Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) ve Avrupa Birliği (ZF-Sağlık) tarafından desteklenmiştir.

1. Enjeksiyon Karışım hazırlanması <ol><li> Hücreleri daha etkin, normal morfolino molekülleri daha onları içselleştirmek gibi in vivo morpholinos kullanın. Ayrıntılar için üreticinin bilgi (: Reaktifler ve Malzeme Tablo 1) Bkz. </li><li> Enjeksiyon doğruluğu görselleştirmek için bir floresan boya izleme (örneğin CellTracker Kırmızı CMTPX, Invitrogen) kullanın. Bu boya, hücre metabolize olur ve yalnızca alımından sonra hücre içinde floresan olur. Bu nedenle, bu adım, verimli bir şekilde cerebroventricular mikroenjeksiyon tarafından hedeflenen hücrelerin belirlenmesi için çok önemlidir. </li><li> Hazırlama fosfat-tamponlu salin (PBS) (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) ile seyreltilmesi için morfolino. Morfolino çözeltinin bir seyreltme gerekli ise, her PBS kullanın. </li><li> Morfolino çözeltisi 9 ul ve th 1 ul ekleyerek enjeksiyon karışımı 10 ul hazırlanmasıE hücre izci boya (seyreltilmiş veya sulandırılmamış morfolino çözüm stok konsantrasyonu 500 mcM olan 22 morfolino birkaç farklı dozlarda göstermektedir Daha önceki sonuçları -.. 50 mcM 500 mcM kadar - etkin gelen demonte farklı düzeylerde sonuç hypomorphic fenotipleri için demonte). Çözeltinin 1 ul bir zebrabalıkları beyin içine enjeksiyon için yeterlidir. </li><li> İyice karıştırın ve enjeksiyon kadar oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> 2. Enjeksiyon Aparatı hazırlanması <ol><li> Bir iğne çektirmenin kullanarak cam enjeksiyon kılcal hazırlayın. Isıtma döngüsü Değeri: 463, döngü değeri çekme: 230, hız: 1.5 sn, saat: 75 msn aşağıdaki parametreleri kullanın. </li><li> Basınç kaynağı açın ve 50 psi veya 3,5 bar basınç ayarları yapın. </li><li> Aşağıdaki gibi mikroenjektör ayarlarını: basıncı 20 psi, çıkarma basıncı 10 psi, yolluk 2.5 ve 100 msn aralık döneminde değer tutun. </li><li> Çevirmekhalka aydınlatıcı ve mikroskop sahne üzerinde halka bulun. </li><li> Mikroskop yanında uygun bir konuma kılcal tutucu yerleştirin. </li><li> Tutucu içine kılcal cam yerleştirin. 45 derece için enjeksiyon açısını ayarlayın. </li><li> Ince uç forseps kullanarak kılcal cam ucu koparmak ve orifis gelen basınç çıkışı kalibre. Bu balık suyu içine iğne ucu çeker ve sürekli bir basınç darbesi verilerek test edilmelidir. Ortaya çıkan hava kabarcıkları optimum basınç / delik boyutlu bir göstergesidir sadece bir satır, olmalıdır. Bu kalibrasyon gösterilmesi için video bakın. </li><li> Hava kabarcıkları yakalama olmadan enjeksiyon çözüm kılcal cam yükleyin. </li><li> Kılcal cam ve yüklü enjeksiyon çözüm ucu arasındaki hava kaldırmak için basınç uygulayın. </li></ol> 3. Anestezi <ol><li> Etil-- anestezik stok solüsyonu (% 0.1 MESAB hazırlayınm-aminobenzoat metansülfonat). </li><li> Su yeterli miktarda plastik fare kafesleri veya diğer taşıma kabı içine tanklarından balık istediğiniz numarayı çıkarın. </li><li> Anestezik stok çözeltisi, 5 ml balık 200 ml su içinde karıştırılarak küçük bir plastik kutu içinde anestezi çözeltisi hazırlayın. Anestezik nihai konsantrasyon: 0.0025% (v / v). </li><li> Anestezik bir plastik Petri kabı Yarım doldurun. Enjeksiyonlar için bu çanak kullanın. </li><li> Balık Subdues kadar anestetik balık inkübe edin. </li></ol> 4. Kesi ve Cerebroventricular Mikroenjeksiyon <ol><li> Bir balık net kullanarak kutusundan balık çıkarın ve Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> Yavaşça biraz aşağı tenteli bir şekilde forseps ve yönlendirmek kafa ile balık tutun. Bu kesi kolaylaştıracaktır. </li><li> 30 göstergesi dikenli sonu iğne kullanılarak kafatası küçük bir yarık oluşturun. Iğne sadece uç kullanımı ve daha fazla nüfuz etmezyeterince bu gibi beyin içine beyin dokusunda hasara neden ve kanama olarak tezahür edecek olacaktır. </li><li> Balık tutma tutmak ve camın ucu kesi sitesi üzerinden kılcal yerleştirin. </li><li> Orient cam ucu telencephalon doğru kılcal. Bu doku hasarı oluşturur ve aynı zamanda enjekte çözeltisinin dispersiyon engeller gibi beyin dokusu dokunmaktan kaçının. </li><li> Çözüm enjekte edilir. Sıvı ilaç uygulandıktan hemen sonra dağılır. </li></ol> 5. Kurtarma ve Enjeksiyon Doğruluk Analizi <ol><li> Taze balık su ile bir plastik kutu içine enjeksiyon kurulum ve yerden balık çıkarın. </li><li> Kurtarma sağlar. </li><li> Kısa bir süre 0.0025% MESAB ile balık tekrar uyuşturan ve floresan mikroskop altında balık kontrol edin. Kırmızı floresans esaslı bir dağılım sıvısı enjekte yaygın dağılımının bir göstergesidir. </li><li> Plastik kutu geri balık koyun. </li><li> T plastik kutu bağlayındaha uzun süreler için oksijen balık ve korumak için o dolaşım sistemi. </li><li> Bu türden davranış analizi gibi arzu edilen amaçlar için kullanımı balık ya da daha fazla analiz (histolojik boyamalar, immünositokimya, vb) için doku örneklerinin hazırlanması için enjeksiyondan sonra istenilen zaman noktalarında, hayvanlar kurban. 9,11,17-20,24-27: Aşağıdaki referanslar yetişkin zebrafish beyin analiz nasıl örnekler vermek. (% 50&#39;den fazla demonte) etkin bir demonte gözlemlemek için en hızlı zaman bizim çalışmalarda 22, 12 saat oldu. </li></ol> 6. Önerilen Bilimsel Kontrolleri <ol><li> Bir negatif kontrol olarak herhangi bir fenotip neden gerekiyordu olmayan bir uyumsuzluk morfolino molekül kullanın. Ilgi her gen için ya bir standart morfolino molekül ya da özellikle tasarım morfolino denetimlerini kullanın. Buna ek olarak, mism arasında spesifik olmayan etkileri ya da toksisiteyi değerlendirmek üzere bir başka negatif kontrol olarak (bu durumda, PBS içinde) çözücü maddelermorfolino enjeksiyon / kontrol atch. </li><li> PCNA morpholinos pozitif kontroller daha önce 22 açıklanan kullanın. Bu morfolino yetişkin zebrafish beyin (enjeksiyon 1 gün içinde 75-95% demonte verimlilik) 22 etkili demonte neden olur. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz burada açıklamak yöntem yetişkin zebrafish beyin içine morpholinos kolay ve hızlı yönetim sağlar. Biz enjeksiyon yöntemi verimli ventriküler hücreleri ve nöron yanıt olarak fonksiyonel önemi ile sonuçlanır gen ekspresyonu bloke olduğunu göstermiştir. Cerebroventricular mikroenjeksiyon yürütülürken hakkında dikkatli olmak önemli nokta vardır. Örneğin, morfolino moleküllerin etkisi kullanılan konsantrasyona bağlıdır. Bu konsantrasyon, son kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Biz standart embriyo enjeksiyon protokolleri 28-30 kullanarak embriyo içine enjeksiyon ile ön test için ideal stok solüsyonu ile başlayan (500 mcM) ve seri dilüsyonları performans tavsiye ve. Daha önce, 50 uM ila 500 uM arasında değişen 22 konsantrasyonda morpholinos demonte verimliliği farklı seviyelerde elde edilmiştir. İkinci olarak, kılcal cam menfez larg olmamalıdırBu e enjeksiyondan sonra beyin içine kapsamlı sıvı akını yol açacaktır. Bu yeterli enjeksiyon önleyecek şekilde Benzer şekilde, açılış çok dar olmamalıdır. Bir su ile bir Petri kabı içine hava pompalayarak en uygun orifis basınç kombinasyonu belirleyebilirsiniz. Ortaya çıkan kabarcıklar ancak birden çok satır tek bir satır olmalıdır. Bu video bu göstermektedir. Üçüncü olarak, anestetik balık kuluçka kritiktir. Balık anestetik 2 dakika daha uzun bir süre tutulması gerekir. Bu enjeksiyondan sonra iyileşme oranı engel olacaktır. Dördüncü olarak, kesi yerini iyice enjekte sıvı dağıtma için önemlidir. Optik tectum üzerinde ventriküler bölge orta hat üzerinde büyük ve yanal dar alır. Bu nedenle, deneyci orta hatta kafatası yakın yarık oluşturmak gerekir ve telencephalic bölgeyi kapsayan kafatası plaka sadece kaudal. Cerebroventricular injectio avantajlarından biri,n (CVMI) yöntemi, sürat olduğunu. CVMI gen fonksiyonu tahlil için hızlı bir yöntemdir. Genellikle birkaç ay sürebilir fonksiyonel çalışmalar için, transjenik nesil ile karşılaştırıldığında bu özellik önemlidir ve yararlıdır. Buna ek olarak, CVMI enjekte sıvının homojen dağılımına yol açar ve bu nedenle fokal enjeksiyon ya da elektroporasyon ile karşılaştırıldığında gen aktivitesinin nispeten daha ayrıntılı bir düzenleme sağlar. CVMI ile, birden fazla gen enjeksiyon hazırlama birden morpholinos oligonükleotid içeren karışımları aynı anda nakavt olabilir. CVMI belirli bir morfolino oligonükleotid farklı konsantrasyonda enjekte etmek ve bu nedenle hypomorphic fenotipleri analiz etmek için de kullanılabilir kullanılabilir. Son olarak, bu enjeksiyon paradigma toksisite neden ya da hayvanların hayatta kalma ödün vermez. CVMI teknik, düzenleyici peptidler, uyuşturucu, plazmid DNA veya RNA düzenleyici mo enjeksiyon gibi çalışmaların diğer tip için genişletilmiş olabilirhücre fizyolojisi etkileyebilecek lecules ya da diğer maddeler. Moleküllerin kombinasyonu Assaying ve doz cevap analizleri yapmak mümkün hypomorphic fenotipleri eğitim sağlayan, bizim yöntem kullanıyor. Bu özellikleri ile, CVMI yetişkin zebrafish beyinde ifade çalışmalar için hızlı ve kolay bir test olduğunu kanıtlıyor, ve hızlı tarama ve fonksiyonel analiz açılır. Yetişkin Zebra balığı Beyin yapısal olarak tüm rostro ekseni boyunca yeni nöronlar üretebilir ve aynı zamanda travmatik yaralanmalar sonra yeniden oluşturabilirsiniz. Bu sınırlı nöron ve hiç değilse, oldukça kötü rejeneratif kapasiteli memeli beyinlerine tezat olduğunu. Bu yaygın kök hücre aktivitesi ve iyileşme yeteneği şu anda büyük ölçüde bilinmemektedir merkezi sinir sistemi rejenerasyon için gerekli olan moleküler programları, anlamak için yararlı bir model organizma Zebra balığı yapar. Bu nedenle, ze olan rejeneratif yetenek moleküler temeli soruşturmabrafish beyin balık ve memeli beyin bir yaralanma sonrası tepki, hem de insanlarda rejeneratif tıp tedavileri için yollar bağışlamak nasıl temel bir fark açıklayabilir araştırma ilginç bir alemdir. Onlar nörojenik ataları 3,8,20 gibi omurgalı beyin plastisite ve yenilenme moleküler altyapı anlamak için, glial hücreler önemli bir araştırma alanı olarak hizmet vermektedir. Böylece, Zebra balığı beynin radyal glial hücrelerde gen fonksiyonu değiştirmek için CVMI tekniği kullanarak açıklık vesile ne kadar balık beyin verimli yetişkin nöron ve rejeneratif yanıt çift progenitör aktivite yapabilirsiniz. Biz son zamanlarda yetişkin zebrafish beyin 24,26,27 ve rejeneratif nöron yanıt olarak çeşitli faktörler ve sinyal yolları katılımı ve ihtiyaç göstermiştir ve bu çalışmaların CVMI yöntemi kullanılarak mümkün yapılmıştır. Genel olarak, biz Zebra balığı beyin kazanç bilgi regene dayatmaya harnessed olabiliryaralanma tepki ve dolayısıyla insan nörolojik bozukluklar ve akut yaralanmalar için klinik tedavi tasarımı yardımcı olacaktır memeli glial hücreler için rative yeteneği.

Yetişkin nöron omurgalı için ortak bir özelliktir, ancak sıklığı ve verimlilik derecesi filogeni 1,2,3,4,5,6 göre değişir. Teleost Zebra balığı, tüm beyin 4,5,9,10 on altı farklı kök hücre etki ve ilişkili nörojenik bölümü içeren iken Örneğin, yetişkin memeli beyin büyük ölçüde ön beyin 7,8, sınırlı kök hücre bölgeleri içerir. Memeliler ve Zebra balığı arasındaki bu farklılık kök hücre bakım ve progenitör hücrelerin nörojenik kapasitesinin mekanizmalarında bir eşitsizlik yansıtıyor olabilir. Zebra balığı beyin tarafından kullanılan moleküler mekanizmaları insanlarda nörodejeneratif hastalıkların üstesinden gelmek için tedavi uygulamaları için harnessed olabilir gibi beyindeki nöronlar üretmek için Zebra balığı yaşam boyu yetki de klinik etkileri oluşturabilir. Yetişkin Zebra beynin birçok kök hücreleri bölgeleri analiz edilmiş ve gösterilmiş olduğuBu bölgelerin ventriküler yüzeyi astar hücreleri progenitör hücrelerin 9,11-20 olarak hizmet vermektedir. Zebrabalıkları telencephalon Detaylı analizler, örneğin, nörojenik ataları 19, 20 olması için bu beyin bölgesi içinde, ventriküler yüzey tasvir radyal glial hücreler, tespit edilmiştir. Bu, beyincik ve nöroepitelyal hücrelerin nörojenik giriş 16,21 sağlamak ventricularly-bulunan optik tectum, diğer bölgeler için de geçerlidir. Bu amaçla, yetişkin zebrafish beyinde yaygın nörojenik yetkinlik düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak progenitör hücrelerin gen ifadesinin manipülasyonu gerektirir. Çeşitli yöntemler, daha önce zebrabalıkları modüle gen fonksiyonu için tarif edilmiştir. Bunlar, elektroporasyon veya kimyasal muamele ile birleştirilmiş tek bir protein, plazmid bazlı odak enjeksiyon arzu edilen varyantlar ifade koşullu transjenik nesil içerir. Daha önce, bir dizaynyetişkin zebrafish ön beyin 22 ventriküler hücrelerinde modüle gen fonksiyonu hızlı ve etkili bir yol olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon kullanarak yetişkin zebrafish beyin içine morfolino oligonükleotidler veya protein gibi çeşitli maddeler yönetmek için yöntem. Çalışmalarda, in vivo morpholinos çünkü kovalent gibi elektroporasyon 23 gibi ekstra permeabilization için gerek kalmadan ilgi hücreleri etkin dağıtım sağlayan zengin teslim peptidler, arginine bağlantılı morfolino molekül içeren kendi kimya kullanılmıştır. Bu enjeksiyondan sonra istenilen doku tam hedefleme, sadece biz yetişkin zebrafish telencephalon 22 gözlenen ne gibi olanak sağlayacak. In vivo morpholinos kullanımı bu yüzden, elektroporasyon veya DNA moleküllerinin odak enjeksiyon olarak hedef doku arasında zaten var olan yöntemler daha üstündür. Burada, biz bu işlemi gerçekleştirmek ve bir sağlamak nasıl görsel olarak göstermekadım adım protokolü. Biz enjeksiyon karışımı ve enjekte ve enjeksiyon cihazı kurmak nasıl göstererek devam edilecek balık hazırlanması açıklayan ile başlar. Biz mikroenjektör kullanarak morpholinos bir kafatası ve enjeksiyon bir kesi üreten içerir cerebroventricular enjeksiyon yöntemi, bir açıklama sağlar. Ayrıca kritik noktaları optimizasyonu veya sorun giderme olarak belirterek tüm prosedürü sırasında dikkatli olması gerekir, ayrıntılı.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Dokularda gen manipülasyonu fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için gereklidir. Bu yazıda, biz yetişkin zebrafish beyinde gen ekspresyon modüle için bir araç olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon (CVMI) tekniği göstermektedir. CVMI kullanarak, maddeler cerebroventricular sıvısı içine tatbik edilebilir ve iyice beyin rostro ekseni boyunca dağıtılabilir. Biz özellikle in vivo gen aşağı vurma için güçlü araçlardır antisens morfolino oligonükleotidler, kullanımı üzerine odaklanır. Bizim yöntemde, uygulandığında, morfolino molekülleri ventriküler yüzeyi kaplayan hücreler tarafından alınır. Bu hücreler, nörojenik progenitörlerin olarak hareket radyal glial hücreler bulunmaktadır. Bu nedenle, radyal glial hücreler gen ifadesinin aşağı vurma zebrafish yaygın nöron yanıt analiz etmek büyük önem taşımaktadır ve aynı zamanda omurgalı yetişkin neurogen sürdürmek nasıl fikir sağlayacakyovasküler yanıt. Böyle bir anlayış, insan nörodejeneratif hastalıklar ve merkezi sinir sisteminde rejenerasyon klinik uygulamalar için çabalarını yardımcı olacaktır. Böylece, gen ifadesi ve yetişkin zebrafish ön beyin nöron yanıt değiştirmek için hızlı ve verimli bir şekilde olarak cerebroventricular mikroenjeksiyon yöntemi mevcut. Ayrıca CVMI işlemi yürütmek için nasıl sorun giderme ipuçları ve diğer yararlı bilgiler sağlar.

Cerebroventricular mikroenjeksiyon enjekte çözüm yaygın dağıtım yol açar Şekil 1&#39;de tasvir cerebroventricular mikroenjeksiyon iş akışı ve teknik düzeni kullanarak, yetişkin zebrafish beyin içine morfolino oligonükleotidler uygulandı. Doğru bir enjeksiyon protokol ventriküler yüzey (Şekil 2A) yakın hücre hedefleme beyin ve verimli boyunca enjekte edilen sıvının dağılmasına yol açar. Kılcal cam beyin dokusu delip iğneleri, enjeksiyon noktasında (Şekil 2B) de yoğun bir floresan sinyali olacaktır. Enjeksiyon miktarı yeterli değilse, zayıf floresan sinyali (Şekil 2C) gözlenecektir. Cerebroventricular mikroenjeksiyon yetişkin zebrabalıkları beynin ventriküler bölgede gen ekspresyonu devrilmesi için kullanılabilir Biz th göstermiştirin vivo morpholinos da ventriküler iç yüzeyine bir kaç hücre çapları nüfuz edebilir ve bu nedenle etkin ventriküler hücreleri (Şekil 3A, 3B), hedef olabilir. Morfolino enjekte edilmesi, bu da protein (Şekil 3C, 3D &#39;de gösterildiği gibi bir örnek olan PCNA) üretimini azaltmak gibi portatif gen ekspresyonu olabilir. Biz daha önce bu tekniği kullanarak genleri aşağı vurma yetişkin nöron (Şekil 3E, 3F) veya rejenerasyon yanıt (Şekil 3G, 3H) sırasında fonksiyonel sonuçlara yol açtığını göstermiştir. Biz verimli demonte aralığı (% 50&#39;den fazla demonte) morpholinos 22 enjeksiyonundan sonra yaklaşık 12 saat elde edilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca verimli demonte süresi yaklaşık 5 gün PCNA protein 22 için enjeksiyon sonrasına kadar olduğu görülmektedir. % 70&#39;den fazla demonte 3 gün enjeksiyon 22 sonrasına kadar görüldü. Demonte eğrileri bağımlı o vardırn endojen proteinler ve morfolino moleküllerin verimliliği ifade seviyesini ve deneyi tarafından her gen için belirlenmelidir. Çalışmalarda, biz morfolino moleküllerin yönetimi yerel ve sistemik toksisite neden olmaz muhtemelen CVMI işlem, hayvanın hayatta kalma ödün görmedim. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Şekil 1. Cerebroventricular enjeksiyon tekniği şematik. (A), enjeksiyon optik tectum seviyesini (OT, 2), yetişkin zebra balığı (1) ait olan dorsal gerçekleştirilir. Bir kesi bir 30-gauge iğne (3) ile optik tectal kafatası plaka üzerinde yapılır. Cam kılcal kullanarak, morfolino molekülleri ventriküler sıvısı (4) içine enjekte edilir. Kapsamlı bir dispersiyonu olan bir(5) hemen chieved. (B), kanül ve dikenli uç yüksek büyütmede gösterilmiştir. (C) insizyon iğne yönlendirilmesi. (D) kesi daire ve kesik çizgilerle gösterilmiştir. (E) gösterilen ve enjeksiyonu yapılır olarak kılcal enjeksiyon yer alır. Tüm paneller ref adapte edildi. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Şekil 2. Enjeksiyon verimlilik ve doğruluk ile karşılaştırılması. (A) iyi bir enjeksiyon ventriküler yüzeyine yakın hücrelerin hedef yol açar. Kılcal cam beyin dokusu içine takılırsa (B), bu merkezi bir floresan sinyal üretecektir. (C </strong&gt;) enjeksiyon miktarı düşükse, bu zayıf floresan sinyal yol açacaktır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Şekil 3,. . GFP pozitif çekirdekler gösteren transgenik hattı: morfolino penetrasyon, gen hakemin ve fonksiyonel sonuçları verimliliği (A) GFP kontrol telencephalic kesitleri Tg (GFP H2A) morfolino-enjekte üzerinde immün. GFP pozitif çekirdekler gösteren transgenik hattı: (B) GFP Tg (GFP H2A) morfolino-enjekte GFP antisens en telencephalic kesitleri üzerinde immün. Ventriküler bölgede GFP sinyali arasındaki farkı dikkat edin. v: ventrikül. (C) PCNA kontrolü morfolino enjeksiyonlu PCNA pozitif hücrelerin yaygın dağılımını gösteren beyinleri üzerinde immün. ( <strong&gt; D) PCNA bu CVMI yapabilirsiniz demonte endojen genleri gösteren, PCNA pozitif hücrelerin önemli ölçüde azaltılmış miktarda gösteren PCNA antisens morfolino enjeksiyonlu beyinleri üzerinde immün. (E) BrdU ve HUC / D kumanda üzerindeki immün morfolino-enjekte beyinleri 22 önce açıklanan bir BrdU darbe-kovalamaca deney sonra yeni doğan nöronlar belirlemek için. (F) BrdU ve HUC / D 22 önce açıklanan bir BrdU darbe-kovalamaca deney sonra yeni doğan nöronlar belirlemek için PCNA antisens morfolino-enjekte beyinleri üzerinde immün. (G) Knocking aşağıya PCNA CVMI fonksiyonel sonuçlar doğuran demonte endojen gen için kullanılabileceğini gösteren, yeni doğan nöron üretimi önemli bir azalmaya yol açar. Tüm paneller ref adapte edildi. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Bu yazıda, morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak yetişkin zebrabalıkları telencephalon ventriküler hücrelerde gen ifadesinin manipülasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz, yetişkin omurgalı beynin fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir hızlı ve verimli protokolü olarak bu yöntem sunuyoruz.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Görüntüleme.  Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden. Bu yazıda, morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak yetişkin zebrabalıkları telencephalon ventriküler hücrelerde gen ifadesinin manipülasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz, yetişkin omurgalı beynin fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir hızlı ve verimli protokolü olarak bu yöntem sunuyoruz.

Video: Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Nörobilim

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...