This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. إعداد لتشكيل الجيني أقراص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4٪ (ث / ت) حل الجينات في الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم وأضاف أو كلوريد المغنيسيوم وقعت في 37 ° C حمام الماء. تركيزات الحل الجينات يمكن أن تختلف، ولكن 1-4٪ (ث / ت) ينصح حلول الجينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل الجينات في نسبة 1: 1 مع قاعدة الوسائط زراعة الخلايا الحارة (على سبيل المثال، Dulbecco لتعديل النسر متوسطة.) لنوع من الخلايا المطلوبة. تركيز الجينات هو الآن نصف تركيز الأصلي، أي، 2٪ (ث / ت). تعقيم الجينات / حل الوسائط باستخدام معقم 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة النايلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حمام من معقمة 102 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم في الماء المعقم مع حل ما يكفي لغمر قوالب (~ 200-300 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العقيمة &quot;قالب تشكيل هلام&quot; (6 مم × 3 مم طويل القامة آبار اسطوانية 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم، انظر <strong&gt; الشكل 1) والصفائح الطرفية (القاع: واحد 3 × 3 في في لوحة الألومنيوم، الأعلى: واحد 1.5 بوصة × 3 في لوحة الألومنيوم) وإعداد قوالب على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ورقة سميكة فلتر (مرشح ورقة نشافة) وغشاء الخلية microsieve (10 ميكرون حجم المسام) لأحجام أعلى وأسفل الصفائح الطرفية ووضعها في الحمام كلوريد الكالسيوم حتى المشبعة، حوالي 1 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، وتعقيم ورقة الترشيح سميكة والغشاء microsieve عبر الأوتوكلاف أو الأشعة فوق البنفسجية ضوء لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء نصف (النصف السفلي) من العفن بناء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم باستخدام ملعقة العقيمة: endplate كبيرة (3 × 3 في في)، ورق الترشيح سميكة، ثم الغشاء microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس واضغط على العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع &quot;هلام تشكيل العفن&quot; مع آبار اسطوانية على أعلى جالذراع غشاء microsieve وبلطف ربط القالب معا على الجانبين باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. تأكد من ترك مساحة كافية لendplate أعلى (1.5 بوصة × 3 في) لتغطية الآبار في وقت لاحق تماما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء النصف الثاني (النصف العلوي) من العفن بناء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم: endplate صغيرة، ورق الترشيح سميكة، وغشاء microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس والضغط على هذا النصف من العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد. لا أربط هذا الشوط من العفن باستخدام مقاطع الموثق في هذا الوقت. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا كما أوصى في تعليمات الشركة الصانعة. حصاد الخلايا المطلوبة لتضمينها في الهلاميات المائية الجينات الطبقات. كثافة الخلية الموصى بها هي 1-2 × 10 6 خلية / مل، ولكن هذا يمكن أن تختلف اعتمادا على التجارب المطلوبة. ملاحظة: عند استخدام هذا الأسلوبلجعل الطبقات مع أنواع مختلفة من الخلايا، للتأكد من أنواع الخلايا ثقافة اثنين بشكل متواز لطبقات. الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) المصنفة في مناطق ذات كثافة خلية من 1 × 10 6 خلية / مل سوف تستخدم كمثال لبروتوكول التالي. عدد الخلايا وعدد القرص يمكن زيادتها لتجارب حسب الحاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسبوع إلى أسبوعين قبل التضمين، الخلايا الجذعية الوسيطة البذور في مناطق ذات كثافة خلية من 3000 - 5000 خلية / سم 2 في 10 مل من وسائط النمو القاعدية (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، و 10٪ مصل بقري جنيني، 2٪ L-الجلوتامين، 1 ٪ غير الاساسيين الأحماض الأمينية، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) في T-75 قوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام وقضي كل 2-3 أيام واستبدالها مع 10 مل من وسائط النمو القاعدية حتى الخلايا هي 80-90٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا، وإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وماصة 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم المضافة أو كلوريد المغنيسيوم لشطف الخلايا. إزالة هذا الحل، ماصة 3 مل من 0.25٪ في محاولةpsin-EDTA على نمو الخلايا في T-75 قوارير، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد خلايا رفعت من على سطح الأرض ملتصقة، إضافة 6-9 مل من وسائط النمو القاعدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجان الدائمة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، نضح طاف، وإعادة تعليق في 1-5 مل من وسائط النمو القاعدية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات باستخدام تعليمات الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1 × 10 6 خلايا من إجمالي إعادة تعليق الخلية، وأجهزة الطرد المركزي التي تستخدم نفس الظروف، ونضح طاف. </li></ol></li></ol> 2. تشكيل خلية المصنفة الجيني أقراص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه خلية مع 1 مل من محلول الجينات / وسائل الإعلام العقيمة لتحقيق كثافة الخلية من 1 × 10 6 خلية / مل. سوف الخليط الخلية الجينات يكون غائما متجانس في المظهر عندما خلايا ممزوجة بشكل مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 130 ميكرولتر من خليط الخلية الجينات إلى ستة 6 مم × 3 مم الآبار طويل القامة في النصف السفلي من العفنبناء قطرة قطرة، حتى لا تخلق أي فقاعات. وينبغي أن يكون الغضروف المفصلي محدب طفيف مرئية فوق حافة كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنعيم بعناية النصف العلوي من العفن بناء باستخدام ملعقة معقمة وتحويل أكثر من ذلك، حتى أن غشاء الخلية microsieve على رأس الآبار. مكان القالب بناء على أعلى من الآبار، مع التأكد من تغطية الآبار التي تحتوي على خلية وخليط الجينات تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع القالب بناء تحميلها، وأثناء الضغط لأسفل بشدة على المركز، الموثق كليب الجانبين المتبقية (العلوي والسفلي) لربط شطري العلوية والسفلية من القالب بناء. الحلول الخلية الجينات يجب أن تقع بشكل آمن في الآبار في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج بناء العفن تثبيتها في الحمام كلوريد الكالسيوم 102 ملم، والتأكد من أن بناء كامل مغمورة. احتضان في الخلية هود الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية ال 90 دقيقة، وإزالة بناء قالب من كلوريد الكالسيوم 102 مليحمام ومكان على كومة من المناشف الورقية في الخلية هود الثقافة. إزالة جميع مقاطع الموثق أربعة وفصل نصفي القالب بناء. الهلاميات المائية التي تشكلت في الآبار لا ينبغي أن يكون أي فقاعات، وينبغي ملء الآبار تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، وتتبع بعناية حافة الآبار التي تحتوي على الهلاميات المائية لتخفيف بعناية ووتد من الهلاميات المائية. بعد إزالة الهلاميات المائية من العفن بناء، وإسقاط الهلاميات المائية مباشرة إلى حمام من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم. تغطية المواد الهلامية تماما ليغسل محلول كلوريد الكالسيوم الزائد عن 1-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الهلاميات المائية إلى حل القاعدية وسائط النمو في طبق المطلوب (على سبيل المثال، 6 لوحات أيضا) التي تغطي تماما الهلاميات المائية. احتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة في الحاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل المتابعة إلى الخطوة طبقات. ملاحظة: الهلاميات المائية التي تحتوي على خلايا يمكن أن تبقى فيهو المطلوب حاضنة الثقافة الخلية إلى أجل غير مسمى في هذا الوقت حتى طبقات من المواد الهلامية مع السكان خلية أخرى، شريطة أن يتم الانتهاء من التغييرات وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. </li></ol> 3. طبقات من الجينات أقراص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال النصف ساعة الأخيرة من حضانة 1 ساعة، جمع وإعداد قوالب معقمة وحل لوالصلب والمواد الهلامية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد &quot;العفن قطع&quot; بواسطة الربط قالب التي لديها آبار نصف ذروة &quot;هلام تشكيل العفن&quot; (6 مم × 1.5 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد &quot;القالب الصلب&quot; بواسطة الربط قالب الذي هو 3 مم أكبر في القطر من &quot;تشكيل العفن هلام&quot; (مم 9 × 3 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (الصوديوم سترات ثنائي الهيدرات، ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) في الماء المعقم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المواد الهلامية من السكان الخلية المطلوبة (في هذا المثال، اثنين من الأقراص مع hMSCs) من وسائل الإعلام في الطبق، وتضع في الآبار &quot;قطع قالب&quot;. كل هلام ينبغي أن تناسب بشكل مريح في الآبار مع نصف من هلام جاحظ فوق القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط، شريحة الجل على طول سطح القالب (وهذا سوف يقلل هيدروجيل في نصف). الوجه النصف العلوي من هلام ووضعه في العفن جيدا مفتوحة. يجب النصف من هلام أيضا تناسب بشكل مريح في القالب بشكل جيد، ولكن الآن كل من المواد الهلامية نصف ينبغي أن يكون ارتفاع القالب مع السطح الداخلي قطع مرئية. كرر مع هلام الثاني. ملاحظة: تحذير: سوف فقط قطع الأسطح الداخلية تشكل أقراص الطبقات. وذلك باستخدام الأسطح الخارجية يؤدي إلى فصل نصفين. ويشتبه في أن نسيج من الغشاء microsieve نقلها على سطح هلام منعالصورة نجاح عملية الصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة من جفاف الغشاء الخلوي microsieve على الجزء العلوي من الآبار، والتأكد من أن غشاء microsieve على اتصال مع كل من نصفي هلام إلى أن صلب وتغطيتها تماما. ضع ورق الترشيح سميكة على رأس الغشاء microsieve، مع التأكد من تغطية المواد الهلامية تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة حل من 100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (ثنائي الهيدرات سيترات الصوديوم، Ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) على ورقة الترشيح سميكة حتى يتشبع بها. ما يقرب من 750 ميكرولتر كافية لأربعة آبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المواد الهلامية لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وإزالة غشاء الخلية microsieve وورق الترشيح سميكة والتخلص منها. إزالة لقطات الموثق وفتح القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل جيل صلب، ونقل احد سيترات الصوديوم / المعالجة EDTA نصف هيدروجيل إلى استعداد &quot;القالب الصلب&quot; مع سطح قطع متجهة لأعلى. وسيكون هذا نصف CONST صلبruct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، ورفع ووضع سيترات الصوديوم الثاني / المعالجة EDTA نصف هلام (قد تحتوي على نوع من الخلايا المختلفة) على هلام بالفعل في &quot;القالب الصلب&quot;، التقليب هذا الشوط الثاني جل بحيث سطح الخفض هو في الاتصال مع سطح قطع من هلام بالفعل في &quot;القالب الصلب&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط بلطف إلى أسفل على المواد الهلامية اثنين باستخدام ملعقة لإزالة أي فقاعات بين لالهلام اثنين. أيضا، إعادة المواد الهلامية حسب الحاجة للتأكد من أن أنها مباشرة على رأس واحد آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بلطف &quot;القالب الصلب&quot; ويغرق في حمام كلوريد الكالسيوم 102 ملي لمدة 30 دقيقة. لا تغطي الآبار مع endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 30min في، إزالة &quot;القالب الصلب&quot; ووضعه على مناشف ورقية. إزالة لقطات الموثق وفصل القالب من endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، وجمع المواد الهلامية صلب ووضعها في الفوسفات مخزنة المالحة و1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم ومحمام كلوريد agnesium لغسل المواد الهلامية. وفي وقت لاحق، ونقل الهلاميات المائية صلب وسائل الإعلام ثقافة الخلية في طبق المطلوب (على سبيل المثال، لوحة 6 جيدا) للثقافة. </li></ol>

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتشكيل الطبقات أقراص هيدروجيل الجينات لدراسة شارك في ثقافات السكان الخلية متعددة، مثل تلك الموجودة في الأنسجة الطبقات من الناحية الفسيولوجية، على سبيل المثال، والغضروف. هياكل الطبقات، مثل منصة الثقافة وصفها، ويمكن استخدامها لدراسة التف?...

الضغط الحاملة الأنسجة مثل الغضاريف المفصلية أو الأقراص الفقرية تتكون من مناطق الأنسجة غير المتجانسة التي تعتبر بالغة الأهمية لكلا ظيفة النشاط الحيوي ومناسبة والميكانيكية تنبيغ في الأنسجة. ليس فقط هو تنظيم الخلوية وظيفة متميزة في مختلف المناطق، ولكن تباينت مصفوفات خارج الخلية (ECM) أيضا في تكوين وتنظيم. على سبيل المثال، والغضروف المفصلي يتكون من ثلاث مناطق رئيسية مع اختلاف شكل الخلية، وظيفة الميكانيكية، وECM. الاختلافات في المبادرة ECM لالتفاضلية المسؤوليات الحاملة. وتشارك الطبقة السطحية في المقام الأول ردا الشد لتحميل، في حين أن المناطق الوسطى وعميقة مسؤولة أساسا للاستجابة لضغط 1. وبالمثل، في القرص الفقري، وحاصرت النواة اللبية هلامية من التليف رقائقي بالطوق والخلايا داخل هذه المناطق متميزة اثنين من تجربة أنواع مختلفة من المحفزات الطبيعية الحيوية2. في هذا النوع من الأنسجة والخلايا ومصفوفات خارج الخلية داخل طبقات الأنسجة تتفاعل مع بعضها البعض كما يخضع الأنسجة وتستجيب لقوى ميكانيكية. تبقى خلاصة من هذه الهياكل الأنسجة غير المتجانسة تحديا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، وفهمنا من الأهمية البيولوجية محدودة. هناك حاجة لزراعة منصات لتحليل الأنسجة الطبقية وكذلك شارك في ثقافات مجموعات مختلفة من الخلايا في بناء واحد. في هندسة الأنسجة الغضروف المفصلي، تم تشييد بنيات-سقالة أقل الطبقات عن طريق تسخير قدرة غضروفية مناطقية لإيداع ECM متنوعة لتقليد طبقات مختلفة من هذا النسيج 3،4. ومع ذلك، توفر بنيات هيدروجيل الطبقات فرصة لتحقيق تفاعل الأنواع المختلفة للسكان الخلية التي تفتقر إلى القدرة على تكوين الأنسجة قوية بشكل مستقل. على سبيل المثال، والبوب ​​مختلفةulations الخلايا الجذعية الوسيطة يمكن أن يشترك في تربيتها داخل بنيات الطبقات. وقد استخدمت هذه السقالات الطبقات مع كل غضروفية والتفريق الخلايا الجذعية الوسيطة لتحسين هندسة الأنسجة 5. لا يمكن إلا أن يكون شارك في تربيتها السكان مختلفة من الخلايا في طبقات هيدروجيل مماثلة، ولكن يمكن أيضا نوع وحيد الخلية يمكن تربيتها داخل الطبقات التي تم التلاعب بها لديك متفاوتة الصلابة أو المحتوى الكيميائي لانتزاع استجابات مختلفة من الخلايا 6،7. وقد استخدمت العديد من الهلاميات المائية بيولوجية مختلفة لطبقة السكان الخلية لهندسة الأنسجة الغضروف مثل تلك التي تستخدم البولي ايثيلين جلايكول أو بولي فينيل الكحول قواعد 7-9. ومع ذلك، الهلاميات المائية الجينات هي واحدة من أبسط المواد الحيوية من خلالها إنشاء السقالات الطبقات لدراسة السكان الخلية غير متجانسة في الثقافة المشتركة. في حين شكلت أيضا الهلاميات المائية الاغاروز بسهولة، الهلاميات المائية الجينات لها فائدة إضافية تتمثل في السماح السهل هوolation من الخلايا من بناء 3-D لتحليل الخلايا الفردية كما وصفت سابقا 10. في دراسات سابقة، وقد تم تشكيل الهلاميات المائية الجينات ثنائية الطبقات في صفائح رقيقة ومن هذه الأوراق، وشرائح أقسام (على سبيل المثال، باستخدام لكمة خزعة) لتطبيقات معينة مثل لتحليل المحتوى الكيميائي أو خصائص القص بينية 11،12. وقد وصفت طريقة أخرى لتشكيل صفائح الجينات رقيقة مع إمكانية التقسيم إلى طبقات متعددة، ولكن لا يزال يتطلب تغيير في هيدروجيل لاستخدامها في اختبار الميكانيكية 13. هنا، فإننا نقدم وسيلة لخلق بتكاثر أقراص هيدروجيل الجينات ثنائية الطبقات لاستخدامها في زراعة-المشارك مجموعات مختلفة من الخلايا. هذه المنصة القرص الجينات تمتلك العديد من المزايا. في المقام الأول، وشكل استنساخه وحجم صغير يؤدى لالتحفيز الميكانيكي للخلايا جزءا لا يتجزأ من دون الحاجة إلى خزعة بوNCH ​​أو غيرها من التغيير المادي للهيدروجيل للعديد من التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال بقاء الخلية عالية أثناء عملية التصفيف، وبعد تشكيل هلام فصل واضح من السكان الخلية اثنين داخل هلام غير مرئية مع أي منطقة متداخلة الأولية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Alginic Acid sodium salt</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1112</td>
			<td style="width:295px;">Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11965</td>
			<td>Example. Use desired medium type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Syringe Filters (0.02um Nylon)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">0979C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP510</td>
			<td>Prepare solution in sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Criterion Blotter Filter Paper</td>
			<td style="width:180px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1704085</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Cell Microsieve Membrane (10um pore size)</td>
			<td style="width:180px;">Biodesign Inc of New York</td>
			<td style="width:119px;">N10R</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td>Thaw in 37&#7506;C water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">FisherScience</td>
			<td style="width:119px;">S93364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBioreagent</td>
			<td style="width:119px;">BP121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Non-essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

الشكل 1 يصور تشكيل وطبقات من الهلاميات المائية الجينات. أكملت المواد الهلامية ثنائية الطبقات يحمل الفصل الأول كاملة من السكان الخلية كما هو مبين في الشكل 2. بقاء الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان) جزءا لا يتجزأ من داخل هذه ?...

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Views.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Video: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

A منصة رواية تمتد للتطبيقات في الخلايا والأنسجة Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

جدوى Bioprinted الخلوية التركيبات باستخدام طابعة ثلاثة الديكارتية موزع

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized التركيبات باستخدام الأنسجة محددة هيدروجيل Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.