Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones (NINDS NS066071) y el NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Los autores agradecen al Dr. Robert Quinn y el personal del Departamento de Recursos Animales de laboratorio para el cuidado de los animales. Damos las gracias a Judson Belmont para el apoyo técnico, Nicole Belletier de asistencia como miembro de Verano de Investigación de Pregrado (SURF). También agradecemos al Dr. David Cameron y edita los comentarios sobre una versión anterior del manuscrito.

1. Electroporaciones Ex utero con Expression proteína verde fluorescente plásmido <ol><li> Plásmido de ADN soluciones de inyección se preparan con CAG-eGFP ADN 27 diluido a la concentración de trabajo final de 0,33 mg / ml en ddH 2 O. Qiagen Endo-gratis-Maxi Preps se utilizan para purificar el plásmido a partir de bacterias transformadas. Colorante verde rápido en ~ 0,02% (w / v final) se añade a la solución de ADN como un trazador de inyección. </li><li> Para preparar el área quirúrgica, rocíe mesa de trabajo y la etapa microscopio de disección con una solución de etanol al 70% y secar. Rocíe tijeras y pinzas quirúrgicas, con 70% de etanol antes de la disección y seque. </li><li> Temporizadas embarazadas suizos / Webster presas son sacrificados en E13 por transferencia a una cámara llena de CO 2 de un cilindro presurizado y la presa se ​​monitorea hasta que todo movimiento haya cesado por lo menos durante 1 min. Después del sacrificio por inhalación de CO 2, los embriones se extrae del útero y se colocó enuna placa de Petri de 10 cm de hielo frío que contiene solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). </li><li> Diseccionar cuidadosamente cada embrión a partir de las membranas que rodean extraembryonic y mantenerse en hielo-frío HBSS. </li><li> Transferir cada embrión individual a un segundo 10 cm placa de Petri que contiene HBSS fría. Usar una jeringa de Hamilton para inyectar 2-3 l de la mezcla de ADN verde rápido en el ventrículo del hemisferio cerebral izquierdo, teniendo cuidado de inyectar en una zona cortical espacialmente separada de la zona cortical para el análisis futuro. </li><li> Para electroporar, mantenga el embrión suavemente con fórceps y ligeramente colocar la pala del electrodo positivo pinza en la línea media dorsal de la cabeza y colocar suavemente la pala negativo debajo de la barbilla embrión. Electroporaciones se consiguen con un electroporador BTX830 programado para entregar cinco pulsos de 30 V de 50 ms de duración, separadas por intervalos de 950 mseg. Estos ajustes son para el modelo BTX830. Otros sistemas pueden ser utilizados de acuerdo con INSTRUCCIO fabricantens. </li></ol> 2. Todo el hemisferio Preparación del explante <ol><li> Después de la electroporación de los embriones se colocan de nuevo en hielo-frío HBSS. El cerebro es removido con dos pinzas de joyero º 5 para quitar la piel y el cráneo cartilaginoso de la cabeza del embrión. Una pinza se desliza entonces debajo del cerebro para eliminar el cerebro intacto del cráneo. El hemisferio electroporated (izquierda) se diseca lejos del cerebro y apegado a mediados de tejido cerebral se elimina. Durante todo el procedimiento de disección cuidado se toma para no dañar las meninges que recubren el hemisferio cortical izquierdo. </li><li> Una vez diseccionado cada embrión se transfiere en HBSS utilizando una pipeta con un corte de punta de pipeta 1 ml. El hemisferio está expulsarlo lentamente hacia una inserción de colágeno cultura revestido. Hasta seis explantes hemisferio están dispuestas lado medial hacia abajo en cada inserción de 24 mm. Una vez dispuestas, HBSS en exceso se elimina de la pieza de inserción y la pieza de inserción se coloca a continuación en uno 35 mm pocillo de una placa de 6 pocillos. El pozo contiene exactly 2,7 ​​ml de medios de comunicación: DMEM-F12 medio que contenía Glutamax y suplementado con 2% de B-27, 1% G5 y 1% de penicilina-Strep. Unas pocas gotas de los medios de comunicación del bien puede ser una pipeta en la parte superior de cada explante, pero no añadir medios de comunicación por encima de la original de 2,7 ml por pocillo. </li><li> Una vez que los explantes han sido colocados sobre filtros de colágeno de la placa de 6 pocillos que contiene los explantes se coloca en un Billups Rothenberg (BR) de la cámara (que también contiene un plato de humidificación de agua). Un 95% / 5% de oxígeno / CO 2 mezcla de gases se infunde en la cámara durante al menos 1 min antes de sellar el cierre de cámara y desconectar el 95% / 5% de oxígeno / CO 2 tubo de suministro de gas. La cámara de BR se coloca entonces en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejido para el resto del período de cultivo, 1-2 DIV. </li></ol> 3. La fijación del tejido de explante para histología <ol><li> En una campana de humos preparar la solución de fijación Pagano por primera solubilizante 8 g de paraformaldehido en 100 ml de precalentado (~ 80 &amp; deg; C) ddH 2 O. Añadir 1-3 gotas concentradas de NaOH para promover la solubilización y revuelva suavemente. Una vez solubilizado mezclar la solución de paraformaldehído al 8% 1:1 con una solución que es 500 mM de sacarosa, 100 mM de Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM de KCl, para una concentración final de 4% de paraformaldehído en 250 mM de Hepes 50 mM de sacarosa , 25 mM de MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Para solucionar los explantes calentar la solución de arreglo Pagano a 37 ° C. Quite rápidamente la mayoría de los medios de comunicación DMEM/F12 de cada pocillo de cultivo y añadir 5 ml de Fix Pagano a cada pocillo de explantes. Asegúrese de cubrir completamente cada explante en fijo. Fijar durante 1 hora a RT. No retire explantes de filtro antes de 1 hora de la fijación. </li><li> Después de la fijación eliminar la solución de arreglo Pagano y reemplazar con solución Pagano sin fijar (250 mM de sacarosa 50 mM Hepes, 25 mM de MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Añadir unas gotas de azida de sodio al 10% y se almacena a 4 º C hasta su incorporación. </li></ol> 4. Incorporación y Sectioning para histología <ol><li> Preparar una solución de piel de ternero 10% de gelatina por solubilización de 10 g de gelatina de piel de ternera en 100 ml de agua caliente (55-60 ° C). Coloque solución de gelatina en un plato caliente ajustado a 60 ° C y agitar periódicamente hasta solubilizado. </li><li> Vierta aproximadamente 10 ml de la solución de gelatina al 10% en la parte inferior de una placa de Petri de 10 cm y 30 min para permitir que solidifique. Esto formará un &quot;pad&quot; para incorporar los explantes. Estas pastillas pueden ser preparadas de antemano días y se almacenó a 4 ° C. Use una regla para dibujar una cuadrícula en la parte inferior de la placa de Petri y transferir los explantes individuales en cada cuadro de la cuadrícula. Eliminar residual solución Pagano y usando una pipeta, cubrir cada explante con solución caliente 10% de gelatina y dejar que se solidifique. Reanudar la adición lenta de la solución de gelatina hasta que cada explante está completamente rodeada por gelatina, teniendo cuidado de no fundir la almohadilla por la adición de demasiado caliente gelatina a la vez. Permita que la gelatina se endurezca durante aproximadamente 1 hora. Una vez endurecido el indiexplantes UAL puede ser cortada en pequeños bloques de gelatina. Los bloques se después de la fijada en Pagano fijar durante 24-48 horas antes de seccionar con un vibrátomo. </li><li> Los explantes en bloques de gelatina se coloca bulbo olfatorio y seccionada en el plano coronal a 100 m de espesor. Las secciones se recogen y almacenan en PBS + azida sódica al 0,1% a 4 º C hasta su procesamiento inmunohistoquímico. </li><li> Detección inmunohistoquímica se realiza mediante la transferencia de las secciones en una placa de 24 pocillos (2-3 secciones por pocillo). Primer bloque no específica de unión del anticuerpo mediante la adición de 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 y 2% de BSA) a cada pocillo, se incuba 1 hora con agitación suave. El anticuerpo primario apropiado es entonces diluido en PBST + B y 0,4 ml por pocillo se añaden para la incubación durante la noche a RT. La primaria se lavó con 3X lavados de PBS durante al menos 10 min cada uno. El anticuerpo secundario y 2 g / ml Hoechst 33342 tinción nuclear se diluyen a continuación en PBST + B y las muestras se incubaron durante 2 horas a RTcon agitación suave. Tres lavados con PBS (10 min cada una) se llevan a cabo y, a continuación, las secciones se montaron sobre portaobjetos utilizando un 90% de glicerol 50 mM Tris, pH 7,4, los medios de montaje. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Hemos mejorado y evaluó un modelo experimental - explantes enteros hemisferio - para el estudio del desarrollo cortical temprano (E13-E15). El modelo ha demostrado ser útil para el análisis de la migración y la diferenciación del linaje neurona excitatoria que constituye la capa 6 de la corteza cerebral 25,37. Las principales ventajas del sistema son: 1) el crecimiento organotípico para DIV 2, 2) la sencillez de la preparación, y 3) el acceso experimental a las neuronas para la electroporación, la man...

Las formas de la corteza cerebral de mamíferos a través de la proliferación concertada migración y diferenciación de las neuronas generadas sucesivamente. Cada neurona nace en la zona ventricular (VZ) y migra desde el VZ en la zona intermedia (IZ), formando la placa cortical (CP) 1. A medida que pasan a través de diferentes dominios corticales, las neuronas que migran mostrar múltiples modos de migración 2,3 que dependen del ambiente extracelular y otros elementos celulares (por ejemplo, la glía radial) dentro del tejido en desarrollo. Las neuronas corticales entonces detener la migración en la parte superior de la placa de conformación cortical en los procesos coincidentes de detención migración neuronal y 4 dendritogenesis. Desarrollo cortical se inicia entre días embrionarias 11-13 (E11-13) 5 mediante el establecimiento de la capa plexiforme primordial 6 o la presiembra (PP), una capa de neuronas pioneras que recubre el VZ. FuturoCapa 6 neuronas corticales (es decir, las neuronas corticales primero nacido en el VZ) y luego orientar su Somata en un patrón estereotipado y se unen en una capa distinta en el PP 7. Estos eventos dividir la presiembra en un superficial marginal (futura capa cortical 1) y una zona profunda, el segundo compuesto de células subplaca (capa cortical transitoria 7). Este proceso, denominado fraccionamiento presiembra, es un acontecimiento fundamental en el crecimiento futuro de la corteza cerebral 8. Muchas mutaciones genéticas se han identificado que interrumpir diversos aspectos del desarrollo cortical 9. Desarrollo cortical también pueden sufrir efectos negativos por la exposición a las toxinas ingeridas como la cocaína y el alcohol 10 11. Debido a las malformaciones corticales que surgen durante el desarrollo probablemente contribuyen a los trastornos neurológicos (por ejemplo, el autismo, la esquizofrenia), las investigaciones empíricas de las perturbaciones del desarrollo cortical son inherentesmente importante. Por tanto, es de gran importancia para establecer enfoques para estudiar el desarrollo cortical que permiten ensayos rápidos de los efectos genéticos o toxina, pero que también preservar las posibles interacciones entre las neuronas diferenciadoras, otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) durante este período temprano del desarrollo del cerebro 12 . Explantes rebanada 13 han proporcionado un sistema y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo del ensayo neurona cortical 14-16. Sin embargo, los ensayos de rebanada puede adolecen del inconveniente de que la migración neuronal y la laminación puede ser anormal 17 posiblemente debido al daño a las células de las meninges que rodean el cerebro en desarrollo y el anclaje radial glial andamiaje. Como las fibras gliales radiales son un importante sustrato para la migración cortical neuronal 18 disrupción de la membrana basal por corte local puede alterar la arquitectura glial radial y causar la migración cortical alterada. Además el sliced superficies de explantes proporciona una región de células muertas que pueden alterar la composición normal de la ECM en estas áreas. Los enfoques más recientes se han centrado su análisis en células localizadas profundamente en el sector que están rodeados de apropiados tipos de células sanas y ECM. Sin embargo, en algunos casos, estos nuevos enfoques pueden exigir que el original rebanada gruesa cultivadas ser crio-seccionado o seccionado en parafina después de la fijación de manera que el interior relativamente normal de la rebanada está disponible para el análisis 19-21. Tanto el vibratome original de seccionamiento para preparar las rodajas en vivo para el cultivo, así como la posterior de las rebanadas cryosectioning fijos para el análisis requieren un cuidado y esfuerzo para estos ensayos a trabajar. Proporcionar un enfoque simple y complementaria para los estudios del desarrollo cortical temprano, hemos modificado una rebanada enfoques existentes 13 para facilitar los estudios del desarrollo cortical temprano. Hemos desarrollado un whhemisferio ole explante similar a un modelo existente E14 hemisferio que participan cultivos con agitación a 65 revoluciones por minuto y el crecimiento organotípico permitido para 16-18 horas 22,23 modelo. En nuestro enfoque, los explantes enteros hemisferio se colocan en la membrana semipermeable 13 con en una atmósfera de oxígeno alta cultura 21,24 para extender el crecimiento cortical organotípicos durante 48 horas. Este enfoque también permite la electroporación coherente de desarrollo de las neuronas corticales. Los embriones se extrae del útero y electroporación para introducir ADN plásmido y el telencéfalo es diseccionado a continuación. Cada hemisferio se aísla y se colocan lado medial hacia abajo sobre un filtro revestido con colágeno. El explante se cultivan entonces durante un período de 48 horas, un periodo que abarca dividir la presiembra 8. Durante el período de cultivo, L6 neuronas se desarrollan a partir de precursor a diferenciarse neurona 25, en posición correcta dentro de la placa cortical. A lo largo de este período, el desarrolloneurona está rodeado por el ECM apropiada y tipos de células que se enfrentaría la celda correspondiente en vivo. Este sistema ya ha demostrado su valía en el desciframiento de los eventos celulares que subyacen a la toxicidad del etanol 26, capa 6 y formación presiembra división 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Desarrollo cortical implica interacciones complejas entre las neuronas y no neuronales elementos incluyendo células precursoras, los vasos sanguíneos, las meninges y la matriz extracelular asociada. Debido a que proporcionan un entorno adecuado organotípico, los explantes corticales rebanada se utilizan a menudo para investigar las interacciones que controlan la diferenciación neuronal y el desarrollo. Aunque es beneficioso, el modelo de explante rebanada puede sufrir de inconvenientes que incluyen la laminación celular aberrante y la migración. Aquí mostramos un todo sistema cerebral explante hemisferio para estudios de desarrollo temprano cortical que es más fácil de preparar que las rebanadas corticales y programas de migración coherente organotípico y laminación. En este modelo de sistema, laminación principios y patrones de migración continuará normalmente durante un período de dos días in vitro, incluido el período de dividir la presiembra, durante el cual la capa cortical prospectivo seis formas. Desarrollamos entonces un ex electroporación in utero (EUEP)enfoque que logra el éxito ~ 80% en la selección de buenas prácticas agrarias expresión en las neuronas en desarrollo en la corteza medial dorsal. El modelo de explante hemisferio entero hace que el desarrollo temprano cortical accesible para la electroporación, la intervención farmacológica y enfoques en vivo de imágenes. Este método evita la cirugía supervivencia requeridos en el útero de la electroporación (IUEP) enfoques al tiempo que mejora tanto la transfección y la consistencia de área de focalización. Este método facilitará los estudios experimentales de la proliferación neuronal migración y diferenciación.

La corteza de embriones de roedores exhibe un gradiente transversal neurogenético durante todo el período de desarrollo, de manera que neocórtex lateral es de aproximadamente 1 día más maduro que dorsal medial neocórtex 28. El grueso de la capa 6 neuronas se generan en (es decir, exhiben su final de la fase S) en E12 en la corteza lateral (también llamado campo 40 5) y en E13 en la corteza medial dorsal (también llamado campo 1 5). Dividir la presiembra se inicia aproxim...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que implica<em&gt; Ex utero</em&gt; Electroporación, la disección y la cultura de la totalidad de los hemisferios cerebrales del ratón embrionario. La preparación facilita los estudios farmacológicos y ensayos de la función de genes durante el desarrollo cortical temprano.

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K vistas.  SUNY Upstate Medical University. Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que implica Ex utero Electroporación, la disección y la cultura de la totalidad de los hemisferios cerebrales del ratón embrionario. La preparación facilita los estudios farmacológicos y ensayos de la función de genes durante el desarrollo cortical temprano.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Investigación

Neurociencias

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...