يسمح هذا البروتوكول بحل الهيكل العظمي الدوري للغشاء في الجزء الأولي من المحور العصبي من الخلايا العصبية المستزرعة. من خلال فحص توطين البروتينات ، يمكن الحصول على نظرة ثاقبة في الوظيفة في الهيكل العظمي الدوري للغشاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قوتها وسهولة استخدامها.
المجهر المنظم للإضاءة قادر على حل الهيكل العظمي الدوري للغشاء وإعداد العينة سهل ومباشر. يمكن لأي شخص لديه خبرة سابقة في الفحص المجهري الفلوري تنفيذ هذه التقنية بسهولة. تم تصميم هذا البروتوكول لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء إعداد العينة وتصويرها.
للبدء ، قم بإصلاح الخلايا العصبية باستخدام 4٪ Paraformaldehyde لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغطاء مرة واحدة في 0.2٪ BSA في محلول عازل للفوسفات واحتضنه لمدة 10 دقائق في محلول 1٪ من Triton X في PBS في درجة حرارة الغرفة. اغسل زلة الغطاء باستخدام BSA في محلول عازل للفوسفات ، وقم بتخفيف الأجسام المضادة المضادة ل ankyrin G باستخدام BSA في محلول عازل للفوسفات بنسبة واحدة إلى 200.
أضف محلول الأجسام المضادة إلى الغطاء واحتضنه بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول BSA العازل للفوسفات مرة واحدة في 0.1٪ Triton X في محلول الفوسفات العازل ومرة واحدة في محلول الفوسفات العازل. تمييع الفلورو 4 الموسومة ، إضافة المزيد من الأجسام المضادة الثانوية في محلول العازلة الفوسفات BSA وإضافة إلى زلة الغطاء.
اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول BSA العازل للفوسفات مرة واحدة في 0.1٪ Triton X في محلول الفوسفات العازل ، ثم مرة واحدة في محلول الفوسفات العازل. تحضير محلول ميكرومولاري واحد من Ferodin الموسومة في محلول عازل الفوسفات وإضافته إلى الخلايا. اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول الفوسفات العازل لألبومين مصل البقر مرة واحدة في 0.1٪ Triton X في محلول الفوسفات العازل ، ثم مرة واحدة في محلول الفوسفات العازل.
لتركيب الغطاء على شريحة زجاجية ، ضع قطرة من وسائط التركيب على شريحة ، واغمس الغطاء في الماء منزوع الأيونات ، واضغط عليه بمنشفة ورقية ناعمة لإزالة الماء الزائد. ضع الغطاء على الشريحة الزجاجية واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. إذا كان ذلك ممكنا ، استشر الموظفين من مرفق الفحص المجهري قبل التصوير واستخدم حاسبة زيت الغمر لاختيار زيت الغمر المناسب للعينة.
بمجرد أن تصبح العينات جاهزة ، تأكد من أن زلات الغطاء نظيفة وخالية من أي بقايا عن طريق تنظيفها بطرف قطني مغموس في الماء أو الإيثانول. ضع العينة في مجهر 3D-SIM وابحث عن الخلية لالتقاط الصورة. اضبط قوة خطوط الليزر ذات الصلة.
وأوقات التعرض لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد دون تبييض العينة بشكل كبير. اضبط الحدود العليا والدنيا للعينة في البعد Z وتابع للحصول على مكدس. قم بتشغيل خوارزمية إعادة الإعمار على المكدس للحصول على إعادة بناء فائقة الحل.
تحقق من عمليات إعادة الإعمار بحثا عن القطع الأثرية المعروفة وإذا لزم الأمر ، اضبط المعلمات لتصحيحها. قارن إعادة بناء بطاقة SIM بصورة واسعة المجال لمراقبة التحسينات في الدقة. عند إجراء الفحص المجهري للإضاءة المنظمة متعددة الألوان ، استخدم خوارزمية المحاذاة لمحاذاة القنوات المختلفة بشكل صحيح ، بمجرد أن تصبح إعادة الإعمار مرضية جاهزة.
حلقات الأكتين في الهيكل العظمي الدوري للغشاء لها مظهر دوري مميز. قم بإنشاء صورة إسقاط بأقصى كثافة في برنامج تحليل الصور باستخدام جميع المستويات البؤرية حيث تكون حلقات الأكتين مرئية. في صورة الإسقاط ذات الكثافة القصوى ، ارسم خطا عموديا عبر الحلقات المجاورة المرئية وسجل كثافة التألق جنبا إلى جنب مع وظيفة ملف تعريف مخطط الخط في البرنامج.
لحساب متوسط المسافة بين الذروة، لاحظ الحد الأقصى المحلي في ملف تعريف الخط وقم بقياس المسافة بين قمم كثافة الفلورسنت الفردية المجاورة. لتقييم التوطين المشترك للبروتينات المختلفة مع حلقات الأكتين في الهيكل العظمي الدوري للغشاء ، قم بإجراء تحليل التوطين المشترك على إعادة بناء SIM للأكتين والبروتين المرشح. ارسم يدويا اختيارا لتحديد المقطع الأولي للمحور العصبي كمنطقة ذات أهمية ، للحصول على المكون الإضافي سهل التوطين في النظام الأساسي للبرنامج ، وقم بتشغيل التحليل لحساب معامل ارتباط بيرسون للتوطين المشترك.
أثناء تحليل صورة SIM ، أظهرت عمليات إعادة بناء مكدسات الصور دورية واضحة لحلقات الأكتين. تم استخدام جسم مضاد مضاد ل ankyrin G لتصور ankyrin G.تم اختبار التوطين المشترك لحلقات ankyrin G والأكتين في الجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام إجراء تحليل colocalization لحساب معامل ارتباط بيرسون. كان معامل ارتباط بيرسون للتوطين المشترك لحلقات الأنكيرين G والأكتين الفلورية 0.36 زائد أو ناقص 0.03.
من الضروري استخدام زيت الغمر المناسب وضبط طاقة الليزر ووقت التعرض لجعل خطوط الشبكة مرئية. بمجرد تحديد أن البروتين هو جزء من الهيكل العظمي الدوري للغشاء ، يمكن التحقيق في وظيفته وتأسيسها في الحفاظ على الهيكل العظمي الدوري للغشاء. على سبيل المثال ، يمكن تحليل آثار هدم البروتين على حلقات الأكتين.
إن تطوير تقنيات الفحص المجهري فائق الدقة هو السبب في أننا نعرف أن الجزء الأولي للمحور العصبي يحتوي على هيكل عظمي دوري غشائي يتكون من حلقات الأكتين والطيف والأنكيرين. مكنت SIM الباحثين من تصور مكونات الهيكل العظمي الدوري للغشاء بسهولة والنظر إلى حلقات الأكتين في الخلايا الحية.
