この作品は、NINDS（NS066071）とNIAAAからの助成金をサポートされていました。 （P50AA017823）エコへ。著者は、ロバート·クインと動物のケアのための実験動物資源学科のスタッフに感謝します。私たちは夏の学部リサーチフェロー（SURF）などの支援については、テクニカル·サポートのためにニコールBelletierをジャドソンベルモントに感謝します。また、コメントにデビッドキャメロンに感謝し、原稿の以前のバージョンで編集します。

プラスミドグリーン蛍光タンパク質発現との1。 のEx子宮内エレクトロポ<ol><li>プラスミドDNAの注射液は、蒸留H 2 O中0.33 mg / mlの最終作業濃度まで希釈したCAG-EGFP DNAを27を用いて製造されるキアゲン遠藤フリーマキシプレップは、形質転換された細菌からプラスミドを精製するために使用されています。 〜0.02％（w / vの最終）での高速グリーン色素が注入トレーサとしてのDNA溶液に添加される。 </li><li>外科領域を用意し、70％エタノール溶液でベンチトップと解剖顕微鏡のステージを下スプレーして拭いてください。前切開に70％エタノールで手術用のハサミとピンセットをスプレーし、水分を拭き取ります。 </li><li>すべての動きは、少なくとも1分間停止するまで時限妊娠スイス/ウェブスターダムは加圧シリンダからCO 2を充填し、ダムが監視されるチャンバ内に転送することによりE13に屠殺されています。 CO 2吸入によって犠牲にした後の胚は子宮から取り出され、内に配置10cmペトリ皿含む氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）。 </li><li>慎重に周囲の胚体外膜から各胚を分析し、氷冷HBSSに保つ。 </li><li>冷HBSSを含む第二の10cmペトリ皿に個別に各胚を転送します。将来の分析のために皮質領域から空間的に分離した皮質領域に注入するために世話をして、左大脳半球の脳室にDNA速い緑混合の2-3μlを注入するためにハミルトンシリンジを使用しています。 </li><li>エレクトロポには、鉗子で軽く胚を保持し、軽く頭の背側正中線上にピンセット電極の正のパドルを置き、軽く胚のあごの下に負のパドルを置く。エレクトロポを950ミリ秒間隔で区切った50ミリ長さの5〜30 Vのパルスを提供するようにプログラムBTX830エレクトロで達成される。これらの設定はBTX830モデル用です。他のシステムは、製造業者の命令に従って使用することができるNS。 </li></ol> 2。全体の半球植準備<ol><li>エレクトロポレーション後の胚は氷冷HBSSに戻されています。脳は胚ヘッドから皮膚と軟骨頭蓋骨を除去するために2つの＃5宝石商の鉗子を用いて除去する。鉗子は、その後、頭蓋骨から無傷の脳を削除するには、脳の下にスライドさせる。エレクトロポレーションした半球（左）は、脳から離れて解剖され、添付された中脳組織が削除されます。解剖手順ケアを通して左半球皮質を覆う髄膜に損傷を与えないように注意されています。 </li><li>一度解剖し、各胚は、カット1ミリリットルピペットチップでピペッターを使用してHBSS中に転送されます。半球は優しくコラーゲンコート培養インサート上に排出されます。最大6つの半球の外植片には、各24ミリメートルの挿入時に内側を下に配置されている。一度配置された、過剰HBSSをインサートから削除され、挿入はその後6ウェル皿のウェル1 35ミリメートルに配置されます。井戸はエクサが含まれていますメディアのctly 2.7ミリリットル：グルタマックスと2％のB-27を補充し、1％G5および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地。井戸からのメディアの数滴は、各外植片の上にピペッティングすることができますが、ウェルあたり2.7ミリリットルのオリジナル過剰にメディアを追加しないでください。 </li><li>外植片はコラーゲンフィルター上に配置されていたら、外植片を含む6ウェルディッシュはビラップスローゼンバーグ（BR）の室（また、水の加湿皿を含む）に置かれます。 95％/ 5％酸素/ CO 2混合ガスは、チャンバを閉じて密封し、95％/ 10％酸素/ CO 2ガス供給管を切断する前に、少なくとも1分間チャンバー内に注入される。 BR室は、その後培養期間の残りの37℃の組織培養インキュベーター、1-2 DIVに配置されます。 </li></ol> 3。組織学的検査のための植組織の固定<ol><li>ドラフト内で予熱した（〜80＆ド100ml中のホルムアルデヒドの最初の可溶化8グラムによってパガーノ固定溶液を調製グラム、C）蒸留H 2 O可溶化を促進し、穏やかに攪拌し、NaOHを集中して1-3滴を追加します。一度500mMのスクロース、100mMのHEPES、pH7.4で、50 mMのMgCl 2、250mMスクロース、50mMのHEPES中4％パラホルムアルデヒドの最終濃度5mMのKClであることは、ソリューションに8％パラホルムアルデヒド溶液を1:1で混ぜて可溶化、25 mMのMgCl 2、2.5mMのKClで、pHは7.4。 </li><li>外植片を37℃にパガーノ修正液を温める修正するには迅速に各ウェルの培養物からDMEM/F12メディアのほとんどを除去し、外植片の各ウェルにパガーノ修正5mlを加える。修正で完全に各外植片をカバーすることを確認してください。室温で1時間を修正しました。前に固定の1時間にフィルターから外植片を外さないでください。 </li><li>固定後パガーノ修正液を除去し、修正せずにパガーノ溶液（250mMスクロース50mMのHepes、25mMのMgCl 2を 、2.5mMのKClを、pH 7.4）で置き換えます。埋め込みまで4℃で10％のアジ化ナトリウムや店舗℃で数滴を追加します。 </li></ol> 4。埋め込みとS組織学のためectioning <ol><li>温水（55℃）100mlにふくらはぎ皮ゼラチン10gを可溶化することにより10％ウシ皮膚ゼラチン溶液を調製します。ホットプレートの上に置いてゼラチン溶液は、可溶化されるまで、定期的に60℃と渦を設定します。 </li><li> 10cmペトリ皿の底に10％のゼラチン溶液約10mlを注ぎ、30分が凝固することができます。これは、外植片を埋め込むための &quot;パッド&quot;を形成します。これらのパッドは、事前に準備された日とし、4℃で保存することができますシャーレの底に格子を描き、グリッドの各ボックスに、個々の外植片を転送するために定規を使用しています。残留パガーノ溶液を除去し、ピペッターを使用して、暖かい10パーセントゼラチン溶液で各外植片をカバーし、固化することができます。各外植片が完全にあまりにも多く、一度に温めるゼラチンを添加することによりパッドを溶融しないように注意しながら、ゼラチンで囲まれるまでゼラチン溶液をゆっくり添加を再開します。 〜1時間硬化さゼラチンを可能にします。一度個々ををかたくなにUAL外植片は、ゼラチンの小さなブロックに切り出すことができる。ブロックは、前ビブラトームとセクショニングに24〜48時間の修正パガーノで後固定されています。 </li><li>ゼラチンブロック内の外植片は嗅球を配置し、厚さ100μmにおける前頭面に区画されています。セクションは、収集され、保管され、PBS中の4で+ 0.1％アジ化ナトリウム°Cの免疫組織化学的処理まで。 </li><li>免疫組織化学的検出、24ウェルプレート（ウェルあたり2から3節）にセクションを転送することによって行われます。 + B（PBS + 0.5％トリトンX 100、2％BSA）を0.5ミリリットルPBSTを追加することにより、結合の最初のブロック、非特異的抗体を各ウェルに、穏やかに振盪しながら1時間インキュベートする。適切な一次抗体は、その後、PBST + Bで希釈し、ウェルあたり0.4mlを室温で一晩のインキュベーションのために追加されます。プライマリは3X PBSは、少なくとも10分間ずつ洗浄して洗い流す。二次抗体、2μg/ mlのヘキスト33342核染色法は、その後、PBST + Bで希釈し、サンプルを室温で2時間インキュベートする。穏やかに振盪しながら。三PBSの洗浄（10分毎に）が実行され、その後のセクションでは、90％グリセロール、50mMトリス、pH7.4の、マウントメディアを使用して、スライド上に搭載されている。 </li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

全体の半球外植片 - - 早期皮質発達の研究（E13-E15）のための我々は実験モデルを改善し、評価した。モデルは、移行および大脳皮質25,37の層6を構成する興奮性ニューロン系統の分化の解析に有用であることが証明されました。システムの主な利点は、準備が単純、脳の発達のこの早期、臨界期中にエレクトロポレーション、薬理学的操作とイメージングのためのニューロン〜3）実?...

連続して生成されたニューロンの協調的な増殖、遊走及び分化を通じて哺乳類大脳皮質を形成する。各ニューロンは脳室帯に生まれた（VZ）と皮質板（CP）の1を形成し 、中間帯（IZ）にVZから移動されています。彼らは異なる皮質領域を通過する際、移行のニューロンが細胞外環境と開発組織内の他の細胞成分（ 例えば放射状グリア）に依存する移行2,3の複数のモードを表示します。皮質ニューロンはその後ニューロン移動の逮捕とdendritogenesis 4の同時プロセスにおける成形皮質板の上部に移行を逮捕。 皮質の発達は、胚の始原日網状層6またはpreplate（PP）、その上に重なるVZパイオニアニューロンの層の設立を通じて、11月13日（E11-13）5との間で開始されます。プロスペクティブその後層6皮質ニューロン（VZで生まれすなわち第一皮質ニューロン）の向きは、そのステレオタイプのパターンで細胞体およびPP 7内の別個の層に合体。これらのイベントは、表面的な限界（将来の皮質第1層）とディープゾーン、サブプレート細胞（一過性皮質の第7層）から成る後者にpreplateを分割します。このプロセスは、preplate分割と呼ばれる、大脳皮質8の将来の成長の基盤となるイベントです。 多くの遺伝的変異は皮質発達9の様々な側面を混乱させることが確認されている。皮質の開発も悪影響コカイン10とアルコール11と摂取毒素への暴露によって影響を受ける可能性があります。開発中に発生する皮質奇形、神経障害（ 例えば自閉症、統合失調症）への貢献者である可能性が高いので、皮質発達に摂動の実証的調査が内在している重要LY。これは、遺伝的または毒素効果の迅速なアッセイを可能にするだけでなく、脳の発達12の初めに、この期間中に差別ニューロン、他のタイプの細胞と細胞外マトリックス（ECM）との間の相互作用の可能性を維持することが皮質の発達を研究するための手法を確立するためにかなりのに重要である。 スライス外植片13は、このようなシステムを提供していると広くアッセイ皮質ニューロンの発達14から16に使用されてきた。しかし、スライスアッセイは、神経細胞の遊走およびラミネーションは、おそらく脳の発達とアンカー放射状グリア足場を囲む髄膜細胞への損傷によって17異常なことができないという欠点に苦しむことができます。放射状グリア繊維はスライスによる基底膜の皮質ニューロンの移行18中断のための重要な基質であるとしてローカルに放射状グリアアーキテクチャを混乱させ、変化した皮質の移行につながる可能性があります。加えてSLI外植片の表面CEDは、これらの分野におけるECMの通常の構図を変化させることができる死んだ細胞の領域を提供します。 より最近のアプローチは適切な健康な細胞型とECMに囲まれているスライスの奥深くにある細胞に自分の分析を当てている。しかし、いくつかのケースでは、これらの新しいアプローチは、元の厚い培養スライスはスライスの比較的正常なインテリアが分析19から21のために利用可能になるように固定後、凍結切片またはパラフィン包埋切片であることを必要とすることができます。文化だけでなく、分析のために固定されたスライスのその後の凍結セクショニングのライブスライスを準備するセクショニングオリジナルビブラトーム両方がこれらのアッセイのためのケアと労力が動作する必要があります。 初期の皮質の発達についての研究のためのシンプルな、補完的なアプローチを提供するために、我々は初期の皮質の発達についての研究を促進する13既存のスライスのアプローチを変更しました。我々は、WHを開発した65分当たりの回転数と16〜18時間22,23に対して許可される器官の成長で振とう培養を関与して既存のE14全半球モデルに似たOLE半球植モデル。我々のアプローチでは、全体の半球の外植片を48時間器官皮質の成長を延長するために、高酸素培養雰囲気21,24内で半透膜13の上に配置されます。また、このアプローチは、皮質ニューロンの開発の一貫したエレクトロポレーションを可能にします。胚が子宮から取り出され、プラスミドDNAを導入するエレクトロポレーションとは、その後、終脳解剖されています。各半球を単離し、コラーゲンコートフィルタで内側を下に配置されます。外植片は、その後、48時間、preplate分割8を含む期間の期間培養する。培養期間中、L6のニューロンは皮質板内に正しく配置区別ニューロン25に前駆体から開発しています。この期間を通じて開発神経細胞は、 生体内の対応するセルに立ち向かうであろう適切なECMと細胞型に囲まれています。このシステムはすでにエタノール毒性26、層6の形成とpreplate分割7,25の根底にある携帯電話のイベントを解読に貴重であると判明しました。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

皮質の発達は、前駆細胞、血管、髄膜および関連する細胞外マトリックスを含む神経細胞と非神経要素間の複雑な相互作用を伴います。彼らは適切な器官の環境を提供するため、皮質スライス外植片は、多くの場合、ニューロンの分化·発達を制御し、それらの相互作用を調べるために使用されます。有益なものの、スライス植モデルは異常な細胞積層および移行などの欠点に苦しむことができます。ここでは、皮質切片より準備が簡単で、一貫性のある器官の移行およびラミネーションを示す初期の皮質の発達についての研究のために全体の大脳半球の植​​システムについて報告する。このモデルシステムでは、初期のラミネーションと移行パターンは、preplate分割の期間を含め、in vitroでの 2日間にわたって、通常の前向き皮質層の間に6フォームを進みます。次に、 元の子宮内エレクトロポレーション（EUEP）を開発背内側皮質に開発ニューロンにGFPの発現を標的に〜80％の成功を実現したアプローチ。 全体の半球植モデルはエレクトロポレーション、薬理学的介入とライブイメージングアプローチのための初期の皮質発達にアクセスできるようになります。トランスフェクションおよび面積ターゲティング一貫性の両方を向上させながら、この方法では、 子宮内エレクトロポレーション（IUEP）アプローチで求められる生存の手術を回避することができます。この方法では、神経細胞の増殖、遊走および分化の実験的研究を促進するであろう。

げっ歯類の胚性皮質が発達期間を通して横neurogenetic勾配を示し、そのようなその横新皮質は、背内側皮質28よりも約1日より成熟している。 6層のニューロンの大部分はこのように横皮質でE12に（また、フィールド40 5と呼ばれる）とE13で背内側野（またフィールド1〜5と呼ばれる）で（S期の最終的なを示すIE）が生成されます。 Preplate分割は6層ニューロンの生成?...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

このプロトコルは含ま改良植手順を説明<em&gt; EX子宮</em&gt;マウス胎児から全体の大脳半球のエレクトロポレーション、解剖や文化。準備が早い皮質開発中に遺伝子機能の薬理試験およびアッセイを容易にします。

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K ビュー.  SUNY Upstate Medical University. このプロトコルは含ま改良植手順を説明 EX子宮マウス胎児から全体の大脳半球のエレクトロポレーション、解剖や文化。準備が早い皮質開発中に遺伝子機能の薬理試験およびアッセイを容易にします。