وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (SFB 655) والاتحاد الأوروبي (ZF-الصحية).

1. إعداد خليط حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام morpholinos الجسم الحي كما الخلايا استيعاب يجعلها أكثر كفاءة من جزيئات morpholino العادي. انظر المعلومات الخاص بالشركة المصنعة للحصول على التفاصيل (الجدول 1: الكواشف والمواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام صبغة الفلورسنت تتبع (مثل CellTracker الأحمر CMTPX، إينفيتروجن) لتصور دقة الحقن. يتم استقلاب هذه الصبغة في الخلايا ويصبح الفلورسنت فقط في الخلية بعد امتصاص. لذلك، هذه الخطوة حاسمة لتحديد الخلايا التي تستهدف بكفاءة من قبل حقن مكروي cerebroventricular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10MM نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة: 7.4) لتمييع الحل morpholino. إذا كنت بحاجة لتخفيف من الحل morpholino، دائما استخدام برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ميكرولتر من مزيج الحقن وذلك بإضافة 9 ميكرولتر من الحل morpholino و 1 ميكرولتر من اله خلية تعقب صبغ (مخفف أو غير مخفف تركيز الأسهم من الحل morpholino هو 500 ميكرومتر نتائجنا السابقة تشير إلى أن 22 عدة جرعات مختلفة من morpholino - تتراوح من 50 ميكرون إلى 500 ميكرون - نتيجة في مستويات مختلفة من ضربة قاضية من كفاءة ضربة قاضية إلى الظواهر hypomorphic). 1 ميكرولتر من الحل هو بما فيه الكفاية للحقن في واحدة الزرد الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا وتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى الحقن. </li></ol> 2. إعداد جهاز حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حقن الشعيرات الدموية الزجاج باستخدام مجتذب إبرة. استخدام المعلمات التالية: قيمة دورة التدفئة: 463، وسحب قيمة دورة: 230، السرعة: 1.5 ثانية، والوقت: 75 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر الضغط وضبط إعدادات الضغط إلى 50 رطل أو 3.5 بار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات microinjector على النحو التالي: عقد الضغط 20 رطل، إخراج الضغط 10 رطل، قيمة الفترة من 2.5 و 100 ميللي ثانية مجموعة من النابضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحولعلى إضاءة الحلبة وحدد موقع خاتم على المسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع حامل الشعرية إلى الموقف المناسب بجانب المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الزجاج الشعرية في حامل. ضبط زاوية الحقن الى 45 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاجئة قبالة غيض من الزجاج الشعرية باستخدام غرامة نهاية ملقط ومعايرة الضغط الناتج من الفوهة. يجب أن يتم اختبار هذا بغمر رأس الإبرة في الماء الأسماك وإعطاء نبض الضغط المستمر. ينبغي أن تكون فقاعات الهواء الناشئة صف واحد فقط، وهو دلالة من الضغط الأمثل / حجم الفوهة. يرجى الاطلاع على الفيديو لمظاهرة من هذا المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الزجاج الشعرية مع الحل حقن بدون محاصرة فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق ضغط لإزالة الهواء بين غيض من الزجاج الشعرية والحل حقن المحملة. </li></ol> 3. خدر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من التخدير (0.1٪ MESAB - إيثيلM-أمينوبنزوات methanesulphonate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العدد المطلوب من الأسماك من دباباتهم في أقفاص الماوس البلاستيك أو حاوية النقل الأخرى مع كمية كافية من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل تخدير في مربع صغير من البلاستيك عن طريق خلط 200 مل من الماء الأسماك مع 5 مل من التخدير الأسهم الحل. تركيز النهائي من التخدير: 0.0025٪ (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصف ملء طبق بتري البلاستيكية التي تحتوي على مواد التخدير. استخدام هذا الطبق لحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأسماك في التخدير حتى يهزم الأسماك. </li></ol> 4. شق وحقن مكروي Cerebroventricular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأسماك من مربع باستخدام صافي الأسماك ووضعه في طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد بلطف السمك مع ملقط وتوجيه الرأس في هذه الطريقة أنه يميل إلى الأسفل قليلا. وسوف يسهل هذا الشق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء فتحة صغيرة في الجمجمة باستخدام إبرة قياس 30 الشائكة نهاية. استخدام سوى غيض من الإبرة لا تخترق وأكثر منبما فيه الكفاية في الدماغ وهذا سوف يسبب الضرر لأنسجة المخ وسوف تظهر كما النزيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على عقد الأسماك وإدراج غيض من الزجاج الشعرية من خلال موقع شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه غيض من الزجاج الشعرية نحو الدماغ الانتهائي. تجنب لمس أنسجة المخ وهذا يخلق تلف الأنسجة ويمنع أيضا تشتت من الحل حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الحل. السائل يشتت فورا بعد الحقن. </li></ol> 5. استرداد وتحليل حقن دقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأسماك من الإعداد حقن ومكان في علبة بلاستيكية مع أسماك المياه العذبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح باستعادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تخدير السمك مع 0.0025٪ MESAB لفترة وجيزة والتحقق من الأسماك تحت المجهر مضان. A تشتت شامل من مضان أحمر وهذا مؤشر على توزيع واسع النطاق من السائل المحقون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأسماك مرة أخرى إلى مربع من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط مربع من البلاستيك إلى Tانه نظام التداول إلى الأوكسجين في الأسماك والمحافظة لفترات أطول من الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأسماك للأغراض المرجوة مثل التحليلات السلوكية أو تضحية الحيوانات في نقطة الوقت المطلوب بعد الحقن لإعداد عينات الأنسجة لإجراء المزيد من التحليلات (stainings النسيجي، المناعية، الخ). المراجع التالية إعطاء أمثلة عن كيفية تحليل الدماغ الزرد الكبار: 9،11،17-20،24-27. وكان أسرع الوقت للاطلاع على ضربة قاضية كفاءة (أكثر من 50٪ ضربة قاضية) 12 ساعة في دراساتنا 22. </li></ol> 6. الضوابط العلمية واقترح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدم تطابق morpholino الجزيء الذي لا يفترض أن يسبب أي النمط الظاهري كعنصر تحكم سلبية. استخدام إما جزيء morpholino القياسية أو على وجه التحديد تصميم الضوابط morpholino عن كل الجينات في المصالح. بالإضافة إلى ذلك، استخدام المذيبات (في هذه الحالة PBS) كعنصر تحكم سلبي آخر لتقييم آثار غير محددة أو سمية mismATCH / السيطرة على حقن morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وصف PCNA morpholinos سابقا 22 والضوابط الإيجابية. هذا يسبب ضربة قاضية morpholino فعالة في الدماغ الزرد الكبار (75-95٪ كفاءة ضربة قاضية في حدود 1 يوم من الحقن) 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأسلوب وصفنا هنا يسمح إدارة سهلة وسريعة من morpholinos في الزرد الدماغ الكبار. لقد أثبتنا أن طريقة الحقن لدينا يمنع التعبير الجيني بكفاءة في الخلايا البطين والنتائج في عواقب وظيفية في الخلايا العصبية استجابة. هناك نقطة هامة أن يكون حذرا حول أثناء تنفيذ حقن مكروي cerebroventricular. على سبيل المثال، تأثير الجزيئات morpholino يعتمد على التركيز المستخدم. هذا التركيز يجب أن يحدده المستخدم النهائي. نوصي بدءا من محلول المخزون (500 ميكرون) وإجراء التخفيفات المتسلسلة، ومثالي لمرحلة ما قبل الاختبار عن طريق الحقن في الأجنة باستخدام معيار حقن الجنين بروتوكولات 28-30. سابقا، حصلنا على مستويات مختلفة من الكفاءة ضربة قاضية مع تركيزات morpholinos تتراوح من 50 ميكرون إلى 500 ميكرون 22. الثانية، وفتحة من الزجاج الشعرية لا ينبغي أن تأوسوف البريد لأن هذا يؤدي إلى تدفق السائل واسعة في الدماغ بعد الحقن. وبالمثل، يجب فتح لا تكون ضيقة جدا حيث سيؤدي ذلك إلى منع حقن كافية. يمكن للمرء تحديد الأمثل مزيج فوهة الضغط عن طريق ضخ الهواء في طبق بيتري مع الماء. ينبغي أن تكون الفقاعات الناشئة في صف واحد ولكن ليس في صفوف متعددة. علينا أن نظهر هذا في شريط الفيديو. ثالثا، يحتضنها الأسماك في التخدير أمر بالغ الأهمية. لا ينبغي أن تبقى السمكة أطول من 2 دقيقة في التخدير. وهذا يعيق معدل الاسترداد بعد الحقن. الرابعة، وموقع من شق هو أمر حاسم لتفريق بدقة السائل المحقون. منطقة البطين خلال السقف البصري أكبر فوق خط الوسط ويحصل أضيق أفقيا. ولذلك، ينبغي أن المجرب توليد فتحة في الجمجمة لإغلاق خط الوسط والذيلية لمجرد لوحة جمجمة تغطي منطقة الدماغ الانتهائي. واحدة من المزايا التي تتمتع بها مباشرة صب cerebroventricularن طريقة (CVMI) هو rapidness لها. CVMI هو وسيلة سريعة لمعايرة وظيفة الجين. هذه الميزة مهمة ومفيدة بالمقارنة مع جيل من خطوط المعدلة وراثيا للدراسات الفنية، والتي تأخذ عادة عدة أشهر. بالإضافة إلى ذلك، CVMI يؤدي إلى توزيع موحد للسائل المحقون وبالتالي يوفر التلاعب شامل نسبيا من النشاط الجيني، بالمقارنة مع الحقن تنسيق أو electroporation. مع CVMI، يمكن طرقت جينات متعددة في وقت واحد أسفل من خلال إعداد الحقن التي تحتوي على خليط morpholinos متعددة قليل النوكليوتيد. CVMI يمكن استخدامها لحقن تركيزات مختلفة من إعطاء أليغنوكليوتيد] morpholino، وبالتالي يمكن استخدامها لتحليل الظواهر hypomorphic. وأخيرا، هذا النموذج الحقن لا يسبب سمية أو تعرض للخطر بقاء هذه الحيوانات. يمكن توسيع نطاق هذه التقنية CVMI لنوع آخر من الدراسات مثل حقن من الببتيدات تغييري، والمخدرات، DNA البلازميد أو تغييري RNA موlecules أو غيرها من المواد التي قد تؤثر على علم وظائف الأعضاء من الخلايا. يعاير مزيج من جزيئات وإجراء تحليلات الاستجابة للجرعة ممكنة باستخدام طريقة لدينا، مما يسمح بدراسة الظواهر hypomorphic. مع هذه الخصائص، CVMI يبرهن على أن تكون مقايسة سريعة وسهلة للدراسات التعبير في الزرد الدماغ الكبار، ويفتح الفحص السريع والتحليلات الفنية. الزرد الدماغ الكبار يمكن ان تنتج خلايا عصبية جديدة جوهري على طول محور rostrocaudal كله، وأنه يمكن أيضا تجديد بعد الإصابات. هذا هو في تناقض صارخ مع أدمغة الثدييات مع تكوين الخلايا العصبية محدودة وعلى كل حال، بدلا من الفقراء قدرة التجدد. هذا على نطاق واسع نشاط الخلايا الجذعية وقدرتها الاستجمام يجعل الزرد كائن نموذج مفيد لفهم البرامج الجزيئية اللازمة لتجديد الجهاز العصبي المركزي، والتي هي غير معروفة إلى حد كبير حاليا. ولذلك، والتحقيق في الأساس الجزيئي للالموهبه التجدد زيbrafish الدماغ هو عالم مثير للاهتمام من البحوث التي قد تفسر الفرق الأساسي كيفية رد فعل الأسماك والثدييات العقول بعد الإصابة، وأيضا منح سبل العلاجات الطبية التجدد في البشر. من أجل فهم البنية التحتية الجزيئية من الفقاريات اللدونة الدماغ وتجديد، والخلايا الدبقية بمثابة منطقة بحثية هامة لأنها هي الأسلاف العصبية 3،8،20. وهكذا، وذلك باستخدام تقنية CVMI لتغيير وظيفة الجين في الخلايا الدبقية شعاعي من الدماغ الزرد هو دور فعال في توضيح كيف يمكن لنشاط السلف الزوجين لكفاءة الخلايا العصبية الكبار واستجابة التجدد الدماغ الأسماك. لقد أظهرنا مؤخرا تورط وشرط من عدة عوامل ومسارات الإشارات في استجابة الخلايا العصبية على التجدد من الدماغ الزرد الكبار 24،26،27، وقدمت هذه الدراسات ممكن عن طريق استخدام أسلوب CVMI. وعموما، فإن المعرفة التي نكتسبها من الزرد الدماغ يمكن تسخيرها لفرض regeneالقدرة rative إلى الخلايا الدبقية الثدييات التي تتفاعل إلى وقوع إصابات وبالتالي سوف تساعد على تصميم علاجات سريرية لعلاج الاضطرابات العصبية البشرية والإصابات الحادة.

تكوين الخلايا العصبية الكبار هو سمة مشتركة بين الفقاريات، لكن درجته من انتشار وكفاءة يختلف مع نسالة 1،2،3،4،5،6. على سبيل المثال، أدمغة الثدييات الكبار تحتوي على مناطق الخلايا الجذعية محدود إلى حد كبير إلى الدماغ الأمامي 7،8، في حين أن الزرد مكتملة العظام يحتوي على ستة عشر مختلف المجالات الخلايا الجذعية العصبية المرتبطة بها ومناطق في الدماغ بكامله 4،5،9،10. هذا الاختلاف بين الثدييات والزرد قد تعكس وجود تفاوت في آليات صيانة الخلايا الجذعية والقدرة العصبية من الخلايا الاصلية. يمكن أن اختصاص مدى الحياة من الزرد لإنتاج الخلايا العصبية في الدماغ تشكل أيضا تشعبات السريرية والآليات الجزيئية التي تستخدمها الزرد الدماغ يمكن تسخيرها للتطبيقات العلاجية لمعالجة الاضطرابات العصبية لدى البشر. وقد تم تحليل العديد من الخلايا الجذعية مناطق من الدماغ الزرد الكبار، ولقد ثبت أنالخلايا المبطنة للسطح البطين من تلك المناطق بمثابة الخلايا الاصلية 9،11-20. تحليلات مفصلة في الدماغ الانتهائي الزرد، على سبيل المثال، حدد الخلايا الدبقية شعاعي، التي تحدد السطح البطيني من هذه المنطقة في الدماغ لتكون الأسلاف العصبية 19 و 20. هذا ينطبق على المناطق الأخرى مثل المخيخ والسقف البصري، حيث ventricularly، وتقع خلايا عصبية ظهارية توفير المدخلات العصبية 16،21. وتحقيقا لهذه الغاية، فهم الآليات الجزيئية التي تنظم الكفاءة العصبية انتشارا في البالغين الزرد الدماغ يتطلب التلاعب في التعبير الجيني في الخلايا الاصلية. وقد وصفت وسائل مختلفة من قبل لتحوير وظيفة الجين في الزرد. وتشمل هذه الجيل من خطوط المعدلة وراثيا المشروطة التعبير عن المتغيرات المطلوبة من البروتين الحقن تنسيق وحيد، القائم على البلازميد بالإضافة إلى electroporation أو الكيميائية العلاجات. نحن سابقا بتصميمطريقة لإدارة المواد المختلفة بما في ذلك [أليغنوكليوتيد أو morpholino البروتينات في الدماغ الزرد الكبار باستخدام حقن مكروي cerebroventricular كوسيلة سريعة وفعالة من تحوير وظيفة الجين في خلايا البطين من الدماغ المقدم الزرد الكبار 22. في دراساتنا، واستخدمت morpholinos الجسم الحي بسبب الكيمياء التي تنطوي على جزيء morpholino مرتبطة تساهميا إلى أرجينين الببتيدات تسليم الغنية، والتي تتيح تسليم كفاءة لخلايا الفائدة دون الحاجة إلى permeabilization إضافية مثل electroporation 23. وهذا من شأنه السماح لاستهداف شامل للنسيج المطلوب بعد الحقن، تماما مثل ما لاحظنا في الزرد الكبار الدماغ الانتهائي 22. استخدام morpholinos فيفو بالتالي فهي متفوقة على الأساليب القائمة بالفعل من الأنسجة استهداف مثل electroporation أو حقن التنسيق من جزيئات الحمض النووي. هنا، علينا أن نظهر بصريا كيف يمكننا تنفيذ هذه العملية وتوفيربروتوكول خطوة بخطوة. نبدأ مع شرح إعداد خليط حقن والأسماك ليتم حقنه، والمضي قدما من خلال إظهار كيف يتم تعيين جهاز حقن ما يصل. ونحن نقدم وصفا للطريقة حقن cerebroventricular، الذي ينطوي على توليد شق في الجمجمة وحقن morpholinos باستخدام microinjector. نحن أيضا تفاصيل عن النقاط الحرجة يحتاج المرء أن يكون حذرا في أثناء إجراء كله بالقول بأنها الأمثل أو أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

مطلوب التلاعب في التعبير الجيني في الأنسجة لإجراء دراسات وظيفية. في هذه الورقة، ونحن لشرح حقن مكروي cerebroventricular (CVMI) تقنية كوسيلة لتعديل التعبير الجيني في الزرد الدماغ الكبار. باستخدام CVMI، يمكن أن تدار المواد في السائل cerebroventricular ويتم توزيعها بدقة على طول محور rostrocaudal من الدماغ. ونحن نركز بشكل خاص على استخدام العقاقير morpholino أليغنوكليوتيد]، التي هي أدوات قوية لاسقاط التعبير الجيني في الجسم الحي. في أسلوبنا، عند تطبيقها، وتتخذ الجزيئات morpholino من قبل الخلايا المبطنة للسطح البطين. وتشمل هذه الخلايا الخلايا الدبقية شعاعي، التي تعمل بمثابة الأسلاف العصبية. ولذلك، هدمت التعبير الجيني في الخلايا الدبقية شعاعي أمر في غاية الأهمية لتحليل استجابة الخلايا العصبية على نطاق واسع في الزرد، وأيضا من شأنه أن يوفر نظرة ثاقبة كيف يمكن الحفاظ على الفقاريات نوروجين الكباراستجابة ESIS. ان مثل هذا الفهم يساعد أيضا الجهود المبذولة من أجل التطبيقات السريرية في اضطرابات الاعصاب الإنسان ووسط تجديد الجهاز العصبي. وبالتالي، فإننا نقدم طريقة حقن مكروي cerebroventricular كوسيلة سريعة وفعالة لتغيير التعبير الجيني واستجابة الخلايا العصبية في الدماغ المقدم الزرد الكبار. كما نقدم نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها وغيرها من المعلومات المفيدة حول كيفية تنفيذ الإجراء CVMI.

حقن مكروي Cerebroventricular يؤدي إلى توزيع على نطاق واسع من الحل حقن باستخدام نظام سير العمل والتقنية للحقن مكروي cerebroventricular مبين في الشكل 1، ونحن تدار أليغنوكليوتيد] morpholino في الزرد الدماغ الكبار. بروتوكول حقن دقيقة يؤدي إلى تشتت السائل تحقن في جميع أنحاء الدماغ وكفاءة استهداف الخلايا القريبة من السطح البطيني (الشكل 2A). سوف الحقن حيث الزجاج الشعرية يخوزق أنسجة المخ لديهم إشارة الفلورسنت كثيفة عند نقطة الحقن (الشكل 2B). إذا كان المبلغ حقن ليست كافية، وسيراعى في إشارة الفلورسنت ضعيفة (الشكل 2C). حقن مكروي Cerebroventricular يمكن استخدامها لاسقاط التعبير الجيني في منطقة البطين من الدماغ الزرد الكبار لقد أظهرنا الفي morpholinos الجسم الحي يمكن ان تخترق بعض أقطار الخلية داخل السطح البطيني، وبالتالي يمكن أن تستهدف بكفاءة الخلايا البطين (أرقام 3A، 3B). Morpholino حقن ضربة قاضية يمكن التعبير الجيني لأنها سوف تخفف من إنتاج البروتين المقابلة (على سبيل المثال هو PCNA كما هو موضح في الشكلين 3C، 3D). لقد أثبتنا سابقا أن هدمت الجينات باستخدام هذه التقنية يؤدي إلى عواقب وظيفية خلال تكوين الخلايا العصبية الكبار (أرقام 3E، 3F) أو استجابة التجدد (أرقام الجيل الثالث 3G، 3H). أثبتنا أن مجموعة ضربة قاضية كفاءة (أكثر من 50٪ ضربة قاضية) ويتحقق ما يقرب من 12 ساعة بعد الحقن من morpholinos 22. لاحظنا أيضا أن الفترة ضربة قاضية كفاءة هو حتى بعد ما يقرب من 5 أيام لحقن البروتين PCNA 22. واعتبر أكثر من 70٪ ضربة قاضية حتى 3 أيام بعد الحقن 22. منحنيات ضربة قاضية هي O تعتمدن مستوى التعبير عن البروتينات الذاتية وكفاءة جزيئات morpholino، ويجب أن تحدد لكل جينة من قبل المجرب. في دراستنا، لم نكن نرى أن الإجراء CVMI يهدد بقاء الحيوان، ربما لأن الإدارة من الجزيئات morpholino هو محلي ولا يسبب سمية جهازية. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> الشكل 1. التمثيل التخطيطي للتقنية الحقن cerebroventricular. (A) يتم تنفيذ الحقن من الظهري من الزرد الكبار (1) على مستوى السقف البصري (OT، 2). يتم إجراء شق خلال البصرية لوحة الجمجمة سقفي مع إبرة عيار 30 (3). استخدام الزجاج الشعيرات الدموية، ويتم حقن جزيئات morpholino في السائل البطين (4). A تشتت شامل هوchieved على الفور (5). (B) ويرد قنية ولها نهاية الشائكة في تضخم عالية. (C) التوجه من الإبرة قبل شق. (D) وحلقت شق والتي حددها الخطوط المتقطعة. (E) يقع حقن الشعرية كما هو مبين ويتم تنفيذ الحقن. تم تكييف جميع لوحات من المرجع 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> الشكل 2. مقارنة بين كفاءة الحقن ودقة. (A) يؤدي A حقن جيدة لاستهداف الخلايا القريبة من السطح البطيني. (ب) إذا تم إدراج الزجاج الشعرية إلى أنسجة المخ، وهذا سوف تولد إشارة مضان في موقع مركزي. (C </sترونج&gt;) إذا كانت كمية حقن منخفضة، وهذا سوف يؤدي إلى إشارة مضان أضعف. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> الشكل (3). . Morpholino الاختراق، وكفاءة knockdowns الجينات والعواقب الوظيفية (A) GFP المناعية على المقاطع العرضية الدماغ الانتهائي من السيطرة morpholino حقن تيراغرام (H2A: GFP) خط المعدلة وراثيا تبين نوى GFP إيجابية. (B) GFP المناعية على المقاطع العرضية الدماغ الانتهائي من GFP العقاقير morpholino حقن تيراغرام (H2A: GFP) خط المعدلة وراثيا تبين نوى GFP إيجابية. لاحظ الفرق في إشارة GFP في منطقة البطين. الخامس: البطين. (C) PCNA المناعية على السيطرة morpholino حقن العقول تبين التوزيع الواسع النطاق للخلايا إيجابية PCNA. ( <strong&gt; D) PCNA المناعية على بكنا العقاقير العقول morpholino حقن تبين انخفاض كبير كميات من إيجابية الخلايا PCNA، وتبين أن CVMI يمكن ضربة قاضية الجينات الذاتية. (E) BrdU وHUC / D المناعية على السيطرة morpholino حقن العقول لتحديد الخلايا العصبية الوليد بعد BrdU نبض مطاردة تجربة وصفها قبل 22. (F) BrdU وHUC / D المناعية على بكنا العقاقير العقول morpholino حقن لتحديد الخلايا العصبية الوليد بعد BrdU نبض مطاردة تجربة وصفها قبل 22. (G) يطرق إلى أسفل PCNA يؤدي إلى انخفاض كبير في جيل من الخلايا العصبية حديثي الولادة، مشيرا إلى أن CVMI يمكن استخدامها لضربة قاضية الجينات الذاتية، التي تؤدي إلى عواقب وظيفية. تم تكييف جميع لوحات من المرجع 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ الكبار.

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Views.  Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden. في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ ال...

Video: Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

تحليل التغييرات التعبير الجيني في الفئران الحصين بعد ديب تحفيز الدماغ الأمامي من مهادي نواة

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

في فيفو رصد للتعبير الجيني الإيقاعية على مدار الساعة في نواة Suprachiasmatic الماوس استخدام الصحفيين الأسفار

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

تقييم الحث علي الاكتئاب علي المدى الطويل في شرائح البالغين المخيخار

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...