وأيد هذا العمل من المنح NINDS (NS066071) وNIAAA و. (P50AA017823) لECO. الكتاب أشكر الدكتور روبرت كوين والموظفين في وزارة الثروة الحيوانية مختبر لرعاية الحيوانات. نشكر جودسون بلمونت حصول على الدعم الفني، نيكول Belletier للمساعدة على أنه باحث الصيفية الجامعية (SURF). نشكر أيضا الدكتور ديفيد كاميرون للتعليق عليها وتعديلات على إصدار سابق من المخطوطة.

1. Electroporations الرحم السابق مع الأخضر التعبير بروتين فلوري البلازميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إعداد البلازميد الحمض النووي مع حلول حقن CAG-DNA 27 EGFP المخفف لتركيز العمل النهائية قدره 0.33 ملغ / مل في DDH 2 O. وتستخدم QIAGEN إندو خالية من ماكسي إستعداد لتنقية البلازميد من البكتيريا المتحولة. يضاف صبغ الأخضر بسرعة 0.02٪ في ~ (W / V النهائي) في حل DNA باعتباره التتبع الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد منطقة العمليات الجراحية، رش أعلى إلى أسفل مقاعد البدلاء وتشريح مرحلة المجهر مع حل الإيثانول 70٪ وجففي. رش مقص وملقط جراحي مع الايثانول 70٪ قبل تشريح وجففي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضحى توقيت الحوامل السويسري / ويبستر السدود على E13 عن طريق التحويل إلى غرفة مليئة CO 2 من اسطوانة مضغوطة ويتم رصد السد حتى عن توقف الحركة لمدة لا تقل 1 دقيقة. بعد التضحية عن طريق الاستنشاق 2 CO تتم إزالة الأجنة من الرحم ووضعها فيمن 10 سم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة محلول ملحي متوازن هانكس (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الجنين بعناية كل من الأغشية المحيطة من خارج الجنين والحفاظ على الجليد الباردة في HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل جنين على حدة لثانية 10 سم طبق بتري تحتوي على HBSS الباردة. استخدام حقنة لحقن هاميلتون 2-3 ميكرولتر من خليط DNA الخضراء بسرعة إلى البطين من نصف الكرة المخية الأيسر، مع الحرص على حقن في منطقة منفصلة مكانيا القشرية من المنطقة القشرية للتحليل في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لelectroporate، اضغط بلطف الجنين بالملقط ووضع برفق مجداف إيجابية من القطب منتاش على خط الوسط الظهرية من الرأس ووضع برفق مجداف السلبية تحت الذقن الجنين. يتم تحقيق Electroporations مع electroporator BTX830 مبرمجة لتقديم 5 30 نبضة V لمدة ميللي ثانية 50، مفصولة فترات ميللي ثانية 950. هذه الإعدادات لنموذج BTX830. ويمكن استخدام أنظمة أخرى وفقا لinstructio الشركة المصنعةNS. </li></ol> 2. كامل نصف الكرة إعداد يزدرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الصعق الكهربائي و توضع الأجنة مرة أخرى إلى الجليد الباردة HBSS. تتم إزالة الدماغ باستخدام ملقط صائغ 2 # 5 لإزالة الجلد والجمجمة الغضروفية من الرأس الجنين. وبعد ذلك تراجع forcep تحت المخ لإزالة المخ من الجمجمة سليمة. ثم يتم تشريح نصف الكرة electroporated (يسار) بعيدا عن الدماغ وتتم إزالة المرفقة منتصف الدماغ الأنسجة. في جميع أنحاء تشريح الرعاية الإجراء المتخذة للا ضرر السحايا المغطي نصف الكرة المخية الأيسر القشرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح مرة يتم نقل كل جنين في HBSS باستخدام pipettor مع خفض تلميح ماصة 1 مل. وطرد نصف الكرة برفق على إدراج ثقافة الكولاجين المغلفة. يتم ترتيب ما يصل إلى نصف الكرة إإكسبلنتس 6 الجانب الإنسي لأسفل على كل إدراج 24 ملم. تتم إزالة ترتيب مرة واحدة، HBSS الزائدة من إدراج ويتم وضعها بعد ذلك في واحدة إدراج 35 مم جيدا طبق 6 أيضا. يحتوي البئر إكساءctly 2،7 مل من وسائل الإعلام: وسائل الإعلام F12-DMEM تحتوي على Glutamax وتستكمل مع 2٪ B-27، 1٪ و 1٪ G5-البنسلين بكتيريا. يمكن pipetted بضع قطرات من وسائل الإعلام من البئر على رأس كل يزدرع، ولكن لا تقم بإضافة وسائل الإعلام الزائد عن 2،7 مل لكل بئر الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم وضع إإكسبلنتس على مرشحات الكولاجين يتم وضع صحن يحتوي على 6 جيدا إإكسبلنتس في غرفة بيلوبس (BR) روتنبرج (يحتوي أيضا على طبق الرطوبة من الماء). هي التي غرست A 95٪ / 5٪ أكسجين / CO خليط الغاز 2 في غرفة لمدة لا تقل 1 دقيقة قبل اغلاق اغلاق الدائرة وفصل 95٪ / 5٪ أكسجين / CO إمدادات الغاز 2 أنبوب. ثم يتم وضع الدائرة BR إلى 37 درجة مئوية زراعة الأنسجة حاضنة للفترة المتبقية من الفترة الثقافة، 1-2 DIV. </li></ol> 3. تثبيت من الأنسجة يزدرع لعلم الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء الدخان إعداد الحل تثبيت باجانو من جانب أول مجموعة ال 8 solubilizing من بارافورمالدهيد في 100 مل من مسخن (دي &amp; ~ 80ز؛ C) DDH 2 O. إضافة قطرات 1-3 تتركز هيدروكسيد الصوديوم لتعزيز الانحلالية ويحرك المزيج بلطف. solubilized مرة واحدة مزيج الحل بارافورمالدهيد 8٪ 1:1 مع الحل الذي هو 500 ملم السكروز، HEPES 100 ملم، درجة الحموضة 7.4، 50 ملم MgCl 2 و 5 مم للبوكل تركيز النهائي من بارافورمالدهيد 4٪ في 250 ملي HEPES السكروز 50 مم ، 25 ملم MgCl 2، 2.5 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإصلاح إإكسبلنتس الحارة الحل الإصلاح باجانو إلى 37 ° C. إزالة بسرعة معظم وسائل الإعلام من كل ثقافة DMEM/F12 جيدا وإضافة 5 مل من إصلاح باجانو إلى كل بئر من إإكسبلنتس. تأكد من تغطية كل يزدرع تماما في الإصلاح. إصلاح 1 ساعة في RT. لا تقم بإزالة إإكسبلنتس من مرشح قبل 1 ساعة من التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تثبيت الإصلاح إزالة الحل باجانو واستبدال الحل باجانو دون الإصلاح (250 ملي ملي HEPES السكروز 50، 25 ملم MgCl 2، 2.5 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.4). إضافة بضع قطرات من أزيد الصوديوم 10٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى تضمين. </li></ol> 4. التضمين وSectioning لعلم الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجلد العجل حل الجيلاتين 10٪ من solubilizing 10 غرام من العجل الجلد الجيلاتين في 100 مل من الماء الدافئ (55-60 ° C). وضع حل الجيلاتين على طبق ساخن لتعيين 60 ° C وعباب دوري حتى solubilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حوالي 10 مل من محلول الجيلاتين 10٪ في الجزء السفلي من طبق بتري الطول 10 و 30 دقيقة تسمح لترسيخ. وهذه الصورة &quot;لوحة&quot; لتضمين إإكسبلنتس. يمكن لهذه أن تكون منصات معدة مسبقا أيام وتخزينها في C. ° 4 استخدام مسطرة لرسم الشبكة على الجزء السفلي من طبق بتري ونقل إإكسبلنتس الفردية في كل مربع من الشبكة. إزالة المتبقية باجانو الحل واستخدام pipettor، مع تغطية كل يزدرع حل الجيلاتين الدافئ 10٪ والسماح لترسيخ. بالإضافة إلى ذلك بطء استئناف حل الجيلاتين حتى يتم محاطة بالكامل من قبل كل يزدرع الجيلاتين، مع الحرص على عدم ذوبان لوحة بإضافة الكثير جدا الحارة الجيلاتين في آن واحد. السماح لتتصلب الجيلاتين لللساعة 1 ~. وبمجرد أن تصلب individويمكن خفض إإكسبلنتس يو ايه ال في كتل صغيرة من الجيلاتين. ثم يتم إضافة لبنات ثابتة في باجانو إصلاح ساعة لمدة 24-48 قبل تقطيع مع vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع إإكسبلنتس الجيلاتين في كتل البصلة الشمية ويصل مقطوع في الطائرة الاكليلية في سمك ميكرومتر 100. يتم جمع المقاطع وتخزينها في PBS + أزيد الصوديوم 0.1٪ في 4 درجات مئوية حتى تجهيز المناعى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ الكشف المناعى عن طريق تحويل الأقسام إلى لوحة بئر 24 (2-3 أقسام لكل بئر). أول كتلة غير محددة الأجسام المضادة ملزمة بإضافة 0.5 مل + B PBST (PBS + 0.5٪ تريتون X 100 و 2٪ BSA) إلى كل بئر، 1 ساعة احتضان مع اهتزاز لطيف. ثم يتم تخفيف الأجسام المضادة المناسبة الابتدائية في PBST + B وبنسبة 0.4 مل لكل بئر لالحضانة بين عشية وضحاها في RT. يغتسل بها مع 3X الأولية PBS يغسل ما لا يقل عن 10 دقيقة لكل منهما. الجسم المضاد الثانوي و 2 ميكروغرام / مل هويشت 33342 مخففة ثم وصمة عار في PBST النووية + B ويتم تحضين العينات لمدة 2 ساعة في RTمع اهتزاز لطيف. يتم تنفيذ ثلاثة يغسل PBS (10 دقيقة لكل منهما) ومن ثم يتم تحميل المقاطع على الشرائح باستخدام 90٪ 50 ملي تريس الجلسرين، pH7.4، ووسائل الإعلام في تصاعد مستمر. </li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

وقد قمنا بتحسين وتقييم نموذج تجريبي - إإكسبلنتس نصف الكرة كله - لدراسة التنمية القشرية في وقت مبكر (E13 E15-). أثبت نموذجا مفيدا لتحليل الهجرة وتمايز الخلايا العصبية من نسب مثير تشكل طبقة 6 من قشرة الدماغ 25،37. مزايا مبدأ النظام هي 1) النمو عضوي النمط لمدة 2 DIV، 2) إعداد ب?...

والثدييات أشكال قشرة الدماغ من خلال الهجرة متضافرة، والانتشار والتمايز للخلايا العصبية ولدت على التوالي. ولادة كل الخلايا العصبية في منطقة البطين (VZ) ويهاجر من VZ إلى منطقة وسيطة (IZ)، وتشكيل لوحة القشرية (CP) 1. لأنها تمر من خلال المجالات المختلفة القشرية، الخلايا العصبية المهاجرة عرض وسائط متعددة من الهجرة 2،3 التي تعتمد على البيئة خارج الخلية والعناصر الخلوية الأخرى (مثل الخلايا الدبقية شعاعي) داخل الأنسجة النامية. الخلايا العصبية القشرية اعتقال ثم الترحيل في الجزء العلوي من لوحة لتشكيل القشرية في عمليات الاعتقال تتزامن الهجرة العصبية و 4 dendritogenesis. يبدأ التنمية القشرية بين 11-13 يوما الجنينية (E11-13) من 5 إلى إنشاء طبقة ضفيري البدائية 6 أو preplate (PP)، طبقة من الخلايا العصبية التي يعتلي رائدة في VZ. محتملطبقة 6 الخلايا العصبية القشرية (أي الخلايا العصبية القشرية 1 لدت في VZ) ثم توجيه بهم somata في نمط النمطية ويندمج في طبقة متميزة في PP 7. تقسيم هذه الأحداث إلى preplate (طبقة المستقبل القشرية 1) هامشية سطحية وعميقة منطقة، وهذا الأخير يتألف من خلايا subplate (طبقة قشرية عابرة 7). هذه العملية، تسمى تقسيم preplate، هو حدث تأسيسي في النمو المستقبلي للقشرة الدماغ 8. وقد تم تحديد العديد من الطفرات الوراثية التي تعطل مختلف جوانب التنمية القشرية 9. ويمكن أيضا أن تتأثر التنمية القشرية سلبا التعرض للسموم بلعها مثل الكوكايين 10 و الكحول 11. لأن التشوهات القشرية التي تنشأ خلال التنمية هي من المساهمين المحتمل أن الاضطرابات العصبية (مثل التوحد وانفصام الشخصية)، والتحقيقات التجريبية للاضطرابات في التنمية القشرية متأصلةالمهم لي. ولذلك من الأهمية بمكان وضع نهج لدراسة التنمية القشرية التي تسمح المقايسات السريع للآثار السمية الوراثية أو التي تحفظ ولكن أيضا التفاعلات الممكنة بين الخلايا العصبية التمييز، وغيرها من أنواع الخلايا المصفوفة خارج الخلية (ECM) خلال هذه الفترة المبكرة من نمو الدماغ 12 . وقد وفرت إإكسبلنتس شريحة 13 مثل هذا النظام واستخدمت على نطاق واسع في التنمية فحص الخلايا العصبية القشرية 14-16. ومع ذلك، يمكن المقايسات شريحة تعاني من عيب أن الهجرة العصبية ويمكن أن يكون غير طبيعي التصفيح 17 ربما بسبب الضرر الذي يلحق الخلايا السحائي التي تحيط الدماغ النامية ومرساة وشعاعي الدبقية سقالة. كما قد الدبقية الألياف الشعاعية هي الركيزة الهامة لتعطيل الخلايا العصبية القشرية 18 الهجرة من الصفيحة القاعدية عن طريق تشريح تعطيل محليا العمارة الدبقية شعاعي وتؤدي إلى الهجرة القشرية تغييرها. وبالإضافة إلى ذلك سليدائرة الهندسة المدنية من السطوح إإكسبلنتس يوفر المنطقة من الخلايا الميتة التي قد تغير من تركيبة طبيعية من ECM في هذه المجالات. وقد ركزت المناهج الأكثر حداثة تحليلهم على خلايا تقع في عمق شريحة التي تحيط بها أنواع الخلايا المناسبة صحية وECM. ومع ذلك، في بعض الحالات يمكن لهذه المناهج الجديدة تتطلب أن شريحة المثقفين الأصلي سميكة يكون البرد مقطوع مقطوع أو البارافين، بعد التثبيت بحيث يتم الداخلية عادية نسبيا من شريحة المتاحة للتحليل 19-21. كل من vibratome الأصلي تقطيع لإعداد شرائح حية للثقافة وكذلك cryosectioning اللاحقة من شرائح محددة للتحليل تتطلب الرعاية والجهد لهذه المقايسات للعمل. لتوفير بسيطة، نهج تكميلية لدراسات التنمية القشرية في وقت مبكر، وقمنا بتعديل النهج القائمة شريحة 13 إلى تسهيل الدراسات القشرية للتنمية في وقت مبكر. وقد وضعنا WHأوله نموذج يزدرع نصف الكرة مماثلة لنموذج موجود E14 نصف الكرة بأكملها التي تشارك الثقافات تهز في 65 دورات في الدقيقة والنمو عضوي النمط يسمح ل16-18 ساعة 22،23. في نهجنا، يتم وضع إإكسبلنتس نصف الكرة كله على غشاء شبه منفذ 13 مع الأكسجين في جو الثقافة العالية 21،24 تمديد نمو عضوي النمط القشرية لمدة 48 ساعة. هذا النهج يسمح أيضا الصعق الكهربائي ثابت من الخلايا العصبية النامية القشرية. تتم إزالة الأجنة من الرحم وelectroporated DNA البلازميد لإدخال ويتم تشريح الدماغ الانتهائي ثم. يتم عزل كل نصف الكرة ووضعها أسفل على الجانب الإنسي مرشح الكولاجين المغلفة. ويستزرع ثم ​​يزدرع لمدة 48 ساعة، وهي الفترة التي تشمل تقسيم preplate 8. خلال الفترة الثقافة، L6 الخلايا العصبية من تطوير الخلايا العصبية مقدمة لتمييز 25، صحيح داخل لوحة القشرية. طوال هذه الفترة الناميةوتحيط الخلايا العصبية من قبل ECM المناسبة والتي من شأنها أن أنواع الخلايا مواجهة الخلية المقابلة في الجسم الحي. وقد أثبت هذا النظام بالفعل قيمة في فك رموز أحداث الخلوية التي تكمن وراء سمية الإيثانول 26، وتشكيل طبقة 6 preplate تقسيم 7،25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

القشرية التنمية ينطوي على التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية وغير العصبية العناصر بما في ذلك الخلايا السلائف، والأوعية الدموية، والسحايا المصفوفة خارج الخلية المرتبطة بها. لأنها توفر بيئة مناسبة عضوي النمط، وغالبا ما تستخدم إإكسبلنتس شريحة القشرية للتحقيق في تلك التفاعلات العصبية التي تتحكم التمايز والتنمية. على الرغم من فائدة، لا يمكن للنموذج يزدرع شريحة تعاني من عيوب بما في ذلك التصفيح الخلوية الشاذة والهجرة. نحن هنا نورد ككل يزدرع نصف الكرة المخية نظام لدراسات التنمية في وقت مبكر القشرية التي هي أسهل لإعداد شرائح من القشرية وعروض الهجرة عضوي النمط ثابت والتصفيح. في هذا النظام النموذجي، التصفيح المبكر وأنماط الهجرة بشكل طبيعي لمدة يومين في المختبر، بما في ذلك فترة تقسيم preplate خلالها طبقة قشرية المحتملين ستة أشكال. ونحن بعد ذلك وضعت الصعق الكهربائي الرحم EX (EUEP)النهج الذي يحقق النجاح ~ 80٪ في استهداف التعبير GFP إلى الخلايا العصبية في القشرة النامية الإنسي الظهرية. ويزدرع نصف الكرة كله يجعل من تطوير نموذج القشرية في وقت مبكر للوصول للتدخل، الصعق الكهربائي الدوائية والنهج التصوير الحية. هذا الأسلوب يتجنب الجراحة المطلوبة من البقاء على قيد الحياة في الرحم الصعق الكهربائي (IUEP) النهج مع تحسين كل من ترنسفكأيشن والمساحي الاتساق الاستهداف. وهذه الطريقة تسهل من الدراسات التجريبية العصبية الهجرة، والانتشار والتمايز.

والجنينية القشرة القوارض يسلك الانحدار العصبية الوراثية عرضية خلال الفترة الإنمائية، مثل القشرة المخية الحديثة أن ما يقرب من 1 الوحشي اليوم أكثر نضجا من القشرة المخية الحديثة الإنسي الظهرية 28. وبالتالي يتم إنشاء الجزء الأكبر من طبقة 6 الخلايا العصبية (أي ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

يصف هذا البروتوكول إجراء يزدرع المحسنة التي ينطوي<em&gt; السابقين الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي، وتشريح ثقافة نصفي الكرة المخية بالكامل من الماوس الجنينية. إعداد الدراسات الدوائية ويسهل المقايسات وظيفة الجين خلال التنمية القشرية في وقت مبكر.

بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K Views.  SUNY Upstate Medical University. يصف هذا البروتوكول إجراء يزدرع المحسنة التي ينطوي السابقين الرحم الصعق الكهربائي، وتشريح ثقافة نصفي الكرة المخية بالكامل من الماوس الجنينية. إعداد الدراسات الدوائية ويسهل المقايسات وظيفة الجين خلال التنمية القشرية في وقت مبكر.

Video: Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا<em&gt; في الرحم</em&gt; التثقيب الكهربائي و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ضوء بارد الفرز

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

عزل السائل المخي الشوكي من أجنة القوارض للاستخدام مع إإكسبلنتس مشرح القشرية الدماغية

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

-النوع الفرعي انتقائية Electroporation للمن القشرية Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المستقبلات الضوئية

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...