وظيفة الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية للوسوستاسيس الخلوي ومعدل استهلاك الأكسجين هو مؤشر حاسم على صحة الميتوكوندريا. يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة نحو تحليل معدل استهلاك الأكسجين في C.elegans. هذا البروتوكول يجعل من استخدام الحية، المحمول C.elegans توفير قياس قانوني لوظيفة الميتوكوندريا.
رفع الحاجة إلى عزل الميتوكوندريا، وهي خطوة يمكن أن تؤثر على النزاهة. للبدء، نقل يرقات L4 من الخلفيات الوراثية المطلوبة على حديقة بذر حديثا من القولونية Escherichia على وسائط نمو الديدان الخيطية أو لوحات NGM. استخدام ما لا يقل عن اثنين من 100 ملم أو ثلاثة 60 ملم لوحات لكل سلالة.
احتضان الديدان في درجة حرارة النمو المناسبة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، أو حتى تتركز لوحات مع عدد كبير من البيض والديدان جرافيد. اغسل البيض والديدان من الصفائح باستخدام حوالي 6 ملليلترات من M9 العازلة لكل 100 ملليمتر من النيماتودا. باستخدام المواصات المراعي الزجاجية، نقل البيض والديدان إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفردية 15 ملليلتر لكل سلالة.
تدور اٍلُنَايات أسفل لمدة ثلاث دقائق في 6, 180 غ. بعد الطرد المركزي، التعرق خارج العازلة M9 الاحتفاظ فقط الحيوان والبيض بيليه. إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من محلول التبييض لكل أنبوب ودوامة متقطعة لمدة ست دقائق.
ثم، إضافة M9 العازلة لملء كل أنبوب وتدور في 6، 180 غرام لمدة دقيقة واحدة. استلهمي المناط وكرري هذا الغسل مع M9، ثلاث مرات. بعد غسل, نقل بيليه البيض إلى أنبوب 15 ملليلتر الطازجة التي تحتوي على ما يقرب من تسعة ملليلتر من M9 العازلة.
مزامنة الديدان الطازجة عن طريق nutating في 20 درجة مئوية لمدة 16 إلى 48 ساعة. بعد الغزل هذه الأنابيب إلى أسفل في 6, 180 ز لمدة 1.5 دقيقة, وضع الحيوانات متزامنة L-1 أسفل على العشب بذرة جديدة من OP50 على لوحات NGM الفردية. حافظ على الأطباق عند درجة 20 درجة مئوية حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة اليرقات L-4 بعد حوالي 42 ساعة.
في هذا الوقت، استخدم اختيار البلاتين لنقل يرقات L4 إلى لوحات NGM المصنفة OP50 التي تحتوي على 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من FUdR لمنع من إنتاج ذرية. ابرّم خرطوشة المستشعر عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من الماء المقطر إلى كل بئر على اللوحة، مما يضمن غمر مسابير الاستشعار. تخزين لوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
إيقاف تشغيل عنصر التسخين داخل واجهة مقياس التنفس. تخزين الجهاز داخل حاضنة درجة 15 درجة مئوية يخفض درجة الحرارة الأساسية داخل الجهاز ويمنع الحيوانات من ارتفاع درجة الحرارة أثناء الفحص. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، والماصات من والتخلص من المياه المقطرة المستخدمة لترطيب مسابير الاستشعار، واستبدالها مع 200 ميكرولترات من محلول الكاليبرانت في كل بئر.
تخفيف حل FCCP مخزون ل100 FCCP micromolar في الماء المقطر. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من محلول مخفف لحقن ميناء A في خرطوشة الاستشعار. إضافة 22 ميكرولتردات من 400 ميليمولار الصوديوم azides لحقن ميناء B من خرطوشة الاستشعار.
الآن، قم بتشغيل مقياس التنفس. على الشاشة الرئيسية، حدد بدء وستظهر صفحات القالب. في صفحة القوالب، حدد فارغًا" أو قالب تم تصميمه مسبقًا.
ستظهر صفحة المجموعات. في صفحة المجموعات، حدد الآبار A وH كآبار خلفية، وقم بتعيين الآبار الستة المتبقية في مجموعات مناسبة وفقًا للخطة التجريبية. الوصول إلى صفحة البروتوكول بالنقر فوق السهم على اليمين السفلي، وتأكد من أن يتم تحديد رز واحد واثنين من الإكسالات، القاعدية، والحقن.
اضبط عدد قراءات OCR القاعدية وكذلك الحد الأقصى OCR وغير الميتوكوندريا OCR. حدد السهم في الزاوية السفلية اليسرى. ستظهر مطالبة لتحميل لوحة خرطوشة المستشعر.
تأكد من أن لوحة خرطوشة الاستشعار يتم تحميلها في الاتجاه الصحيح، وذلك باتباع الإرشادات الموجودة على شاشة تذكير موجه. سوف يروّك مقياس التنفس الآن الخراطيش. إضافة 200 ميكروليتر من M9 العازلة في كل من الآبار الثمانية والخزانات المحيطة من لوحة الخلية.
اختيار ما يقرب من 100 الديدان من كل سلالة على لوحات NGM غير المصنفة، والسماح للراحة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. ثم، الرطب نهاية اختيار البلاتين مع M9 العازلة واختيار الحيوانات متزامنة سن 20 في الآبار B من خلال G، وترك الآبار الخلفية A وH فارغة. الآن، انقر فوق موافق على برنامج مقياس التنفس لإخراج اللوحة التي تحتوي على مخزن معايرة.
قم بإزالة اللوحة من مقياس التنفس تاركاً خرطوشة المستشعر داخل الجهاز. استبدال لوحة الكاليبانت مع لوحة تحتوي على الحيوانات. لوحات تحميل وإغلاق الباب عن طريق ضرب الاستمرار والسماح للمقايسة لتشغيل.
بمجرد اكتمال تشغيل الفحص، اتبع المطالبات على الشاشة لإزالة لوحة الخلية وخراطيش الاستشعار. أدخل محرك أقراص محمول في منفذ USB لحفظ تنسيق حرب البيانات. إزالة خرطوشة الاستشعار والسماح للحيوانات لتسوية إلى أسفل الآبار لمدة دقيقتين تقريبا.
ضع لوحات الخلايا تحت مجهر ستيريو تشريح وعدد من الحيوانات في البئر. افتح برنامج التحليل، متبوعاً بعلامة التبويب التطبيع، لتطبيع معدلات استهلاك الأكسجين إلى رقم الحيوان. تطبيق مستويات مناسبة للمجموعات المختلفة تحت "علامة التبويب تعديل" ثم تصدير الملف كملف المنشور لمزيد من التحليل.
متوسط القياسات الخمسة الأولى هو التعرف الضوئي على الحروف القاعدي. متوسط القياسات الخمسة بعد إضافة FCCP هو أقصى OCR. وأخيراً، فإن متوسط القياسات الخمسة الأخيرة بعد إضافة أزيد الصوديوم هو معدل التنفس غير الميتوكوندريا.
منذ dysregulation الكالسيوم يمكن أن يؤدي إلى وظيفة الميتوكوندريا غيرت، OCR في كل من المسوخ sel-12 والحيوانات من النوع البرية تم قياسها لدراسة تأثير الطفرات sel-12 على وظيفة الميتوكوندريا والصحة. أظهرت الحيوانات من النوع البري باستمرار معدلات OCR القاعدية أقل من خمسة picomoles في الدقيقة ، لكل دودة. في حين أن جميع السلالات الثلاث من المسوخ sel-12 أظهرت ارتفاعًا كبيرًا في OCR ، من حوالي سبعة picomoles في الدقيقة ، لكل دودة.
عند إضافة FCCP، كانت هناك زيادة في التعرف الضوئي على الحروف من النوع البري، وكذلك المسوخ sel-12، كما هو متوقع. وأظهرت الحيوانات من النوع البرية التعرف الضوئي على الحروف كحد أقصى من حوالي سبعة picomoles في الدقيقة الواحدة، لكل دودة. في حين أن المسوخ sel-12 كان OCR من حوالي 10 picomoles في الدقيقة الواحدة ، لكل دودة.
استخدام الحية، وتغذية جيدة، والحيوانات غير المتزامنة في هذا الفحص، وتجنب نقل البيض أو الذبائح في آبار الفحص. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن لا تتجاوز درجة الحرارة الداخلية للأداة 25 درجة مئوية. التبييض، FCCP، FUdR، وأزيد الصوديوم هي سامة.
لذلك، ينبغي توخي الحذر لارتداء قفازات واقية أثناء إعداد حلول المخزون وتحميل المخدرات.
