Este trabalho foi financiado doações de NINDS (NS066071) e da NIAAA. (P50AA017823) para ECO. Os autores agradecem ao Dr. Robert Quinn e os funcionários do Departamento de Recursos Animais de Laboratório para cuidar dos animais. Agradecemos Judson Belmont para suporte técnico, Nicole Belletier de assistência como um pesquisador Verão Graduação (SURF). Agradecemos também o Dr. David Cameron para comentários e edições em uma versão anterior do manuscrito.

1. Anteriores electroporações utero com expressão da proteína verde fluorescente plasmídeo <ol><li> Soluções para injecção de DNA de plasmídeo são preparados com CAG-eGFP DNA 27 diluído para a concentração de trabalho final de 0,33 mg / ml em DDH 2 O. Qiagen Endo-free Maxi-Preps são utilizadas para purificar o plasmídeo a partir de bactérias transformadas. Corante verde rápido a ~ 0,02% (w / v final) é adicionado à solução de DNA, como um marcador de injecção. </li><li> Para preparar a área cirúrgica, spray para baixo bancada de trabalho e estágio estereomicroscópio com uma solução de etanol 70% e seque. Pulverizar uma tesoura cirúrgica e pinças com etanol 70% antes da dissecção e seque. </li><li> Cronometrados grávidas suíços / Webster barragens são sacrificados no E13 por transferência para uma câmara cheia de CO 2 a partir de um cilindro pressurizado e a barragem é monitorizado até que todo o movimento parou, durante pelo menos 1 min. Após o sacrifício por inalação de CO2, os embriões são removidos do útero e colocados emde 10 cm de placa de Petri contendo gelada solução salina balanceada de Hanks (HBSS). </li><li> Dissecar cuidadosamente cada embrião das membranas que envolvem extraembryonic e manter geladas HBSS. </li><li> Transferir cada embrião individualmente para uma placa de 10 cm segundo Petri contendo HBSS frio. Use uma seringa Hamilton de injectar 2-3 ul da mistura de DNA rápido verde no ventrículo do hemisfério cerebral esquerdo, tendo o cuidado de injectar-se numa área cortical espacialmente separada da área cortical para análise futura. </li><li> Para electroporate, mantenha o embrião suavemente com uma pinça e coloque a pá levemente positivo do eléctrodo de pinça sobre a linha média dorsal da cabeça e levemente coloque a pá negativa por baixo do queixo do embrião. Electroporações são conseguidos com um electroporador BTX830 programado para entregar cinco impulsos de 30 V de 50 ms de duração, separadas por intervalos de 950 mseg. Essas configurações são para o modelo BTX830. Outros sistemas podem ser utilizados de acordo com o fabricante INSTRUÇÕESns. </li></ol> 2. Preparação Explante todo Hemisfério <ol><li> Após a electroporação, os embriões são colocados de volta para gelados HBSS. O cérebro é removido usando duas pinças de joalheiro # 5 para remover a pele e crânio cartilaginoso a partir da cabeça do embrião. A pinça é então deslizado por debaixo do cérebro para remover o cérebro intacto do crânio. O hemisfério electroporated (à esquerda) é, em seguida, dissecado a partir do tecido cerebral e do cérebro médio em anexo é removido. Durante todo o cuidado é tomado procedimento de dissecção para não danificar as meninges que recobrem o hemisfério esquerdo cortical. </li><li> Uma vez que cada dissecados de embriões são transferidos em HBSS, utilizando uma pipeta de 1 ml com uma ponta de pipeta de corte. O hemisfério é expelido suavemente para uma inserção de cultura de colagénio revestida. Até seis explantes hemisfério são dispostos lado medial para baixo em cada pastilha de 24 mm. Uma vez dispostos, HBSS excesso é removido da pastilha e a pastilha é então colocada em um poço de 35 milímetros de um prato de 6 poços. O poço contém exactly 2,7 ​​mL de meio: DMEM-F12 meios contendo Glutamax e suplementado com 2% de B-27, 1% G5 e 1% de Penicilina-Strep. Algumas gotas de meios de comunicação a partir do poço pode ser pipetado em cima de cada explante, mas não se adicione o meio em excesso do original de 2,7 mL por poço. </li><li> Uma vez que os explantes foram colocados em filtros de colagénio do prato de 6 poços contendo os explantes são colocados em um Rothenberg Billups (BR) câmara (que também contém um prato de humidificação com água). A 95% / 5% de oxigénio / CO mistura de gás 2 é injetado na câmara durante pelo menos 1 min antes de selar a câmara fechada e desconectar a 95% / 5% de oxigénio / CO 2 do tubo de abastecimento de gás. A câmara de BR é então colocado a 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante o resto do período de cultura, 1-2 DIV. </li></ol> 3. Fixação de explante para Histologia <ol><li> Numa hotte preparar a solução de fixação Pagano pelo primeiro g 8 solubilizante de paraformaldeído em 100 ml de pré-aquecido (~ 80 &amp; deg; C) DDH 2 O. Adicionar 1-3 gotas de NaOH concentrada para promover a solubilização e agitar suavemente. Uma vez solubilizados misturar a solução de paraformaldeído a 8% de 1:1 com uma solução que é de 500 mM de sacarose, 100 mM de Hepes, pH 7,4, 50 mM de MgCl2, 5 mM de KCl para uma concentração final de 4% de paraformaldeído em 250 mM Hepes 50 mM de sacarose , 25 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4. </li><li> Para corrigir os explantes aquecer a solução fix Pagano e 37 ° C. Remover rapidamente a maior parte dos meios DMEM/F12 de cada poço de cultura e adicionam-se 5 ml de Fix Pagano a cada poço de explantes. Certifique-se de cobrir cada explante completamente na correção. Fixar durante 1 h à RT. Não remova explantes de filtro antes de 1 hora da fixação. </li><li> Depois de remover a solução de fixação fix Pagano e substituir com Pagano solução sem correcção (250 mM de sacarose 50 mM de Hepes, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4). Adicionar algumas gotas de azida de sódio a 10% e armazenar a 4 ° C até que a incorporação. </li></ol> 4. Incorporação e Sectioning para Histologia <ol><li> Prepara-se uma solução de 10% de pele de vitela por solubilização de gelatina 10 g de gelatina de pele de vitelo em 100 ml de água quente (55-60 ° C). Colocar em solução de gelatina a uma placa quente a 60 ° C e periodicamente redemoinho até solubilizado. </li><li> Verter cerca de 10 ml da solução de gelatina a 10% na parte inferior de uma placa de 10 cm de Petri e deixar 30 minutos para solidificar. Isto irá formar um &quot;pad&quot; para a incorporação de explantes. Estas almofadas podem ser preparadas com antecedência dias e armazenado a 4 ° C. Use uma régua para desenhar uma grelha no fundo da placa de Petri e transferir explantes individuais em cada caixa da grelha. Remover a solução residual Pagano e utilizando um pipetador, cobrir cada explante, com solução a 10% de gelatina quente e deixa-se solidificar. Retomar a adição lenta de uma solução de gelatina, até que cada explante é completamente rodeado por gelatina, tomando cuidado para não derreter a almofada por meio da adição de um excesso de aquecer a gelatina de uma só vez. Permitir a gelatina para endurecer por ~ 1 hora. Uma vez endureceu o indiviexplantes ual pode ser cortado em pequenos blocos de gelatina. Os blocos são pós-fixados em Pagano fixar por 24-48 horas antes da corte com uma vibratome. </li><li> Explantes em blocos de gelatina são posicionados bulbo olfatório-se e seccionadas no plano coronal em 100 um de espessura. As secções são recolhidas e armazenadas em PBS + azida de sódio a 0,1% a 4 ° C até processamento imunohistoquímico. </li><li> Detecção imuno-histoquímica é realizada através da transferência de pontos para uma placa de 24 poços (2-3 pontos por poço). Primeiro bloco de anticorpo de ligação não específica por adição de 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 e 2% de BSA) a cada um, bem incubar 1 hora com agitação suave. O anticorpo primário apropriado é então diluído em PBST + B e 0,4 ml por poço é adicionado por incubação durante a noite à temperatura ambiente. O primário é lavada com PBS 3X lavagens, pelo menos, 10 min cada. O anticorpo secundário e 2 ug / ml de Hoechst 33342 mancha nuclear são então diluídas em PBST + B e as amostras são incubadas durante 2 h à RTcom agitação suave. Três lavagens de PBS (10 min cada) são executados e em seguida, as secções são montadas em lâminas com um 90% de glicerol a 50 mM Tris, pH 7,4, meios de montagem. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Temos melhorado e avaliadas num modelo experimental - explantes hemisfério inteiros - para o estudo do desenvolvimento cortical precoce (E13-E15). O modelo mostrou-se útil para a análise de migração e diferenciação da linhagem neuronal excitatória que constitui a camada 6 do córtex cerebral 25,37. As principais vantagens do sistema são: 1) crescimento organotípica DIV para 2, 2) simplicidade de preparação, e 3) o acesso aos neurónios experimental para a manipulação de electroporação, farmaco...

Os mamíferos cerebrais formas através do córtex concertada migração, proliferação e diferenciação de neurónios sucessivamente gerados. Cada neurónio nasce na zona ventricular (VZ) e migra do VZ na zona intermédia (IZ), formando a placa cortical (CP) 1. À medida que passam através de diferentes domínios corticais, os neurónios migram exibir vários modos de 2,3 a migração dependentes do meio extracelular e de outros elementos celulares (por exemplo, a glia radial) dentro do tecido em desenvolvimento. Neurónios corticais então prender migração no topo da placa de moldagem cortical nos processos coincidentes de prisão migração neuronal e 4 dendritogenesis. Desenvolvimento cortical é iniciada entre os dias embrionários 11-13 (E11-13) 5 a criação da camada plexiforme primordial 6 ou preplate (PP), uma camada de neurónios pioneiras que recobre o VZ. Em perspectivaCamada 6 neurônios corticais (ou seja, os primeiros neurônios corticais nascidos no VZ), em seguida, orientar seu somata em um padrão estereotipado e se fundem em uma camada distinta dentro do PP 7. Estes eventos dividir o preplate em um (camada cortical futuro 1) marginal superficial e uma zona de fundo, o último composto de células subplaca cortical (camada transitória 7). Este processo, denominado divisão preplate, é um evento fundamental para o crescimento futuro do córtex cerebral 8. Muitas mutações genéticas foram identificadas que interromper vários aspectos do desenvolvimento cortical 9. Desenvolvimento cortical também pode ser impactado negativamente pela exposição a toxinas ingeridas como a cocaína e álcool 10 11. Porque malformações corticais que surgem durante o desenvolvimento provavelmente contribui para distúrbios neurológicos (por exemplo, autismo, esquizofrenia), as investigações empíricas de perturbações do desenvolvimento cortical são inerentesly importante. É, portanto, de grande importância para delinear estratégias para estudar o desenvolvimento cortical que permitem testes rápidos de efeitos genéticos ou toxina, mas que também preservar as possíveis interações entre os neurônios de diferenciação, outros tipos de células e da matriz extracelular (ECM) durante esse período inicial do desenvolvimento do cérebro 12 . Explantes de fatia 13 ter fornecido um tal sistema e têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento do ensaio neurónio cortical 14-16. No entanto, ensaios de fatias podem sofrer da desvantagem de que a migração neuronal e laminação pode ser anormal 17 possivelmente devido a danos nas células meníngeas que rodeiam o cérebro em desenvolvimento e ancorar o andaime glial radial. Como radiais fibras gliais são um importante substrato para cortical neurônio interrupção da migração de 18 a lâmina basal por corte pode perturbar localmente arquitetura radial glial e levar a migração cortical alterada. Além disso, a sliced superfícies de explantes proporciona uma região de células mortas, que podem alterar a composição normal do ECM nestas áreas. Abordagens mais recentes têm focado sua análise sobre células localizadas no fundo da fatia que está cercado por adequadas tipos de células saudáveis ​​e ECM. No entanto, em alguns casos, estas abordagens mais recentes podem requerer que a fatia de espessura original de cultura ser crio-seccionado ou parafina seccionado após a fixação, de modo que o interior relativamente normal da fatia é disponibilizada para análise 19-21. Ambos vibratome original seccionamento para preparar as fatias de tempo real para a cultura, bem como o subsequente cryosectioning de fatias fixos para análise requerem cuidados e esforço para estes ensaios para o trabalho. Para fornecer uma abordagem simples e complementar para estudos do desenvolvimento cortical cedo, modificamos uma fatia abordagens existentes 13 para facilitar os estudos do desenvolvimento cortical cedo. Nós desenvolvemos uma whole modelo explante hemisfério semelhante a um modelo existente hemisfério E14 todo que envolveu culturas agitação em 65 rotações por minuto e permitiram o crescimento organotípica para 16-18 horas 22,23. Na nossa abordagem, explantes hemisfério inteiras são colocadas em membrana semi-permeável 13, com uma atmosfera de oxigénio de alta cultura 21,24 estender crescimento cortical organotípica durante 48 horas. Esta abordagem também permite a electroporação consistente de desenvolvimento de neurónios corticais. Os embriões são removidos do útero e electroporado para introduzir o ADN plasmídico e do telencéfalo é então dissecado. Cada hemisfério é isolado e colocado com o lado medial para baixo sobre um filtro revestido com colagénio. O explante é então cultivado durante um período de 48 horas, um período que abrange a divisão preplate 8. Durante o período de cultura, L6 neurônios desenvolvem a partir de precursor para neurónios diferenciados 25, posicionado correctamente no interior da placa cortical. Ao longo deste período, o desenvolvimentoneurónio é cercado pela ECM apropriada e tipos de células que se confrontar a célula correspondente in vivo. Este sistema já provou ser valioso para decifrar os eventos celulares que estão na base toxicidade do etanol 26, a camada de formação de 6 e preplate divisão 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Desenvolvimento cortical envolve complexas interações entre neurônios e não-neuronais, incluindo elementos de células precursoras, vasos sanguíneos, meninges e da matriz extracelular associada. Porque eles fornecem um ambiente adequado organotípica, explantes fatia corticais são muitas vezes utilizados para investigar essas interações que controlam a diferenciação neuronal e desenvolvimento. Embora benéficos, o modelo de explante fatia podem sofrer de inconvenientes, incluindo a laminação celular aberrante e migração. Relatamos aqui um sistema de explante todo hemisfério cerebral para estudos do desenvolvimento cortical precoce, que é mais fácil de preparar do que fatias corticais e programas de migração organotípica consistente e laminação. Neste sistema modelo, laminação precoce e padrões de migração continuar normalmente durante um período de dois dias, in vitro, incluindo o período de separação preplate, durante o qual camada cortical prospectivo seis formas. Em seguida, desenvolvemos um electroporação utero ex (EUEP)abordagem que alcança ~ 80% de sucesso na segmentação expressão GFP para os neurônios em desenvolvimento no córtex dorsal medial. O modelo de explante todo hemisfério faz desenvolvimento precoce cortical acessível para intervenção eletroporação, farmacológicos e abordagens de imagem ao vivo. Este método evita a cirurgia necessária de sobrevivência in utero eletroporação (IUEP) abordagens, melhorando simultaneamente a transfecção e consistência de segmentação de área. Este método irá facilitar os estudos experimentais de neuronal migração, proliferação e diferenciação.

O roedor córtex embrionário apresenta um gradiente neurogenético transversal ao longo do período de desenvolvimento, tais neocórtex que lateral é aproximadamente 1 dia mais maduro do que neocórtex dorsal medial 28. A maior parte da camada 6 neurónios são assim gerado (isto é, exibem a sua última fase S) na E12 no córtex lateral (também chamado Campo 40 5) e em E13 no córtex medial dorsal (também chamado campo 1 5). Dividindo Preplate começa aproximadamente 1 dia ...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica explante<em&gt; Ex utero</em&gt; Dissecção eletroporação, e cultura de todo hemisférios cerebrais do rato embrionário. A preparação facilita estudos farmacológicos e ensaios de função do gene durante o desenvolvimento precoce cortical.

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K visualizações.  SUNY Upstate Medical University. Este protocolo descreve um processo melhorado que implica explante Ex utero Dissecção eletroporação, e cultura de todo hemisférios cerebrais do rato embrionário. A preparação facilita estudos farmacológicos e ensaios de função do gene durante o desenvolvimento precoce cortical.