Bu eser NINDS (NS066071) ve NIAAA hibe desteklenmiştir. (P50AA017823) ECO. Yazarlar, Dr Robert Quinn ve hayvan bakımı Laboratuar Hayvan Kaynakları Bölümü personel teşekkür. Biz Yaz Lisans Araştırma Görevlisi (SURF) gibi yardım için, teknik destek için Nicole Belletier Judson Belmont ederim. Biz de yorum yapmak için Dr David Cameron teşekkür yazının önceki bir sürümünde düzenler.

Plazmid Yeşil Floresan Protein Ekspresyonu ile 1. Ex utero Electroporations <ol><li> Plazmid DNA enjeksiyon çözeltileri GKD 2 O. içinde 0.33 mg / ml &#39;lik nihai konsantrasyona seyreltildi çalışma CAG-eGFP DNA 27 ile hazırlanır Qiagen Endo-Free Maxi-Preps dönüştürülmüş bakteriler plazmid arındırmak için kullanılır. ~% 0.02 (w / v nihai) çabuk bir yeşil boya enjeksiyon İzleyici olarak DNA çözeltisine ilave edilir. </li><li> Cerrahi alan hazırlamak için,% 70 etanol çözeltisi ile tezgah üstü ve diseksiyon mikroskop sahne yıkadığınız ve kurulayın. Öncesinde diseksiyonu% 70 etanol ile cerrahi makas ve forseps püskürtün ve kurulayın. </li><li> Tüm hareket en az 1 dakika süreyle durdu kadar Timed Hamile İsviçre / Webster barajlar basınçlı silindirden CO 2 ile doldurulur ve baraj izlenen bir odasına transferi ile E13 üzerinde kurban edilir. CO 2 solunum yoluyla kurban sonra embriyolar rahim kaldırılır ve yerleştirilir10 cm&#39;lik Petri kabı içeren buz gibi soğuk Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS). </li><li> Dikkatle çevredeki extraembryonic membranların her embriyo incelemek ve buz HBSS tutmak. </li><li> Soğuk HBSS içeren ikinci bir 10 cm Petri kabı ayrı ayrı her bir embriyo transfer. Gelecek analizi için kortikal alandan mekansal ayrı bir kortikal alanda enjekte bakımı, sol serebral hemisfer ventrikül içine DNA Hızlı yeşil karışımı 2-3 ul enjekte etmek için bir Hamilton şırınga kullanın. </li><li> Elektroporasyonu için forseps ile yavaşça embriyo tutun ve hafifçe başının dorsal orta hat üzerindeki cımbız elektrodun pozitif raket yerleştirin ve hafifçe embriyo çene altındaki negatif kürek yerleştirin. Electroporations 950 msn aralıklarla ayrılmış 50 msn süresince beş 30 V bakliyat, teslim etmek için programlanmış bir BTX830 Elektroporatör ile elde edilir. Bu ayarlar BTX830 model oluşturuyor. Diğer sistemler, üreticinin TALİMATLAR göre kullanılabilecekns. </li></ol> 2. Tüm Yarımküre Eksplantasyon Hazırlama <ol><li> Elektroporasyonun ardından embriyoların buz-soğuk HBSS içinde tekrar yerleştirilir. Beyin embriyo baş cilt ve kıkırdak kafatası kaldırmak için iki # 5 kuyumcu forseps kullanılarak kaldırılır. Bir forsepsle sonra kafatası bozulmamış beyinde çıkarmak için beyin altında kaydırılır. Electroporated yarımkürede (sol) ve sonra beyin uzak disseke edilir ve ekli orta beyin doku çıkarılır. Diseksiyon prosedürü dikkatle boyunca sol kortikal yarımkürede örten zarları tahrip etmeyecek alınır. </li><li> Sonra her bir embriyo bir kesim 1 ml pipet ile bir pipet kullanarak HBSS aktarılır disseke. Yarımkürede hafifçe kollajen kaplı kültürü insert üzerine atılır. Altı adede yarımkürede eksplantlar her 24 mm uç üzerindeki medial tarafı aşağı düzenlenmiştir. Bir kez düzenlenmiş fazla HBSS elemanı kaldırılır ve insert daha sonra da bir 6 da çanak biri 35 mm içine yerleştirilir. Iyi EXA içerirOrtamın ctly 2.7 ml DMEM-F12 ortamı Glutamax içeren ve% 2 B-27,% 1 G5 ve% 1 Penisilin-Strep desteklenmiştir. Kuyudan bir ortam birkaç damla her eksplant üstüne pipetle edilebilir, ancak çukur başına 2.7 mL orijinal fazla medya ekleme. </li><li> Eksplantlar Kollajen filtreler üzerine konulduktan sonra eksplantlar içeren 6 sıra çanak Billups Rothenberg (BR) odası (aynı zamanda bir su nemlendirme tabak içeren) içine yerleştirilir. A% 95 /% 5 Oksijen / CO 2 gaz karışımı odasının kapalı mühürleme ve% 95 /% 5 Oksijen / CO 2 gaz tüpü çıkarmadan önce en az 1 dakika süreyle odasına demlenir. BR oda sonra kültür periyodu, 1-2 DIV geri kalanı için bir 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içine yerleştirilir. </li></ol> 3. Histoloji için Eksplantasyon Doku fiksasyonu <ol><li> Bir davlumbaz olarak ısıtılmış (~ 80 ve de 100 ml paraformaldehid ilk çözücü 8 g tarafından Pagano tesbit çözeltisi hazırlamakg, C) GKD 2 O. NaOH çözünürleştirme teşvik ve hafifçe karıştırın konsantre 1-3 damla ekleyin. Bir kez 500 mM sakaroz, 100 mM Hepes, pH 7.4, 50 mM MgCl2, 250 mM sakaroz, 50 mM Hepes içinde% 4 paraformaldehid bir nihai konsantrasyon için 5 mM KCl, olduğu bir çözelti ile% 8 paraformaldehid çözelti 1:1 Karışım çözündürülmüş , 25 mM MgCl2, 2.5 mM KCI, pH 7.4. </li><li> Eksplantlar 37 ° C&#39;ye Pagano düzeltme çözüm ısıtmak düzeltmek için Hızla de her kültürden DMEM/F12 medyanın en çıkarmak ve eksplant her kuyucuğa Pagano Fix 5 ml ekleyin. Düzeltme tamamen her eksplant kapsayacak emin olun. Oda sıcaklığında 1 saat için düzeltildi. Önceki fiksasyon 1 hr filtresinden eksplantlar çıkarmayın. </li><li> Tespit Pagano düzeltme çözüm kaldırmak ve sabit olmayan Pagano çözeltisi (250 mM sukroz, 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 2.5 mM KCI, pH 7.4) ile değiştirin sonra. Gömme kadar 4 azından% 10 sodyum azid ve mağaza ° C&#39;de bir kaç damla ekleyin. </li></ol> 4. Gömme ve SHistoloji için ectioning <ol><li> Ilık su (55-60 ° C), 100 ml buzağı cilt jelatin 10 g çözücü ile bir% 10 buzağı cilt jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözündüğünü kadar ° C ve girdap aralıklarla 60 için ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde jelatin solüsyonu yerleştirin. </li><li> 10 cm&#39;lik Petri kabı içine alt% 10 jelatin solüsyonu, yaklaşık 10 ml dökülür ve 30 dakika katılaşmaya izin. Bu eksplantlar gömmek için bir &quot;pad&quot; oluşturacak. Bu pedler önceden hazırlanmış gün olması ve 4 ° C&#39;de depolanabilir Petri kabı alt kısmında bir ızgara çizmek ve ızgara her kutuya tek eksplantlar aktarmak için bir cetvel kullanın. Rezidüel Pagano çözüm çıkarın ve bir pipet kullanarak, sıcak% 10 jelatin çözeltisi ile her eksplant kapak ve katılaşmaya izin. Her eksplant tamamen çok fazla kerede jelatin sıcak ilave edilmesi ile ped erime vermemeye dikkat ederek, jelatin ile çevrelenmiştir kadar jelatin çözeltisinin yavaş ilavesi devam edin. ~ 1 saat için sertleşmesine jelatin için izin ver. Bir kez münferit sertleştirilmişKitabında eksplantları jelatin küçük bloklar halinde kesip olabilir. Bloklar daha sonra önce bir vibratome ile kesit 24-48 saat süreyle düzeltmek Pagano yayınladığınız-sabittir. </li><li> Jelatin blok Eksplantlarından koku ampul kadar konumlandırılmış ve 100 mikron kalınlığında koronal düzlemde kesitler vardır. Bölümleri toplanan ve saklanan PBS içinde 4 az +% 0,1 sodyum azid ° C immunohistokimyasal işleme kadar. </li><li> Immünohistokimyasal algılama bir 24 gözlü bir levha (kuyu başına 2-3 bölümleri) bölümleri içine aktarılması ile gerçekleştirilir. İlk blok non-spesifik antikor 0.5 ml PBST ekleyerek bağlayıcı + B nazik sallayarak her şey, inkübe 1 hr (PBS +% 0.5 Triton X 100 ve% 2 BSA). Uygun birincil antikor daha sonra PBST + B ile seyreltilir ve çukur başına 0.4 ml RT&#39;de bir gece kuluçka için ilave edilir. Birincil 3X PBS en azından 10 dakika için her bir yıkama ile yıkanmıştır. İkincil antikor ve 2 ug / ml Hoechst 33342 leke nükleer sonra PBST + B ile seyreltilir ve numuneler oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedirnazik sallayarak ile. PBS üç yıkama (her biri 10 dakika) yapılmakta ve daha sonra bölümleri ile% 90 gliserol, 50 mM Tris pH7.4, montaj ortamı kullanarak kaydıraklar üzerinde monte edilmiştir. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz gelişmiş ve deneysel modelini değerlendirdi - Bütün yarımkürede eksplantlar - erken kortikal gelişim çalışması için (E13-E15). Modeli serebral korteks 25,37 tabaka 6 teşkil eksitatör nöron soy göç ve farklılaşma analizi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sistemin prensibi avantajları hazırlık sadeliği ve beyin gelişiminin bu erken, kritik döneminde elektroporasyon, Farmakolojik manipulasyon ve görüntüleme için nöronlara 3) deneysel erişim)) 2 DIV organotipik büyüm...

Gittikçe üretilen nöronların uyumlu proliferasyon, göç ve farklılaştırılması yoluyla memeli serebral korteks formları. Her bir nöron ventriküler zonunda (VZ) doğdu ve kortikal plaka (CP) 1 oluşturan, ara bölge (IZ) içine VZ göç ediyor. Edilir Onlar farklı kortikal alanları geçerken, göç nöronlar gelişmekte doku içindeki ekstraselüler çevre ve diğer hücresel elementler (örneğin radyal glia) bağlıdır göç 2,3 çoklu ekran modları. Kortikal nöronlarda sonra nöronal göç yakalanması ve dendritogenesis 4 çakışık süreçlerinde şekillendirme kortikal plaka üstünde göç tutukla. Kortikal gelişme embriyonik gün ilkel pleksiform tabakada 6 veya preplate (PP), o örter VZ öncü nöron tabakası kurulması yoluyla 11-13 (E11-13) 5 ile başlatılır. MuhtemelSonra katman 6 kortikal nöronların (VZ doğumlu yani ilk kortikal nöronlar) şark onların basmakalıp bir desen somata ve PP 7 içinde ayrı bir tabaka halinde birleşme. Bu olaylar bir yüzeysel marjinal (gelecek kortikal tabaka 1) ve derin bölge subplate hücreleri (geçici kortikal tabaka 7) oluşan ikinci içine preplate bölünmüş. Bu süreç, preplate yarma adlandırılan, serebral korteks 8 gelecekteki büyüme temel bir olaydır. Pek çok genetik mutasyonlar kortikal geliştirme 9 çeşitli yönlerini bozan olduğu tespit edilmiştir. Kortikal gelişimi de olumsuz gibi kokain 10 ve alkol 11 olarak yutulur toksinler tarafından etkiledi olabilir. Gelişimi sırasında ortaya çıkan kortikal malformasyonlar nörolojik bozukluklar (örneğin otizm, şizofreni) muhtemelen katkıda olduğundan, kortikal gelişim için pertürbasyonların ampirik araştırmalar doğasında vardırönemli ly. Genetik ya da toksin etkilerinin hızlı testler izin değil, aynı zamanda beyin gelişimi 12 bu erken dönemde ayırt nöronlar, diğer hücre türleri ve ekstrasellüler matriks (ECM) arasındaki olası etkileşimler koruyan kortikal gelişim eğitim yaklaşımları kurmaya büyük önem taşımaktadır . Dilim eksplantları 13 böyle bir sistemi temin olan ve yaygın olarak tahlil kortikal Nöron gelişme 14-16 için kullanılmıştır. Ancak, dilim deneyleri nöronal migrasyon ve laminasyon muhtemelen gelişmekte olan beyin ve çapa radyal glial iskele çevreleyen meningeal hücreler hasar nedeniyle 17 anormal olabilir dezavantajı muzdarip olabilir. Radyal glial lifler dilimleme bazal lamina kortikal nöron göçü 18 kesinti için önemli bir substrat olarak yerel radyal glial mimarisi bozabilir ve altere kortikal göç yol açabilir. Buna ek olarak slieksplant ced yüzeyleri bu alanlarda ECM normal kompozisyonu değiştirebilir ölü hücrelerin bir bölge sağlar. Daha yeni yaklaşımlar uygun sağlıklı hücre tipleri ve ECM çevrili dilim derin yerleşimli hücrelerin üzerinde kendilerine analizi odaklanmıştır. Ancak, bazı durumlarda bu yeni yaklaşımların dilim nispeten normal iç analizi 19-21 için uygun hale getirilir, böylece orijinal kalın kültürlü dilim fiksasyon sonra kriyo-kesitli veya parafin-kesitli olmasını gerektirebilir. Kültür gibi analiz için sabit dilimlerin sonraki cryosectioning için canlı dilimleri hazırlamak için kesit orijinal vibratome Her ikisi de bu deneyler için çaba ve dikkat çalışma gerektirir. Erken kortikal gelişim çalışmaları için basit, tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz erken kortikal gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için varolan bir dilim yaklaşımlar 13 değiştirdiniz. Biz bir wh geliştirdik65 dakikadaki dönüş ve 16-18 saat 22,23 için izin organotipik büyümeyi sallayarak kültürleri dahil varolan E14 bütün yarımkürede modeline benzer ole yarımkürede eksplant modeli. Bizim yaklaşım, bütün yarımkürede eksplantlar 48 saat süreyle organotipik kortikal büyüme genişletmek için yüksek oksijen kültür atmosferi 21,24 içinde yarı geçirgen bir zar 13 yerleştirilir. Bu yaklaşım, aynı zamanda kortikal nöronlarda geliştirilmesi tutarlı elektroporasyon için olanak sağlar. Embriyolar rahim kaldırılır ve plazmid DNA tanıtmak electroporated ve telencephalon sonra disseke edilir edilir. Her hemisfer izole ve kollajen kaplı filtre üzerinde medial yüzü aşağı yerleştirilir. Eksplant sonra 48 saat, preplate yarma 8 kapsayan bir dönem bir süre için yetiştirilir. Kültür döneminde, L6 nöronlar kortikal plağındaki doğru konumlandırılmış farklılaşmış nöron 25 habercisidir gelişir. Bu dönemde gelişmekte boyuncanöron in vivo olarak buna karşılık gelen hücre karşısına uygun ECM ve hücre türleri tarafından çevrelenmiştir. Bu sistem zaten etanol toksisitesi 26 kat 6 oluşumu ve preplate bölme 7,25 altında yatan hücresel olayları çözmekte değerli kanıtlamıştır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Kortikal gelişme nöronlar ve öncü hücreleri, kan damarları, zarları ve ilişkili ekstrasellüler matriks içeren nöronal olmayan elemanlar arasındaki karmaşık etkileşimleri içerir. Onlar uygun bir organotipik ortamı sağlamak için, kortikal dilim eksplantlar genellikle nöronal farklılaşma ve gelişimini kontrol bu etkileşimlerin araştırılması için kullanılır. Yararlı olsa da, dilim eksplant modeli aberan hücresel laminasyon ve göç gibi sakıncaları muzdarip olabilir. Burada kortikal dilimleri ve gösterileri tutarlı organotipik göç ve laminasyon daha hazırlamak kolaydır erken kortikal gelişim çalışmaları için bir bütün serebral hemisfer eksplant sistemi rapor. Bu model sistem, erken laminasyon ve göç yollarını, preplate bölme dönemi de dahil olmak üzere, in vitro iki günlük bir süre için normal prospektif kortikal tabaka boyunca altı formları devam edin. Biz o eski utero elektroporasyon (EUEP) geliştirdidorsal medial korteks gelişen nöronlar GFP hedefleme ~% 80 başarı elde yaklaşım. Bütün yarımkürede eksplant modeli elektroporasyon, farmakolojik müdahale ve canlı görüntüleme yaklaşımları için erişilebilir erken kortikal gelişim yapar. Bu yöntem transfeksiyon ve alansal hedefleme tutarlılığı hem artırırken utero elektroporasyon (IUEP) yaklaşımlar gerekli sağkalım cerrahi önler. Bu yöntem nöronal proliferasyon, göç ve farklılaşma deneysel çalışmalar kolaylaştıracaktır.

Embriyonik kemirgen korteks gelişim dönemi boyunca bir enine nörogenetik degrade sergiler, öyle ki yanal neokorteks dorsal medial neokorteks 28 yaklaşık 1 gün daha olgun olduğunu. Katman 6 nöronların toplu böylece lateral korteks bölgesindeki E12 üzerinde (ayrıca Saha 40 5 denir) ve E13 de dorsal medial korteks (ayrıca Tarla 1 5 denir) (S-fazı nihai sergilemek gibi) oluşturulur. Preplate yarma Katman 6 nöron üretimi yaklaşık 1 gün sonra başlar ve böylece ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam açıklanır<em&gt; Ex utero</em&gt; Embriyonik fare genelinde hemisferlerin elektroporasyon, diseksiyon ve kültür. Hazırlanması erken kortikal gelişim sırasında gen fonksiyonu farmakolojik çalışmalar ve testler kolaylaştırır.

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K Görüntüleme.  SUNY Upstate Medical University. Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam açıklanır Ex utero Embriyonik fare genelinde hemisferlerin elektroporasyon, diseksiyon ve kültür. Hazırlanması erken kortikal gelişim sırasında gen fonksiyonu farmakolojik çalışmalar ve testler kolaylaştırır.