وأيد هذا العمل من قبل ويلكوم ترست الدكتوراه السريرية الزمالة (ECAT).

1. تصنيع أنماط Parylene على شافي 2: عملية تدفق (انظر الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصميم المطلوب التكوين parylene-C باستخدام حزمة برامج محرر تخطيط، وقادرة على القراءة / الكتابة CIF (نموذج متوسط ​​معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) أو GDS-II (قاعدة بيانات الجرافيك النظام الثاني) الملفات. CIF وGDS-II هي صناعة صيغ الملفات القياسية لتصميم الدوائر المتكاملة الفني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجنة قناع الصورة إلى منشأة تصنيع الالكترونيات الدقيقة المناسبة، أو جعل في المنزل في حالة وجود مرافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسدة رقاقة السيليكون في فرن الأفقي في الغلاف الجوي (H 2 1.88 حركة تحرير السودان وحركة تحرير السودان 1.25 O 2) في 950 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لإنتاج 200 نانومتر شافي 2 طبقة (تأكيد سمك مع بقعة صغيرة الطيفية الإنعكاس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس الرقاقة تتأكسد مع التصاق المروج سيلاني. الآن إيداع parylene-C في 22 ° C بمعدل 1.298 نانومتر / ملغ من ديمر باستخدام نظام ترسب فراغ صممت خصيصا لإيداع parylene. A 100وقد استخدم نانومتر سميكة parylene-C طلاء لجميع الأمثلة هو مبين أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hexamethyldisilazane إيداع المقبل (HMDS) التصاق المروج على الرقاقة المغلفة parylene باستخدام الصور مقاومة نظام الطلاء مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن تدور الرقاقة عند 4،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية في حين تطبيق إيجابية الصور مقاومة (مما أدى إلى سماكة النظرية من 1 ميكرون)، وذلك باستخدام نفس نظام طلاء مقاوم الضوء على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لينة خبز الرقاقة لمدة 60 ثانية في 90 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج كل من رقاقة وقناع الصورة premanufactured إلى اليجنر قناع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح الرقاقة مقاومة للضوء المغلفة مع تمثيل السلبية للأشعة فوق البنفسجية من التكوين المطلوب parylene-C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خبز رقاقة يتعرض لمدة 60 ثانية في 110 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كافة الصور تتعرض مقاومة من خلال تطوير رقاقة في محلول المطور المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر قبالة parylene دون وقاية. استخدام نظام البلازما الأكسجين حفر (عند ضغط 50 غرفة mTorr، 49 SCCM O 2، 100 W RF الطاقة في 13.56 ميغاهيرتز، ومعدل حفر 100 نيوتن متر / دقيقة) لكشف شافي الأساسية 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزهر الرقاقة باستخدام منشار تقطيع المناسب (سرعة الدوران 30،000 دورة في الدقيقة، وسرعة تغذية 7 ملم / ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف رقائق في H 2 O منزوع الأيونات وضربة الجافة مع النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر رقائق (أجل غير مسمى) في صناديق الغبار الحرة حتى المطلوبة. </li></ol> 2. رقاقة تنظيف والتنشيط: بروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مقاوم الضوء المتبقية من رقائق بغسل في الأسيتون لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في منزوع الأيونات H 2 O 3X المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل حمض سمكة البيرانا الطازجة (نسبة 5:03 من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين وحامض الكبريتيك 98٪). تنبيه: تحضير حمض سمكة البيرانا مع عناية كبيرة. وهو مؤكسد قوي جدا، هو الحمضية بقوة، وخلط بيروكسيد الهيدروجين مع حمض الكبريتيك هو تفاعل طارد للحرارة. تنفيذ هذه المرحلة في غطاء الدخان حامض. 2 دقيقة تسمح لتمرير بعد خلط الحمض سمكة البيرانا ولكن استخدام في غضون 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقائق نظيفة وحفر عن طريق الغمر في بيحمض ranha لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف رقائق 3x أخرى في H 2 O منزوع الأيونات ونقل إلى طبق الثقافة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن تفعيل رقائق لتنميط الخلية. على سبيل المثال، إضافة اثنين من رقائق لكل بئر إلى لوحة 6 جيدا ثم إضافة 2 مل من مصل بقري جنيني وذلك لتزج تماما عن رقائق البطاطس. تنفيذ هذا، وجميع مراحل زراعة الخلايا اللاحقة، تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي هود زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رقائق في مصل الدم ل3-12 ساعة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: الخطوات 2،4-2،7 يجب أن يتم تنفيذ بالتسلسل وبدون تأخير بين الخطوات. إذا تأخر تفعيل المصل بواسطة ≥ 24 ساعة بعد البيرانا المعاملة، هو ضعف الزخرفة الخلية نتيجة لانخفاض النفور من خلية شافي 2 المناطق. الحلول البديلة التي تحتوي على تنشيط بروتينات معينة التصاق الخلايا يمكن استخدامها في مكان مصل بقري جنيني. مثل هذه الحلول تغيير خصائص خلية التصاق اثنين من ركائز المتناقضة (انظر نتائج ممثلة لمثال). </li&gt; </ol> 3. طلي خطوط الخليوي على رقاقة: بروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة رقائق من حل تفعيل ويغسل مرة واحدة لمدة 10 ثانية في محلول الملح المتوازن هانك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة في ثقافة جيدا واختيار نوع من الخلايا لوحة وتعليق في وسائل الإعلام نموها المعتادة. الأمثل كثافة الطلاء الخلية يعتمد على كل نوع من الخلايا ونمط هندسي من parylene-C على رقاقة. A كثافة 5 × 10 4 خلية / مل هو نقطة انطلاق معقولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تصميم التصوير إلى الدافع الأساسي لتنميط الخلية ولكن يمكن بسهولة أن تقييم سلوك الخلية الحية باستخدام مجهر تشريح وكاميرا رقمية مع عدسة تتابع مناسبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays.">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li><li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+alive:+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes.">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li><li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor.">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li><li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cell+adhesion,+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants.">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li><li>Bacakova, L., Svorcik, V., Kimura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research. , 5-56 (2008).</li><li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture.">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li><li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -. M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+and+micro-+fabrication.">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li><li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurochip:+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons.">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li><li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates.">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li><li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip.">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li><li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+molecular+assembly+patterning:+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications.">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li><li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li><li>Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reusable,+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning.">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

الغمر من رقائق في حمض سمكة البيرانا لا يخدم فقط لإزالة أي المواد العضوية المتبقية ولكن أيضا يحفر السطوح الركيزة. هذا هو المفتاح لتمكين التنشيط الفعال مع مصل بقري جنيني. عدم القيام بذلك يمنع خلايا الزخرفة وعميقا يغير سلوك الخلية على رقاقة. ليس هناك شرط لتعقيم رقائق بعد التنظيف مع حمض سمكة البيرانا. في الواقع التعقيم بواسطة الأشعة فوق البنفسجية التعرض وقد تبين لتقويض الزخرفة خلية في الأزياء تعتمد على الجرعة 13. يجب توخي الحذر ليغسل كل مقاوم الضوء المتبقية بعد عملية الطباعة بصفائح معدة ضوئيا. استمرار مقاومة للضوء يمكن أن تكون بمثابة طبقة لاصقة خلوي غير المرغوب فيها التي يتجاوز الزخرفة التي تمليها parylene-C/SiO 2 الهندسة. الأسيتون فعالة عند استخدام عملية الطباعة التصويرية المذكورة أعلاه ومع الكواشف محددة. ومع ذلك، وأنواع أخرى من مقاومة للضوء قد تتطلب المذيبات المختلفة. لتقييم تأثير ونجاح احالإقليم الشمالي خطوات التصنيع، ويمكن قياس زاوية الاتصال من اثنين من ركائز المتناقضة. ويوضح الشكل (2) والتعديلات التي تحدث أثناء عملية التنشيط رقاقة. فمن المرجح، مع ذلك، أنه لاصقة معينة ومكونات البروتين مثير للاشمئزاز في مصل الدم في نهاية المطاف تمكين رقاقة نقوش parylene لممارسة خصائص خلوي لاصقة أو خلوي للاشمئزاز منها لها. جميع النتائج ممثل تستخدم رقائق بسمك parylene من 100 نانومتر، على الرغم من أننا قد منقوشة بنجاح باستخدام كل سمكا وأرق طبقات parylene. الأهم من ذلك، هذه التقنية الحفر الطباعة التصويرية يسمح سيطرة أكبر بكثير ثلاثية الأبعاد من التكوين parylene من ذلك يتضح هنا. على سبيل المثال، باستخدام مزيج من photomasks، فمن الممكن لخلق مناطق parylene من سمك مختلطة. هذا يفتح الطريق أمام إنشاء مزارع الخلايا مع تعريف تضاريس ثلاثية الأبعاد، تتجاوز مجرد إملاء من مناطق التصاق الخلية / repulسيون، ويحتمل أن تقدم وسيلة لدمج قنوات ميكروفلويديك في بناء. كما هو مبين، ولكن هذا ليس الزخرفة منصة فعالة عالميا عبر أنواع الخلايا. خطوط مختلفة من الخلايا، مع لمحات متنوعة التصاق الخلية الجزيء، وتتصرف بشكل مختلف لا يثير الدهشة عندما مثقف على هذه المنصة. نحن لم تتعرف بعد على المكونات الرئيسية في المصل، ولا مستقبلات خلايا الغشاء مجانية، والتي تدعم هذه المنصة خلية الزخرفة. القيام بذلك في المستقبل وعود لتوسيع فائدته وخصوصية. على سبيل المثال، &quot;غير الزخرفة &#39;خط خلية يمكن تعديلها وراثيا في التعبير عن جزيء التصاق المطلوبة وذلك تشجيع الزخرفة.

فهم الآليات التي تملي التصاق الخلية والزخرفة على المواد الاصطناعية المهم لتطبيقات مثل هندسة الأنسجة، واكتشاف المخدرات، وتصنيع أجهزة الاستشعار 1-3. تتوفر العديد من التقنيات المتطورة و، كل ميزة أخذ العوامل البيولوجية والكيميائية، والفيزيائية التي تؤثر على عدد لا يحصى التصاق الخلية. هنا، نحن تصف تقنية خلية الزخرفة التي تستخدم العمليات التي وضعت في البداية لأغراض تصنيع الإلكترونيات الدقيقة. على هذا النحو، النظام الأساسي هو وضع جيد لتمكين التكامل المصب التكنولوجيات الدقيقة، مثل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، إلى منصة الزخرفة. واجهة بين غشاء الخلية ومادة المجاورة هي ثنائية الاتجاه ومعقدة. في الجسم الحي، والبروتينات المصفوفة خارج الخلية توفير بنية وقوة وتأثير على سلوك الخلية عن طريق التفاعل مع مستقبلات التصاق الخلية. وبالمثل، الخلايا في الخامسitro التفاعل مع ركائز الاصطناعية عبر طبقات امتصاص البروتينات 4 بينما التأثيرات الفيزيائية والكيميائية أيضا تعدل التصاق. على سبيل المثال، سطح البوليمر يمكن تقديم المزيد &quot;قابل للبلل&quot; (ماء) عن طريق الأيونات أو الأشعة فوق البنفسجية التشعيع، أو الحفر عن طريق العلاج مع حمض أو هيدروكسيد 5. أساليب الزخرفة التي أنشئت لخلية الاستفادة من هذه وغيرها من الوسطاء التصاق الخلية. وتشمل الأمثلة الطباعة النافثة للحبر 6، 7 microcontact ختم، الشلل الجسدي 8، 9 على microfluidics، في الوقت الحقيقي التلاعب 10، وانتقائية الزخرفة التجمع الجزيئي (SMAP) 11. كل له فوائد وقيود محددة. سائق أساسي في عملنا، ومع ذلك، هو دمج الزخرفة الخلية مع أنظمة ميكانيكية إلكترونية صغيرة (ممس). ممس الرجوع إلى الأجهزة الميكانيكية الصغيرة جدا مدفوعا الكهرباء. هذا يتداخل مع المقياس النانوي ما يعادلها، nanoelectromechنظم anical. أصبح هذا المفهوم العملي الوحيد عندما استراتيجيات تمكين أشباه الموصلات تلفيق عقده في microscale. ودون قصد وجدت تقنيات التصنيع الدقيق وضعت أصلا للإلكترونيات أشباه الموصلات مفيدة لاستخدامات أخرى مثل الكهربية الخلوية، على سبيل المثال. ومن الأهداف الرئيسية المصب هو الجمع بين هذه التكنولوجيات الدقيقة مع عملية الزخرفة الخلية عالية الدقة (تشكيل الجهاز bioMEMS). عدة تقنيات الخلية الزخرفة الموجودة وموثوق بها وإلا والعملية تتعارض مع هذه الفكرة. على سبيل المثال، والمحاذاة دقيقة من أي الالكترونيات الدقيقة جزءا لا يتجزأ من أجهزة الاستشعار أو أمر أساسي لفعاليتها ولكن من الصعب للغاية تحقيق باستخدام تقنية مثل microcontact ختم. للتحايل على هذه المشكلة، ونحن نعمل على منصة الزخرفة شافي 2 المستندة يستخدم المطبوعة photolithographically parylene-C. ضوئيه ينطوي على نقل الميزات الهندسية منقناع لركيزة عبر الإضاءة فوق البنفسجية. تم تصميم قناع باستخدام البرنامج المناسب التصميم بمساعدة الكمبيوتر. على طبق من زجاج، طبقة رقيقة من الكروم غير الشفافة يمثل نمط هندسي المطلوب (قرار ميزة من 1-2 ملم هو ممكن). وهي مغلفة الركيزة لتكون منقوشة مع طبقة رقيقة من مقاومة للضوء (البوليمر حساسة للأشعة فوق البنفسجية). ثم يتم محاذاة البوليمر المغلفة وتقديمهم في اتصال وثيق مع القناع. يتم تطبيق مصدر الأشعة فوق البنفسجية بحيث مناطق غير محمية والمشع وبالتالي تصبح قابلة للذوبان وقابل للنقل في الخطوة القادمة التنمية، وترك التمثيل parylene-C من النمط قناع وراء. هذه العملية نشأت خلال تطوير أجهزة أشباه الموصلات. على هذا النحو، وكثيرا ما تستخدم رقائق السليكون باعتبارها الركيزة. ترسب الطباعة التصويرية من parylene-C على شافي 2 هو بالتالي عملية بسيطة وموثوق بها التي تأخذ عادة مكان في مرافق غرف الأبحاث الدقيقة. في حين parylene ديهالعديد من الخصائص الهندسة الحيوية مرغوب فيه (خامل كيميائيا، غير قابلة للتحلل الحيوي)، وهو عامل تقييد استخدامه مباشرة في الزخرفة الخلية الفقراء بالفطرة الإلتصاق الخلية، يعزى في جزء منه إلى للا مائية المتطرفة. ومع ذلك، فقد سبق استخدامها parylene-C بشكل غير مباشر عن الزخرفة الخلية، على سبيل المثال باعتبارها قشر بعيدا قالب الخلوية 12،13. وهذا النهج محدودة بسبب ضعف القرار، ويتطلب خطوات متعددة. عملية وصفها هنا بدلا من ذلك يستخدم خطوة حفر الحامض، تليها الحضانة المصل، لضمان أن المناطق parylene-C تصبح خلية لاصق، من خلال مزيج من خفض للا مائية ومصل البروتين ملزمة. والنتيجة النهائية هي بناء تتألف من اثنين من ركائز مختلفة والتي، بعد تفعيل البيولوجية، تظهر خصائص خلوي لاصقة أو خلوي للاشمئزاز منها، ويمثل منصة فعالة كلام بسرعة خلية بذلك. الأهم من ذلك، ليست هناك حاجة لإدخال AG البيولوجيةالوالدان في مرفق غرف الأبحاث باعتبارها ركائز منقوشة يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى قبل استخدامها (وعندها يتم تنشيطها باستخدام مصل بقري جنيني أو حل التنشيط أخرى). وبالتالي هذا المنبر الزخرفة parylene-C/SiO 2 هو مرشح جيد لتشكيل ائتلاف مع مكونات ممس، وعمليات التصنيع بحيث تعكس عن كثب تلك المستخدمة لتصنيع الإلكترونيات الدقيقة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

منصات الزخرفة خلية دعم أهداف البحث واسعة النطاق، مثل بناء المعرفة مسبقا الشبكات العصبية في المختبر واستكشاف بعض الجوانب المركزية في الفيزيولوجيا الخلوية. الجمع بين الزخرفة بسهولة مع خلية متعدد الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) والقائمة على السيليكون &quot;مختبر على رقاقة&quot; التكنولوجيات، لا بد من بروتوكول التصنيع الدقيق متوافق. نحن تصف طريقة التي تستخدم ترسب البوليمر parylene-C على شافي 2 رقائق. ضوئيه تمكن الزخرفة دقيقة وموثوق بها من parylene-C في القرار على مستوى ميكرون. التنشيط اللاحقة عن طريق الغمر في المصل الجنين البقري (أو الحل تفعيل محددة أخرى) النتائج في الركيزة التي الخلايا المستزرعة الالتزام، أو صد من قبل، أو parylene شافي 2 المناطق التوالي. وقد سمحت هذه التقنية الزخرفة من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا (بما في ذلك الخلايا الأولية الفئران الحصين، كلوة الجنين البشري 293 خط الخلية، مثل الخلايا العصبية البشرية سرطانة مسخيةخط الخلية، والخلايا الحبيبية للدماغ الفئران الأولية، والخلايا الجذعية مثل المستمدة دبقي الإنسان الأساسية). ومن المثير للاهتمام، ولكن، ومنصة ليست عالمية، مما يعكس أهمية خلية محددة جزيئات الالتصاق. وتكلف هذه العملية الزخرفة الخلية فعالة وموثوق بها، والأهم يمكن إدراجها في التصنيع الدقيق القياسية (تصنيع الرقائق) البروتوكولات، مما يمهد الطريق لدمج التكنولوجيا الدقيقة.

ويتضح عملية الطباعة بصفائح معدة ضوئيا من الزخرفة شافي 2 مع parylene-C في الشكل 1. مرة واحدة على استعداد، وتفعيل رقائق في مصل بقري جنيني تمكن مجموعة واسعة من أنواع الخلايا لتكون منقوشة في الثقافة. وقد منقوشة مجموعتنا بنجاح خلايا قرن آمون الفئران الأولية 14-16، خط HEK 293 خلية 17، والعصبية التي تشبه الخلايا سرطانة مسخية الإنسان (HNT) خط الخلية 18، والخلايا الحبيبية للدماغ الفئران الأولية، والخلايا الجذعية مثل المستمدة دبقي الإنسان الأساسية. ويوضح الشكل 3 الزخرفة قوية من كلوة الجنين البشري 293 الخلايا على نمط parylene تتكون من العقد دائرية مع &#39;عبر الشعر&#39; التمديدات. وكان تفعيل الشريحة في هذا المثال مع مصل بقري جنيني. على النقيض من ذلك، يوضح الشكل (4) القدرة على زيادة منصة الزخرفة باستخدام الحلول البديلة التنشيط. باستخدام محلول من ألبومين المصل البقري (3 ملغ / مل) و<html> فبرونيكتين (1 ميكروغرام / مل) في HBSS، وقد تم مقلوب الزخرفة المبدأ السابق. ويوضح الشكل 5 نوع مختلفة من الخلايا (خط المستمدة الإنسان الأولية مثل خلية جذعية مستمدة من دبقي الدرجة العالية). هنا، هندسة الآثار نمط سلوك الخلية الأساسية، مع نمط هو مبين في الشكل 4A تعزيز النمو عملية الخلايا جنبا إلى جنب رقيقة parylene-C المسارات كما هو موضح في الشكلين 4B و 4C. بعض أنواع الخلايا لا نمط عند استخدام بروتوكول تفعيل الجنين مصل بقري المعمول بها. الشكل 6 يوضح 3T3 الخلايا L1 متزايدة لنقطة التقاء مع عدم وجود الفرق خلوي مثير للفتنة أو خلوي لاصقة ملحوظ بين parylene-C وشافي 2 المناطق. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. تدفق بياني يوضح عملية تصنيع أنماط parylene-C على شافي 2. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> الشكل 2. مخطط تدفق توضح التغيرات في زاوية الاتصال لمنقوشة parylene-C وشافي 2 المجالات خلال خطوات تفعيل الشريحة. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> الرقم 3. . المحتضنة لمدة 3 ساعة في مصل بقري جنيني وبعد ذلك كانت الخلايا رقائق التصوير الخلية الحية من كلوة الجنين البشري 293 الخلايا المستزرعة على parylene-C/SiO 2 بعد ثلاثة أيام في المختبرمطلي في التعليق بتركيز 5 × 10 4 خلية / مل. Parylene-C تعزز التصاق الخلية بينما العارية شافي 2 يصد الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> الشكل 4. التصوير الخلية الحية من كلوة الجنين البشري 293 الخلايا المستزرعة على parylene-C/SiO 2 بعد ثلاثة أيام في المختبر رقائق تفعيلها لمدة 3 ساعة في مختلف الحلول التنشيط على نحو رشيد: A: مصل بقري جنيني، B: vitronectin (1 ميكروغرام / مل) في HBSS، C: ألبومين المصل البقري (3 ملغ / مل) + vitronectin (1 ميكروغرام / مل) في HBSS، D: ألبومين المصل البقري (3 ملغ / مل) + فبرونيكتين (156؛ ز / مل) في HBSS. كانت الخلايا مطلي في التعليق على كثافة 5 × 10 4 خلية / مل. نلاحظ كيف أدى معاملة مختلفة للرقاقة في عكس العقيدة الزخرفة السابقة، مع شافي 2 لاصق الآن وparylene-C مثير للاشمئزاز. Parylene-C عقدة قطرها 250 ميكرون، وتكييفها من هيوز وآخرون 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> الرقم 5. الصور المناعي للخلايا الجذعية مثل المستمدة دبقي الإنسان الأولية نمت على أنماط مختلفة من parylene-C على شافي 2 ج: التخطيطي يوضح تصميم شبكي parylene هو مبين في B و C </strong&gt; B:. الإسفار صورة مجهرية من الخلايا الثابتة (بعد 4 أيام في المختبر) الملون لييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) C: صورة مجهرية ضوء الخلايا الحية على الشريحة نفسها D: الإسفار الصورة توضح الخلايا GFAP الملون على parylene مختلفة . تصميم E: الانعكاس صورة العقدة وتحدث تصميم parylene تصويرها في D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> الرقم 6. التصوير الخلية الحية من خلايا 3T3 L1 مثقف على parylene-C/SiO 2 بعد أربعة أيام في المختبر. رقائق تفعيلها لمدة 3 ساعة في مصل بقري جنيني بعد ثكانت مطلية الخلايا hich في التعليق (3 × 10 4 خلية / مل). في هذه الحالة، ومنصة لا تمكن الزخرفة، مع الخلايا تصبح متكدسة بالتساوي على parylene-C وشافي 2 المناطق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

يصف هذا البروتوكول على طريقة التصنيع الدقيق تتلاءم مع الزخرفة الخلية على شافي 2. يتم طباعة المعرفة مسبقا تصميم parylene-C photolithographically على شافي 2 رقائق. بعد الحضانة مع المصل (أو حل التنشيط الأخرى) الالتزام الخلايا على وجه التحديد (وتنمو وفقا لمطابقة) الكامنة parylene-C، في حين يجري صدت من قبل شافي 2 المناطق.

الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي<sub&gt; 2</sub&gt; ركائز

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

13.2K Views.  The University of Edinburgh.  يصف هذا البروتوكول على طريقة التصنيع الدقيق تتلاءم مع الزخرفة الخلية على شافي 2. يتم طباعة المعرفة مسبقا تصميم parylene-C photolithographically على شافي 2 رقائق. بعد الحضانة مع المصل (أو حل التنشيط الأخرى) الالتزام الخلايا على وجه التحديد (وتنم?...

Video: Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

باستخدام لاصق الزخرفة لانشاء 3D ورقة أجهزة ميكروفلويديك

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

منهج تنوعا من الزخرفة البروتينات والخلايا

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...