<p class="jove_content"&gt; نشكر DD تشانغ الثاقبة للمناقشة وتوفير الكواشف بسخاء. معتمد من قبل MJ المنحة المعاهد الوطنية للصحة القلب والأوعية الدموية للتدريب وبحوث تكنولوجيا أريزونا صندوق المبادرة ، ومكافآت الإنجاز للعلماء الكلية. ويؤيد هذا العمل من قبل على جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة ومبتكر جديد (1DP2OD007161 - 01) ، المؤسسة الوطنية للعلوم (0855890) ، ومؤسسة جيمس س. ماكدونيل.</p

1. إنشاء القوالب المستخدمة في الزخرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاهيمي تصميم أنماط. يتم إنشاء أنماط التي تعمل على تشكيل شبكات الخليوي ، ومراقبة الاتصال الخليوي ، عزل الخلايا ، تحاكي الهياكل الطبيعية ، أو دليل على خلاف ذلك التصاق الخلية والتنسيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصميم بمساعدة الحاسوب CAD أو إنشاء نمط يستند إلى وخلق الضوئية الرئيسية. ويهدف هذا النمط المطلوب في برامج CAD ، مثل أوتوكاد ، وترسل بعد ذلك إلى شركة خارجية لإنتاج الضوئية الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضوئيه لانتاج نمط الرئيسي. والشرائح الزجاجية المزخرفة مع رقيقة إيجابية إما مقاومة أو مقاومة سلبية سميكة وهذا يتوقف على حجم الهيكل الذي يتم إنشاؤه. تستخدم شرائح زجاجية للفوائدها يجري منخفضة التكلفة أقوى ، من رقائق السيليكون والغبار التي لا تنتج ما يصل عند كسرها. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام هياكل ملائمة أخرى مثل حواجز شبكية الحيود ونمط رئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويرد الشريحة منقوشة إلى كومة من الشرائح التي لم منقوشة. يتم تنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء تدفق النظيفة للحد من الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء قوالب الرئيسي. يتم إنشاء حاوية البربون أكبر قليلا من كومة من الشرائح لعقد ز 30 من Polydimethylsiloxane (PDMS) الذي يصب بعد ذلك على سطح منقوشة photolithographically لإنشاء القالب الأولي. هو degassed في PDMS وسمح لعلاج لمدة يوم أو يومين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يشفى بمجرد مقشر وPDMS الخروج من نمط رئيسي وتشكل العفن للخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يختلط 6 غرام من الايبوكسي جزء 2 (المساعدة DevCon # 14310 (6 ز) لمدة 1 دقيقة ثم تصب في القالب الرئيسي ، وسمحت لdegassed العلاج. إفراغ الغاز يجب أن يتم بسرعة الايبوكسي (&lt;8 دقيقة) باستخدام العديد من فقاعة كسر حلقات وفقط باستخدام طبقة رقيقة قبل مجموعات الايبوكسي وإزالة فقاعة يصبح من المستحيل لإزالة الفقاعات. ز 6 وتستخدم وتنتج طبقة رقيقة مما يسهل سرعة إزالة الفقاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ساعة واحدة ، وسوف يكون الجزء 2 الايبوكسي شفي جزئيا ويمكن إضافة المزيد من الايبوكسي على أعلى دون التفريغ لإنتاج أكثر سمكا الهيكل الذي هو الأسهل للتعامل في خطوات لاحقة. ثم سمح لعلاج الايبوكسي ل1-2 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشفاء مرة واحدة ، هي إزالة الايبوكسي من القالب الرئيسي PDMS ويلف شريط حول العفن الايبوكسي لتشكيل الحاويات. ومن ثم خلق العفن تعمل عن طريق سكب PDMS على القالب الايبوكسي والتفريغ في PDMS ، وعلاج لمدة يوم أو يومين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشفاء مرة واحدة ، هي مقشر القالب العمل الخروج من الايبوكسي وتخزينها للحفاظ على النظافة. </li></ol> 2. الزخرفة من السطوح مع قوالب للتوجيهات الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع أجزاء صغيرة من العفن العمل بها ووضعها في الصعود إلى البوليسترين طبق بيتري. وصفت مواقع هذه الفروع العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وشكلت لترايبود من الفروع الصغيرة والمرجحة لضمان الاتصال بين امتثالي العفن على سطح العمل وطبق بيتري. ويمكن ملاحظة وضع جيد من خلال النظر في قاع الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت الجمعية الى غرفة البلازما. يبدأ العلاج البلازما ، واستمر في 150 باسكال عند 29.6 W (أقصى القوة) لمدة 10 دقيقة باستخدام الهواء البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج البلازما ، ويتم إزالة العفن وتوجيه الاتهام الوزن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوضع طبق بيتري تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة من التعقيم داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وتخزينها هناك حتى المصنف مع الخلايا. </li></ol> 3. بذر السطوح مع الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استزراع خلايا SH - 2266 - SY5Y CRL ورم الخلايا البدائية العصبية البشرية أو غيرها باستخدام بروتوكولات موحدة لنوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاء SH - 2266 - SY5Y CRL يقاس خلايا ورم الخلايا البدائية العصبية الإنسان بصريا قبل البذر على سطح منقوشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تقسيم خلية من معيار لإزالة الخلايا من سطح صحن بيتري بهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي المصنفة الخلايا ، التعويم مرة واحدة ، على سطح الطبق بيتري منقوشة بعد المخفف لتحقيق التقاء المطلوب عند وضعه على سطح منقوشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح للخلايا لتسوية ونعلق على السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو طبق بيتري المحتضنة منقوشة لعدة ساعات إلى عدة أيام في حين أن خلايا التجمع على نمط إنشاؤها بواسطة البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إضافة إلى زراعة الخلايا العصبية ، وحامض الريتينويك (10 ميكرومتر) يوميا من أجل حث الخلايا على التمايز إلى حالة تشبه الخلايا العصبية. يتم اضافة حمض الريتينويك في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف حمض الريتينويك يوميا لعدة أيام ، وبعد ذلك سوف يتم ملاحظتها التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استبدال وسائل الاعلام كل يوم 3-4. </li></ol> 4. الملاحظة والتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تؤخذ الصور الدورية للخلايا الحية أو أشرطة الفيديو لمراقبة سلوك الخلايا مع مرور الوقت. لوحات حية ، وتوضع الخلايا في أعلى مرحلة المجهر الحاضنة التي تحافظ على خلايا عند 37 درجة مئوية والرطوبة 100 ٪ ، و 5 ٪ CO 2. ويمكن أيضا أن تكون ثابتة والخلايا الملون تحت المراقبة لمضان </li><lيتم استيراد ط&gt; الصور أو مقاطع الفيديو من الخلايا التي تم القبض على صورة نظام التحليل وتتم القياسات بما في ذلك معدل نمو حجم الخلية ، وسرعة الهجرة ، والتمايز ، والمحاذاة ، والموقع من بروتينات معينة ، وغيرها. </li></ol> 5. ممثل النتائج : ونتيجة نموذجية لتنفيذ تقنية الطباعة الحجرية البلازما هي تشكيل نمط من الخلايا التي تشبه بعض بنية تعسفية أو الطبيعية. ويعتبر هذا في الشكل 1A - B حيث تم إنشاء خطوط وشبكات الخلايا العصبية. ويمكن استخدام أنواع الخلايا الأخرى كذلك كما هو مبين في الشكل 1C - D ، مما يدل على الإنسان خلايا بطانة الوريد السري (HUVEC) وخلايا عضلات الهيكل العظمي C2C12 تشكيل شبكات. ويمكن أيضا مواد مثل البولي - L - يسين تكون منقوشة ، الشكل 1E لتسهيل الحجز على بعض أنواع الخلايا وغيرها من الاستخدامات. في حالة الخلايا العصبية تظهر ، ما كان يتم إنشاء شبكات من الخلايا التي لها صلات بينهما. يتطابق هذا ما يحدث بشكل طبيعي في الخلايا العصبية في الدماغ حيث لديهم اتصالات منفصلة بين الخلايا المجاورة التي تؤثر على عمل الدماغ. مع إنشاء هيكل من هذا القبيل في المختبر ، ويمكن أن يكون العدد ، والموقف ، والتردد وعوامل أخرى من الاتصالات للرقابة منتظمة. ويمكن قياس هذه النتيجة توجيه الاتهام البصر ويمكن أن تنفذ المدخلات الإضافية مثل المواد الكيميائية أو التحفيز الكهربائي للتحقيق في سلوك الشبكة. ومن شأن النتيجة السلبية أن يكون نمط متضخمة أو ناقصة أو عينة ملوثة. ونمطا غير مكتملة أو غير ناضج نتيجة بذر الركيزة إما مع خلايا قليلة جدا أو كثيرة جدا والتي لن تزويد نمط مثالي مع مبلغ من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لم يتم تصميم هذا النمط بشكل صحيح (على سبيل المثال ، خطوط ضيقة جدا) فإن الخلايا لا تكون قادرة على تولي وتنمو بنجاح على ذلك. في حالة وجود عينة ملوثة ، لن النظافة المناسبة قد حافظت خلال واحدة من الخطوات رغم أن هذا أمر نادر الحدوث عند اتباع البروتوكول المناسب خلية ثقافة يرجع ذلك إلى حقيقة أن الزخرفة البلازما يعقم أيضا الركيزة. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. الزخرفه من الخلايا والبروتين.

<ol>
	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides.">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li><li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+(&#956;PIP).">Microscale Plasma-Initiated Patterning (&#956;PIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li><li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks.">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Johansson, B. -. L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth.">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li><li>Murakami, T., Kuroda, S. -. i., Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma:+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment.">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li><li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , (1994).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li><li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates,+Lengths,+and+Orientations.">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li><li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation.">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li><li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications:+a+brief+review.">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li><li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-treated+polystyrene+surfaces:+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions.">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li><li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Sch&#246;n, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion.">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

أسلوب التحقيق الخلية المقدمة هنا يمكن خلق أنماط معقدة من الشبكات المتعددة الخلايا التي تحاكي الهياكل البيولوجية وكذلك يوفر وسيلة لإنتاج المحفزات التي هي في طبيعتها التحت خلوية مما يسهل ثم التحقيقات في سلوك كل من خلية تجميع والاستجابات خلية واحدة إلى عوامل بيئية. استخدام هذه الطريقة بسيطة لكنها قوية كما أنه يمكن تنفيذ بسرعة مع انخفاض تكلفة المعدات في المختبر نفس الثقافة الخلية. بل هو أيضا بقوة الخلية الحساسة ، ويسمح سهلة الملاحظة للسلوك والناتجة من الطبيعة المستقرة لفترات زمنية طويلة ، مما يسمح التحقيق في سلوك الخلية طويلة الأجل. بالإضافة إلى أنه يسمح لمجموعة متنوعة من التجارب التي يتعين القيام بها لأنه متوافق مع العديد من أنواع الخلايا ويمكن أن تخلق أنماط التعسفي. استقرار على المدى الطويل لهذه التقنية مستمد من حقيقة أن functionalization سطح الكشف عنها من قبل البلازما هي جزء من السطح وليس طلاء أو طبقة أخرى والتي يمكن إزالتها أو المتدهورة. إذا كان يحتفظ بها تحت السائل ، ويمكن لهذا النوع من التعديل تحتفظ بقدرتها الخلية التوجيهية لعدة أشهر. أهم جزء من التجربة اللازمة لضمان تحقيق نتائج ذات مغزى هو أن خلق نمط الرئيسية التي من شأنها أن تستخدم لتوجيه الخلية. إذا لم يتم هذا النمط مصممة على نحو سليم ، فإن الخلايا لا يستجيب بشكل مناسب لنمط وسلوك قد لا ينتج فائدة. يمكن المعلمات مثل عرض الخط وتباعد النمط ، والتأثير على الآخرين بشكل كبير التوافق مع خلية نمط معين ، وعادة ما يمكن إنشاء مجموعة من المعلمات من هذا القبيل على الشاشة الضوئية الرئيسية الأولية للتصميم الأنسب. معلمات هامة أخرى تتصل بتنفيذ الزخرفة تشمل خلق القالب ، والحفاظ على بيئة خالية الغبار ، زرع الخلايا والعقم العامة للثقافة الخلية. قد تتم عن طريق إنشاء قالب نقل مختلف الخطوات التي اتخذت للسماح المتكررة PDMS صب القالب قبالة أحد الايبوكسي. يتم إنشاء القالب الايبوكسي لأنه لن تتحلل في بنفس الطريقة مع مقاومة العفن ، وارتفاع نسبة الجانب هياكل صغيرة تحت الصب المتكررة. إذا تم صب نقل بشكل صحيح ، لن تسفر أبعاد ويتأثر به ولكن إذا كان غير صحيح من قبل مثل علاج ، التفريغ ضعيفة ناقصة ، أو التسخين المفرط ، وفقاعات ، وخشونة ، وتشوه من نمط يمكن أن يحدث الأمر الذي يؤثر على النتيجة النهائية. فيما يتعلق بالحفاظ على البيئة الغبار الحرة ، يجب أن تبقى نظيفة والقوالب ممكن أي غبار يمكن أن تتداخل مع الاتصال السليم بين العمل والعفن PDMS سطح والسليم وبالتالي البلازما التدريع والزخرفة الكيميائية. كثافة البذر من الخلايا ويجب أيضا أن يكون الأمثل لضمان أن لا خلايا قليلة جدا أو كثيرة جدا وتسكن منطقة نمط ويجب المحافظة على عقم لتجنب التلوث الجرثومي وغيرها من الخلايا المستخدمة. ويمكن أيضا أن يدرج هذا الاسلوب مع العناصر الأخرى مثل على microfluidics ، microelectrodes ، وتحقيقات الميكانيكية. وهذا يوفر محفزات إضافية للخلايا من أجل تكرار أفضل الظروف الفسيولوجية المختلفة خلال التجريب والعمل في المستقبل وتركز على دراسة الآثار المترتبة على هذه التركيبات

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> البلازما الأنظف وغرفة فراغ </td><td> Harrick البلازما </td><td> PDC - 001 </td><td></td></tr><tr><td> مضان مقلوب والتخلص المجهر النقيض </td><td> نيكون </td><td> TE2000 - U </td><td></td></tr><tr><td> مجهر مرحلة أعلى الحاضنة </td><td> AmScope </td><td> نموذج TCS - 100 </td><td> تعديل لتشمل بضميمة ان امدادات جو ملائم </td></tr><tr><td> البوليسترين طبق بتري </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> داو كورننغ </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> الايبوكسي </td><td> المساعدة DevCon </td><td> 2 الايبوكسي واضحة # 14310 طن </td><td></td></tr><tr><td> خلية ثقافة وسائل الإعلام </td><td> مختلف </td><td></td><td> وسائل الاعلام يلي الصيغ القياسية لنوع من الخلايا </td></tr><tr><td> حمض الريتينويك </td><td> سيغما </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

مطلوب في كثير من الأحيان التلاعب المنهجي لالمكروية الخلية مع قرار المتناهية الصغر والنانوية عن فك رموز مختلف الظواهر الخلوية والجزيئية. للتصدي لهذا المطلب ، قمنا بتطوير تقنية البلازما الطباعة الحجرية للتلاعب المكروية الخلوية عن طريق خلق نمط السطح مع أحجام ميزة تتراوح بين 100 نانومتر إلى ملليمتر. الهدف من هذه التقنية هو أن نكون قادرين على الدراسة في طريقة للرقابة ، وسلوك الخلايا الفردية ، فضلا عن مجموعات من الخلايا وتفاعلاتها. ويستند هذا الأسلوب الطباعة الحجرية البلازما على تعديل انتقائي للكيمياء السطحية على ركيزة من خلال حجب الاتصال من درجات الحرارة المنخفضة البلازما مع العفن الجسدي. هذا التدريع انتقائي يترك نمط الكيميائية التي يمكن أن توجه مرفق الخلية والحركة. ويمكن بعد هذا النمط ، أو قالب السطحية ، ويمكن استخدامها لإنشاء شبكات من الخلايا التي يمكن أن تحاكي بنية التي وجدت في الطبيعة وتنتج بيئة يمكن السيطرة عليها لإجراء التحقيقات التجريبية. تناسب هذه التقنية لدراسة الظاهرة البيولوجية كما أنها تنتج أنماط سطح ثابت على ركائز البوليمرية بطريقة شفافة حيويا. يمكن لأنماط سطح تستمر لأسابيع أو شهور وبالتالي التفاعل مع دليل الخلايا لفترات زمنية طويلة مما يسهل من دراسة طويلة الأجل العمليات الخلوية ، مثل التفاضل والتأقلم معها. تعديل على السطح الكيميائية في المقام الأول في الطبيعة ، وبالتالي لا يدخل تدخل الطوبوغرافية أو المادية لتفسير النتائج. كما أنه لا ينطوي على أي مواد سامة أو قاسية لتحقيق الزخرفة ومتوافق لزراعة الأنسجة. وعلاوة على ذلك ، يمكن تطبيقه لتعديل أنواع مختلفة من ركائز البوليمرية ، والذي يرجع إلى القدرة على ضبط ممتلكاتهم مثالية لوتستخدم على نطاق التطبيقات البيولوجية. القرار تحقيقه هو مفيد أيضا ، وبمعزل عن عمليات محددة ، مثل الهجرة ، والالتصاق ، أو ملزما يسمح للملاحظات ، المنفصلة واضحة على مستوى واحد لmulticell. وقد استخدمت هذه الطريقة لتشكيل شبكات متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا لإجراء التحقيقات التي تنطوي على الهجرة ، ويشير ، وتكوين الأنسجة ، وسلوك وتفاعلات الخلايا العصبية استدعي في الشبكة.

Watch this Scientific Journal Video about Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks at JoVE.com

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

وقد تم تطوير تقنية الطباعة الحجرية تنوعا البلازما لتوليد أنماط سطح مستقر لتوجيه مرفق الخلوية. ويمكن تطبيق هذه التقنية لإنشاء شبكات الخليوي بما في ذلك تلك التي تحاكي الأنسجة الطبيعية واستخدمت لدراسة العديد من أنواع الخلايا متميزة.

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

plasma-lithography-surface-patterning-for-creation-of-cell-networks

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Views.  University of Arizona. وقد تم تطوير تقنية الطباعة الحجرية تنوعا البلازما لتوليد أنماط سطح مستقر لتوجيه مرفق الخلوية. ويمكن تطبيق هذه التقنية لإنشاء شبكات الخليوي بما في ذلك تلك التي تحاكي الأنسجة الطبيعية واستخدمت لدراسة العديد من أنواع الخلايا متميزة.

Video: Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي<sub&gt; 2</sub&gt; ركائز

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

باستخدام لاصق الزخرفة لانشاء 3D ورقة أجهزة ميكروفلويديك

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&amp;#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

نظام ميكروفلويديك مع الزخرفة السطحية للتحقيق فقاعة التجويف (ق) التفاعل -Cell وBioeffects الناتجة على مستوى وحيدة الخلية

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data sets of patient or specimen anatomy in clinical or preclinical settings. However, the use of a virtual, on-screen display limits the ability of these tomographic images to fully convey the anatomical information embedded within. One solution is to interface a biomedical imaging data set with 3D printing technology to generate a physical replica. Here we detail a complementary method to visualize tomographic imaging data with a hand-held model: Sub Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. SSLE offers several unique benefits including: the facile ability to include anatomical labels, as well as a scale bar; streamlined multipart assembly of complex structures in one medium; high resolution in the X, Y, and Z planes; and semi-transparent shells for visualization of internal anatomical substructures. Here we demonstrate the process of SSLE with CT data sets derived from pre-clinical and clinical sources. This protocol will serve as a powerful and inexpensive new tool with which to visualize complex anatomical structures for scientists and students in a number of educational and research settings.

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

A methodology is described herein for representing anatomical imaging data within crystals. We create scaled three-dimensional models of biomedical imaging data for use in Sub-Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. This tool offers a useful complement to computational display or three-dimensionally printed models used within clinical or educational settings.

تحجيم نموذج تشريحي إنشاء الطبية الحيوية بيانات التصوير الشعاعي الطبقي والأفراد المرتبطين تسميات اللاحقة سطح الفرعي النقش بالليزر (SSLE) من بلورات الزجاج

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...