최상의 상태로 준비하는 데 사용됩니다. 볼륨은 배아의 수에 따라 확장 할 수 있습니다. </li><li> P1000 피펫을 사용하여, 70 μm의 필터를 통해 배아 현탁액을 전달합니다. 이 준비 원치 않는 파편을 제거하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 주 4 : 배아 현탁액 더욱 원하지 않는 파편을 제거하기 위해 40 ㎛의 필터를 통해 두 번째 시간을 필터링 할 수있다. 이중 여과에서 복구 approxim이다입니다1 ㎖의 시작 볼륨에서 ately 800 μL. <ol start="10"><li> 각각의 폴리-L-라이신 코팅 커버 슬립에 근섬유 서스펜션의 약 50 ~ 100 μl를 추가합니다. </li></ol> 주 5 : 바닥에 파라 필름으로 페트리 접시의 단계 2.9를 수행 이전에 준비했다. 파라 필름이 코팅 된 커버 슬립을 실행 한 근섬유 서스펜션을 유지합니다. 증발을 방지하기 위해 덮여 페트리 접시를 유지합니다. <ol start="11"><li> 근섬유는 상온에서 코팅 된 커버 슬립에 약 1 시간을 해결 할 수 있습니다. </li></ol> 6 주 : 근섬유는 5 ~ 10 분 내에 정착하기 시작합니다. 그러나, 좋은 근섬유에 부착, 1 시간 (1-2 시간)의 최소 권장합니다. 근섬유가 오래 정착 할 수 있도록 허용하는 것은 준비를 해가되지 않습니다. (야간 등) 이상 배양 들어 항생제 매체에 첨가 할 수있다. 항생제와 살균 기술로 살아있는 문화는 일반적으로 1-2일 유지 될 수있다. <ol start="12"><li> 라이브 Myofibers이 시점에서 관찰 할 수있다. 배아 2 DPF에서 근섬유 나중에 가로 무늬와 신장 세포 (그림 1)로 볼 수 있습니다. 이 시점에서, 근섬유는 이제 실시간 분석을 위해 또는 immunolabeling에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 7 주 : 배아 DPF (1)에서 골격 근육은 가늘고 긴 명확하게 줄이있는 섬유를 도금하지 않습니다. 대신, 큰 myoballs는 볼 수 있습니다. 또, 펠렛 상 포스트 해리 중에 myoballs이 펠릿을 달성하기 위해 5000 XG에서 13 분 동안 원심 분리 최소해야 한 DPF (2.6 단계). 이 단계에서 배아의 분석을 위해, 그것은 특히 골격근 23 EGFP를 발현하는 형질 전환 라인을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 다른 소스에 비해 근육 원점에서 세포의 식별을 허용합니다. 3. 해리 Zebrafish의 근섬유의 형광 면역 염색 (시간 : 약 1 일) 3.1. Immunolabeling <ol><li> 의 일부를 제거코팅 된 커버 슬립을 준수 근섬유에서 미디어 </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 나 메탄올을 사용하여 세포를 고정합니다. PFA의 경우, 미디어의 볼륨 ½ 제거하고 PFA 같은 양으로 교체. 총 볼륨을 제거 한 후, 실온에서 10 분 동안 수정 PFA의 50 ~ 100 μL로 교체하고, 추가로 10 분 동안 고정합니다. 알코올 고정, 얼음 냉 메탄올, 아세톤의 경우 각각 10 분, 5 분 동안 4 ° C에서 적용 할 수 있습니다. </li><li> 근섬유 적어도 1X PBS 또는 1X PBS로 3 배 플러스 0.1 % 트윈을 씻으십시오. 평균 세척 볼륨의 coverslip 당 50 ~ 100 μL이다. </li><li> 근섬유에 대한 솔루션 (주 작업)를 차단하는 추가하고 실온에서 20 ~ 60 분을 품어. 솔루션을 차단하면 기본 및 보조 항체에 따라 달라질 수 있습니다. 실험실에서 사용되는 가장 일반적인 두 가지 (1) 1X PBS, 2 ㎎ / ㎖의 BSA, 1 % 양 혈청, 0.25 % 트리톤 X-100의 최종 및 (2) 0.2 % 트리톤 X-100, 2 ㎎ / ㎖ (아르 0.2 % BSA)과 5 %의 양 / 염소 혈청. </li><li> 차단 솔루션 제거하고 B 중 하나에 희석 일차 항체를 추가용액 또는 PBS를 잠금. 4 ℃에서 하룻밤 근섬유를 품어 파라 필름 하나에 있는지 확인하거나 항체로 코팅 된 근섬유로드 커버 슬립을 포함하는 페트리 접시를 포장 사란 랩. 적신 종이 타월의 작은 조각은 가습 챔버를 만들기 위해 첨가 될 수있다. </li><li> 커버 슬립에서 일차 항체를 제거하고 PBS로 5 분 또는 차단 솔루션의 coverslips에게 3 배를 세척한다. </li><li> 1X PBS 또는 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 차단 솔루션에 희석 적절한 농도 차 항체를 추가합니다. </li><li> 이차 항체를 제거하고 RT에서 5 분마다 PBS에서 근섬유에게 3 배를 세척한다. </li></ol> 3.2. 설치의 coverslips <ol start="9"><li> 현미경 슬라이드에 antifade 시약을 1 ~ 2 방울을 적용합니다. </li><li> 조심스럽게 픽업 코팅 및 immunolabled 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 antifade 시약에 커버 슬립을 (근섬유를) 핀셋과 장소를 사용하여. </li></ol> C의 방향에주의 : 주 1oated 커버 슬립이 중요합니다. <ol start="11"><li> 하드 고체 표면에 1-2 킴 와이프를 놓습니다. 신속 antifade 시약에 휴식 코팅 된 커버 슬립과 슬라이드를 거꾸로 킴 와이프에 (아래 coverslip에) 배치합니다. </li><li> 초과 antifade를 제거하고 슬라이드 및 coverslip에 단단히 밀착을 형성하기 위해 현미경 슬라이드의 모서리에 약간의 힘을 주어 </li><li> 실온에서 5 ~ 10 분 동안 건조 남아있는 antifade는 다음 근섬유는 4 ℃에서 (그림 2A와 B) 또는 상점 이미지 준비가 허용 </li></ol> 4. GCaMP3을 사용하여 라이브 세포 칼슘 이미징 라이브 세포 실험 (단계 2.10 다음) 이전에 고정으로 근섬유에서 수행 할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 GCaMP3 24, 골격근 특정 제브라 피쉬의 α-액틴 프로모터 (pSKM) (23)에 의해 표현 된 유전자 인코딩 칼슘 지표를 표현하는 근섬유의 라이브 영상에 대해 설명합니다. 또한,이러한 기술은 용이 등의 Fura-2와 같은 칼슘 인디케이터 염료를 사용하도록 구성 될 수있다. <ol><li> pSKM으로 배아를 주입 : GCaMP3은 1-2 세포 단계에서 구성 </li><li> 3 DPF에서 애벌레를 수집하고 섹션 1과 2에 설명 된대로 근섬유를 준비합니다. 근섬유는 1 시간의 최소 준수 할 수 있습니다. 이 기술의 경우, 24 잘 접시에 준비 커버 슬립이 필요합니다. </li><li> 조심스럽게 초과 용지를 제거하고 실온에서 신선한 CO 2 독립적 인 미디어의 300 μl를 추가합니다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 세포를 관찰합니다. GCaMP3 긍정적 인 근섬유는 녹색 형광에서 볼 수 있어야합니다. </li><li> 원하는 경우, 녹화 카메라를 설정합니다. </li><li> CO 2 독립적 인 미디어에 30 mM의 카페인 솔루션을 준비합니다. 세포를 자극하기 위해, 부드럽게 확대에 따라 우물에 카​​페인 용액 300 μl를 피펫. 5 ~ 10 초 이내, GCaMP 긍정적 인 근섬유는 형광의 급격한 증가 (그림 3)과 카페인에 응답해야합니다. MyofibERS는 계약을 체결 할 수 있습니다. 참고로, 카페인이 근질 세망 저장 25에서 칼슘 방출을 유도한다. 등의 KCl 26 ryanodine 4와 같은 다른 에이전트, 유도 칼슘 방출을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle.">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li><li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li><li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

저자는 충돌하는 이해 관계를 선언하지 않습니다.

제브라 피쉬는 생체 내 25,27,28의 근육 발달과 기능 연구를위한 강력한 척추 동물 모델 시스템이다. 그들은 또한 인간의 근육 질환 14,15,20,29 모델링을위한 귀중한 자산으로 등장했습니다. 커다란 진보가 근육 기능과 근육 질환의 연구를위한 제브라 피쉬의 사용과 응용 프로그램을 사전에 촬​​영되었지만, 행동과 기능적인 유전, 형태 학적를, 칭찬보다 심층적 인 분석을 할...

골격근은 운동성 필요한 수축력 생성을 담당 고도로 전문화 된 조직이다. 수축은 세포 내 저장 1,2에서 칼슘 방출을 전기 신호로 변환 여기 수축 (EC) 커플 링으로 알려진 과정을 통해 시작됩니다. 세포 내 칼슘 릴리스는 힘을 단축하고 생성 할 수 근절을 활성화합니다. 신경 근육 접합부 전송 3, EC 커플 링 4,5, 그리고 말라 - 마이 오신 따라 수축 6 중재를 담당하는 분자 기계의 많은 특정 구성 요소는 강렬한 연구의 지속적인 대상이 될 것을 계속한다. 또한, 수축 7,8과 근섬유와 세포 외 기질 (extracellular matrix) 7,9 사이의 시그널링 중간체 동안 근육 세포막을 안정화 단백질은 확인 된 훌륭한 세부 사항에서 공부했다. 근육 구조에 중요한 유전자의 개수의 돌연변이차 기능 (인간의 골격 근육 질환의 원인으로 확인 된 <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). 임상 및 병리 조직 학적 특징에 따라 골격 근육 병증 및 근육 이영양증으로 크게 분류 이러한 질환, 근육 약화, 평생 장애, 조기 사망의 10, 11과 연결되어 있습니다. 제브라 피쉬는 사람의 골격 근육 질환 8,12,13 모델링과 공부를위한 뛰어난 시스템으로 입증되었습니다. 그것은, 새로운 유전자 변이 8 확인 질병 병태 생리 (14, 15)의 새로운 측면을 정의하고, 새로운 치료 방법 (15, 16)를 식별하기 위해 사용되어왔다. 인간의 근육 질환 연구를위한 제브라 피쉬의 힘은 자손, 근육의 구조와 기능, 제브라 피쉬 배아의 광학 선명도 및 개발 얼룩말의 유전 적 및 약리학 적 조작의 용이성의 급속한 발전의 큰 숫자에 관한물고기 17. 우리와 다른 12,18,19 최근 개발 제브라 피쉬에서 근섬유의 신속하고 효율적인 분리를위한 간단한 기술을 개발했습니다. 이 방법론은 전체 배아 분석에 의해 제공 될 수있는 것보다 더 상세히 근섬유의 시험을 가능하게했다. 이 기술은 새로 개발 된 질병 모델 21의 검증 연구의 일환으로 중요한 병리 조직 학적 특성의 식별을위한 단백질의 세포 내 현지화 (20) 등의 특성에 악용하고있다. 또한, 고립 된 근섬유가 추가 라이브 이미징 및 전기 생리학 연구 22, 근육 기능의 주요 측면의 심문을 허용 기술을 사용할 수 있습니다. 이후의 분석 실험의 두 가지 예와 함께 근섬유 격리를위한 특정 프로토콜은이 원고의 나머지 부분에 자세히 설명되어 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>70011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independent medium</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>18045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004186</td>
			<td>Lot 41H12764</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>L5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-545-82 12CIR-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RYR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>34C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

제브라 피쉬는 골격 근육의 기능을 탐험과 인간의 근육 질환 연구를위한 귀중한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 특히 전체 배아, 근육 기능을 책임 복잡한 미세 구조화 단백질 환경을 시각화, 제브라 피쉬에서 골격근의 생체 내 분석에 의해 제공되는 많은 장점에도 불구하고, 문제가 될 수있다. 이 장애는 제브라 피쉬의 골격 근육 (60 μM) 및 근절의 더 작은 크기의 작은 크기에서 유래한다. 여기에 우리가 설명하고 제브라 피쉬 배아 및 유충에서 골격 근섬유를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 근육의 구조와 기능 분석을위한 유용한 게시물에 준비 기술을 설명 프로토콜 (가) 있습니다. 특히, 우리는 세부 골격 근육 단백질의 후속 면역 세포 화학 현지화 및 라이브 세포 칼슘 이미징을 통해 자극 칼슘 방출의 정성 분석. 전반적으로,이 영상기사는 제브라 피쉬의 골격 근섬유의 분리 및 특성, 근육의 구조와 기능의 수많은 후속 연구를위한 도관을 제공하는 기술에 대한 똑 바른 앞으로하고 효율적인 방법을 제공한다.

근섬유의 형광 immunolabeling (그림 2) 근섬유에서 예상 형광 라벨 패턴을 보여주는 이미지는 성공적으로 분리 및 도금 후 면역 염색. 근섬유 방지 ryanodine 수용체 (1:100) (그림 2A) 또는 항-α-티닌 (1:100) (그림 2B) 항체 중 하나로 표시되어, 각각 깡패와 Z-밴드의 면역 염색을 공개하고 있습니다. 사용 된 차 항체는 알렉사 플 루어 555 (1:500)?...

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Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  University of Michigan.  제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다. 

비디오: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

연구

생물학

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Methods Article

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석