Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) y la Unión Europea (Zf-Health).

1. Preparación de la mezcla Inyección <ol><li> Usa morfolinos in vivo como células ellos internalizan de manera más eficiente que las moléculas de morfolino normales. Consulte la información del fabricante para obtener más información (Tabla 1: Reactivos y materiales). </li><li> Utilice un colorante fluorescente de seguimiento (por ejemplo, CellTracker Rojo CMTPX, Invitrogen) para visualizar la exactitud de la inyección. Este colorante se metaboliza en la célula y se vuelve fluorescente sólo en la célula después de la absorción. Por lo tanto, este paso es crucial para determinar las células que están dirigidos de manera eficiente por la microinyección cerebroventricular. </li><li> Preparar salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH: 7,4) para la dilución de solución morfolino. Si se requiere una dilución de la solución de morfolino, utilice siempre PBS. </li><li> Preparar 10 l de la mezcla de inyección mediante la adición de 9 l de la solución morfolino y 1 l de the célula de seguimiento de tinte (diluido o sin diluir la concentración de reserva de la solución morfolino es 500 mM Nuestros resultados previos 22 indican que varias dosis diferentes del morfolino -.. entre 50 mM y 500 mM - dan lugar a diferentes niveles de la caída de un sistema eficiente caída de fenotipos hypomorphic). 1 l de solución es suficiente para la inyección en un cerebro de pez cebra. </li><li> Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente hasta que la inyección. </li></ol> 2. Preparación del aparato de inyección <ol><li> Preparar la inyección de capilares de vidrio con un extractor de aguja. Utilice los siguientes parámetros: valor del ciclo de calefacción: 463, tirando de valor del ciclo: 230, velocidad: 1,5 seg, tiempo: 75 ms. </li><li> Encienda la fuente de presión y ajustar los parámetros de presión de 50 psi o 3,5 bares. </li><li> Ajuste la configuración microinyector los siguientes: mantener la presión de 20 psi, la presión de expulsión de 10 psi, el valor de tiempo de 2,5 ms y 100 rango de gating. </li><li> Vueltaen el anillo de luz y localizar el anillo sobre la platina del microscopio. </li><li> Coloque el soporte capilar a una posición apropiada al lado del microscopio. </li><li> Insertar el capilar de vidrio en el soporte. Ajustar el ángulo de inyección a 45 grados. </li><li> Encaje de la punta de la capilar de vidrio usando un fórceps fino de gama y calibrar la salida de presión desde el orificio. Esta debe ser probado mediante la inmersión de la punta de la aguja en el pescado de agua y dando un impulso de presión continua. Las burbujas de aire resultantes deben ser sólo una fila, que es una indicación de la presión óptima / tamaño del orificio. Por favor, vea el video de demostración de esta calibración. </li><li> Cargue el capilar de vidrio con la solución de la inyección sin atrapar burbujas de aire. </li><li> Aplicar presión para eliminar el aire entre la punta del capilar de vidrio y la solución de inyección cargado. </li></ol> 3. Anestesia <ol><li> Preparar la solución madre de los anestésicos (0,1% MESAB - etil-m-aminobenzoato de metanosulfonato). </li><li> Retire número deseado de peces de los tanques a las jaulas de ratón de plástico u otro contenedor de transporte con suficiente cantidad de agua. </li><li> Prepare la solución de la anestesia en una pequeña caja de plástico mediante la mezcla de 200 ml de agua pescado con 5 ml de solución de anestésicos. La concentración final de la anestésicos: 0,0025% (v / v). </li><li> Media llenar un plato de plástico Petri con anestésicos. Utilice este plato para preparaciones inyectables. </li><li> Incubar los peces en los anestésicos hasta las somete peces. </li></ol> 4. Incisión y Microinyección cerebroventricular <ol><li> Retire el pescado de la caja con una red de pesca y colóquelo en la caja de Petri. </li><li> Aplique suavemente el pescado con el fórceps y orientar la cabeza de una manera que se inclina ligeramente hacia abajo. Esto facilitará la incisión. </li><li> Generar una pequeña hendidura en el cráneo con una aguja de púas de fin de calibre 30. Utilice sólo la punta de la aguja y no penetran más delo suficiente en el cerebro ya que esto puede ocasionar daños al tejido cerebral y se manifestará como sangrado. </li><li> Sigue sosteniendo el pez e inserte la punta del capilar de vidrio a través del sitio de la incisión. </li><li> Oriente la punta del capilar de vidrio hacia el telencéfalo. Evitar tocar el tejido cerebral ya que esto crea daños en los tejidos y también impide la dispersión de la solución inyectada. </li><li> Inyectar la solución. El líquido se dispersa inmediatamente después de la inyección. </li></ol> 5. Recuperación y análisis de la precisión de inyección <ol><li> Retire el pescado de la configuración de la inyección y el lugar en una caja de plástico con peces de agua dulce. </li><li> Permitir la recuperación. </li><li> Vuelva a anestesiar a los peces con el 0,0025% MESAB brevemente y comprobar el pez bajo el microscopio de fluorescencia. Una dispersión a fondo de la fluorescencia roja es una indicación de la amplia distribución del líquido inyectado. </li><li> Ponga el pescado de nuevo a la caja de plástico. </li><li> Conecte la caja de plástico para tque el sistema de circulación para oxigenar el pescado y mantener durante períodos de tiempo más largos. </li><li> Utilice el pescado para los propósitos deseados, tales como los análisis de comportamiento o sacrificar los animales en puntos de tiempo deseados después de la inyección para preparar muestras de tejido para análisis posteriores (tinciones histológicas, inmunohistoquímica, etc). Las siguientes referencias proporcionan ejemplos de cómo analizar el cerebro de pez cebra adulto: 9,11,17-20,24-27. El tiempo más rápido para observar una caída eficiente (más de 50% desmontables) era 12 horas en nuestros estudios 22. </li></ol> 6. Controles científicos sugeridos <ol><li> Utilice un morfolino molécula de falta de coincidencia que no se supone para causar cualquier fenotipo como un control negativo. Utilice una molécula de morfolino estándar o diseño específicamente controles morfolino para cada gen de interés. Además, utilizar el disolvente (en este caso PBS) como un control negativo adicional para evaluar los efectos no específicos o de toxicidad de la mismatch / controlar morpholino inyecciones. </li><li> Utilizar PCNA morfolinos descrito previamente 22 como controles positivos. Este morfolino causa caída eficiente en el cerebro del pez cebra adulto (75-95% de eficiencia caída dentro de 1 día de la inyección) 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método se describe aquí permite la administración fácil y rápida de morfolinos en el cerebro del pez cebra adulto. Hemos demostrado que nuestro método de inyección bloquea eficientemente la expresión génica en las células ventriculares y resultados en consecuencias funcionales en la respuesta de la neurogénesis. Hay puntos importantes para ser cautelosos acerca al ejecutar la microinyección cerebroventricular. Por ejemplo, el efecto de las moléculas de morfolino depende de la concentración utilizada. Esta concentración tiene que ser determinada por el usuario final. Se recomienda a partir de la solución madre (500 M) y la realización de diluciones en serie, y lo ideal sería que antes de la prueba por inyección en embriones utilizando protocolos estándar embrión inyección 28-30. Anteriormente, se obtuvieron diferentes niveles de eficiencia de caída con concentraciones de morfolinos que van desde 50 mM a 500 mM 22. En segundo lugar, el orificio del capilar de vidrio no debe ser large ya que esto dará lugar a una amplia afluencia de líquido en el cerebro después de la inyección. Del mismo modo, la abertura no debe ser demasiado estrecha ya que esto evitará inyección adecuada. Se puede determinar la combinación óptima orificio de presión por bombeo de aire en una placa de Petri con agua. Las burbujas de derivados deben estar en una sola fila, pero no en múltiples filas. Se demuestra esto en el video. En tercer lugar, la incubación de los peces en los anestésicos es crítico. El pescado no debe tener más de 2 min de los anestésicos. Esto obstaculizará la tasa de recuperación después de la inyección. En cuarto lugar, la localización de la incisión es crítico para dispersar a fondo el líquido inyectado. La región ventricular en el techo óptico es más grande por encima de la línea media y se estrecha lateralmente. Por lo tanto, el experimentador debe generar la hendidura en el cráneo cerca de la línea media y justo caudal a la placa de cráneo que cubre la región telencefálica. Una de las ventajas de la Inyección de cerebroventricularn método (CVMI) es su Rapidness. CVMI es un método rápido para analizar la función de genes. Esta característica es importante y útil en comparación con la generación de líneas transgénicas para estudios funcionales, que generalmente toman varios meses. Además, CVMI conduce a una distribución uniforme del líquido inyectado y por lo tanto proporciona una manipulación relativamente exhaustivo de la actividad del gen, cuando se compara con las inyecciones de coordinación o de electroporación. Con CVMI, múltiples genes pueden ser derribados simultáneamente prepara la inyección de mezcla que contiene múltiples morfolinos oligonucleótido. CVMI se puede utilizar para inyectar diferentes concentraciones de un determinado oligonucleótidos de morfolino, y por lo tanto se puede utilizar para el análisis de fenotipos hypomorphic. Por último, este paradigma inyección no causa toxicidad o comprometer la supervivencia de los animales. La técnica CVMI podría ampliarse a otro tipo de estudios, como la inyección de péptidos moduladores, las drogas, el ADN plásmido o modulador RNA molecules u otras sustancias que pudieran afectar a la fisiología de las células. Ensayo combinación de moléculas y la realización de análisis de dosis-respuesta son posibles con este método, lo que permite el estudio de fenotipos hypomorphic. Con estas propiedades, CVMI demuestra ser un ensayo rápido y fácil para los estudios de expresión en el cerebro adultos de pez cebra, y se abre de detección rápida y análisis funcionales. El pez cebra cerebro adulto puede producir constitutivamente nuevas neuronas a lo largo de todo el eje rostrocaudal y también puede regenerarse después de lesiones traumáticas. Esto está en marcado contraste con los cerebros de los mamíferos con la neurogénesis limitado y en todo caso, más bien pobre capacidad de regeneración. Tal actividad de células madre generalizada y la capacidad de recuperación de pez cebra hace un organismo modelo útil para la comprensión de los programas moleculares necesarios para la regeneración del sistema nervioso central, que actualmente son en gran parte desconocidos. Por lo tanto, la investigación de la base molecular de la capacidad regenerativa de zebrafish cerebro es un interesante campo de investigación que podría explicar la diferencia fundamental la forma de pescado y de mamíferos cerebros reaccionan después de una lesión, y también dotar avenidas para terapias médicas regenerativas en los seres humanos. Para entender la infraestructura molecular de vertebrados plasticidad cerebral y la regeneración, las células gliales constituyen un área de investigación importante, ya que son los progenitores neurogénica 3,8,20. Por lo tanto, utilizando la técnica de CVMI para alterar la función del gen en las células gliales radiales del cerebro del pez cebra es instrumental en la aclaración de cómo el cerebro de pescado puede actividad progenitora pareja para neurogénesis adulta eficiente y respuesta regenerativa. Recientemente hemos demostrado la implicación y exigencia de varios factores y vías de señalización en la respuesta regenerativa neurogénesis del cerebro de pez cebra adultos 24,26,27, y estos estudios fueron posibles gracias a la utilización del método CVMI. En general, el conocimiento que obtenemos de pez cebra cerebro podría ser aprovechada para imponer regenecapacidad figurativa a las células gliales de mamífero que reaccionan a las lesiones y que por lo tanto, ayudar a diseñar terapias clínicas para trastornos neurológicos humanos y lesiones agudas.

Neurogénesis del adulto es un rasgo común a los vertebrados, sin embargo, su grado de prevalencia y eficiencia varía con la filogenia 1,2,3,4,5,6. Por ejemplo, los cerebros de mamíferos adultos contienen regiones de células madre en gran parte restringidos a la prosencéfalo 7,8, mientras que el pez cebra teleósteos contiene dieciséis dominios diferentes de células madre y las zonas neurogénicos asociados en la totalidad de su cerebro 4,5,9,10. Esta variación entre los mamíferos y el pez cebra podría reflejar una disparidad en los mecanismos de mantenimiento de células madre y la capacidad neurogénica de las células progenitoras. La competencia de toda la vida del pez cebra para producir las neuronas en el cerebro también podría suponer consecuencias clínicas como los mecanismos moleculares utilizados por el pez cebra cerebro podrían ser aprovechadas para aplicaciones terapéuticas para hacer frente a las enfermedades neurodegenerativas en seres humanos. Células madre de varias zonas del cerebro de pez cebra adulto han sido analizados y se ha demostrado que lacélulas que recubren la superficie ventricular de esas regiones sirven como células progenitoras 9,11-20. Los análisis detallados en el telencéfalo pez cebra, por ejemplo, identifican las células gliales radiales, que delimitan la superficie ventricular de esta región del cerebro que ser progenitores neurogénicos 19, 20. Esto es válido para otras regiones, como el cerebelo y el techo óptico, donde-ubicado ventricularly células neuroepiteliales proporcionan la entrada neurogénica 16,21. Para este fin, la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la competencia neurogénica generalizada en el cerebro del pez cebra adultos requiere la manipulación de la expresión génica en las células progenitoras. Varios métodos se han descrito anteriormente para la modulación de la función de genes en el pez cebra. Estos incluyen la generación de líneas transgénicas que expresan variantes condicionales deseados de una única proteína inyecciones focales, basados ​​en plásmidos acoplados a electroporación o tratamientos químicos. Anteriormente hemos diseñado unmétodo para la administración de diversas sustancias, incluyendo oligonucleótidos de morfolino o proteínas en el cerebro del pez cebra adultos usando microinyección cerebroventricular como una forma rápida y eficiente de modulación de la función de genes en las células ventriculares del adulto pez cebra cerebro anterior 22. En nuestros estudios, morfolinos in vivo se utilizan debido a su química que implica la molécula de morfolino unido covalentemente a péptidos ricos en arginina de entrega, que permiten la entrega eficiente a las células de interés sin necesidad de permeabilización adicionales, tales como la electroporación 23. Esto permitiría una orientación completa del tejido deseado después de la inyección, al igual que lo observado en adultos de pez cebra telencéfalo 22. El uso de morfolinos in vivo son por lo tanto superior a los métodos ya existentes de los tejidos dirigidos tales como electroporación o inyección focal de moléculas de ADN. Aquí, se demuestra visualmente cómo llevamos a cabo esta operación y proporcionar unprotocolo paso a paso. Comenzamos con la explicación de la preparación de la mezcla de inyección y el pescado para ser inyectado, y proceder mediante la demostración de cómo el aparato de inyección está configurado. Proporcionamos una descripción del método de inyección de cerebroventricular, que implica la generación de una incisión en el cráneo y la inyección de los morfolinos utilizando microinyector. También dio detalles sobre los puntos críticos es necesario ser cauteloso durante todo el procedimiento declarando como optimización o guías de solución de problemas.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Se requiere la manipulación de la expresión génica en los tejidos para llevar a cabo estudios funcionales. En este trabajo se demuestra la técnica de microinyección cerebroventricular (CVMI) como un medio para modular la expresión de genes en el cerebro del pez cebra adulto. Mediante el uso de CVMI, las sustancias se pueden administrar en el líquido cerebroventricular y ser distribuidos a fondo a lo largo del eje rostrocaudal del cerebro. En particular nos centramos en el uso de oligonucleótidos antisentido de morfolino, que son herramientas potentes para derribar la expresión génica in vivo. En nuestro método, cuando se aplica, las moléculas de morfolino son absorbidos por las células que recubren la superficie ventricular. Estas células incluyen las células gliales radiales, que actúan como progenitores neurogénicos. Por lo tanto, derribando la expresión génica en las células gliales radiales es de suma importancia para analizar la respuesta generalizada neurogénesis en el pez cebra, y también dar una idea de cómo los vertebrados podrían sostener Neurogen adultosrespuesta nesis. Tal comprensión también ayudaría a los esfuerzos para la aplicación clínica en los trastornos neurodegenerativos humanos y la regeneración del sistema nervioso central. Por lo tanto, presentamos el método de microinyección cerebroventricular como una forma rápida y eficiente para alterar la expresión de genes y la respuesta de la neurogénesis en el cerebro anterior adultos de pez cebra. También ofrecemos consejos para solucionar problemas y otra información útil sobre cómo llevar a cabo el procedimiento CVMI.

Microinyección cerebroventricular conduce a la amplia distribución de la solución inyectada Usando el esquema de flujo de trabajo y la técnica de la microinyección cerebroventricular representado en la Figura 1, se administraron oligonucleótidos de morfolino en el cerebro del pez cebra adultos. Un protocolo de inyección precisa conduce a la dispersión del líquido inyectado a través del cerebro y eficiente focalización de las células cercanas a la superficie ventricular (Figura 2A). Inyecciones donde el capilar de vidrio empala el tejido cerebral tendrán una señal fluorescente densa en el punto de la inyección (Figura 2B). Si la cantidad inyectada no es suficiente, se observó señal fluorescente débil (Figura 2 C). Microinyección cerebroventricular se puede utilizar para derribar la expresión génica en la región del ventrículo del cerebro adultos de pez cebra Hemos demostrado ªen morfolinos in vivo puede penetrar unos pocos diámetros de células dentro de la superficie ventricular y por lo tanto pueden dirigirse de manera eficiente las células ventriculares (Figuras 3A, 3B). Inyección de morfolino pueden expresión de genes desmontables ya que aliviará la producción de la proteína correspondiente (un ejemplo es PCNA como se muestra en las figuras 3C, 3D). Hemos demostrado previamente que derribar genes utilizando esta técnica conduce a consecuencias funcionales durante la neurogénesis adulta (Figuras 3E, 3F) o respuesta regeneración (Figuras 3G, 3H). Hemos demostrado que el rango de caída eficiente (más de 50% desmontables) se consigue aproximadamente 12 horas después de la inyección de la morfolinos 22. También se observó que período de caída eficiente es hasta aproximadamente 5 días después de la inyección de la proteína PCNA 22. Más de 70% desmontables fue visto hasta 3 días después de la inyección 22. Las curvas son desmontables o dependienten el nivel de expresión de las proteínas endógenas y la eficiencia de las moléculas de morfolino, y tiene que ser determinada para cada gen por el experimentador. En nuestros estudios, no hemos visto que el procedimiento CVMI pone en peligro la supervivencia del animal, probablemente debido a que la administración de las moléculas morpholino es local y no causa una toxicidad sistémica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática de la técnica de inyección cerebroventricular. (A) La inyección se realiza desde el dorsal del pez cebra adultos (1) en el nivel de techo óptico (OT, 2). Se hace una incisión sobre la placa de cráneo tectal óptica con una aguja de calibre 30 (3). Uso de capilares de vidrio, las moléculas de morfolino se inyectan en el líquido ventricular (4). Una dispersión a fondo es unachieved instantáneamente (5). (B) La cánula y su extremo de púas se muestra en la alta ampliación. (C) La orientación de la aguja antes de la incisión. (D) La incisión es un círculo y se indica por líneas de trazos. (E) La inyección capilar está situado como se muestra y se lleva a cabo la inyección. Todos los paneles fueron adaptadas de ref. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figura 2. Comparación de la eficiencia de inyección y la precisión. (A) Una buena inyección conduce a la orientación de las células cercanas a la superficie ventricular. (B) Si se introduce el vaso capilar en el tejido cerebral, lo que generará una señal de fluorescencia céntrico. (C </strong&gt;) Si la cantidad de inyección es baja, esto dará lugar a la menor señal de fluorescencia. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figura 3. . Morpholino penetración, eficiencia de caídas de genes y las consecuencias funcionales (A) GFP inmunotinción de las secciones transversales telencefálicas del control morpholino inyectado Tg (H2A: GFP) línea transgénica que muestra núcleos GFP-positivas. (B) GFP inmunotinción de las secciones transversales telencefálicas de gfp antisentido morpholino inyectado Tg (H2A: GFP) línea transgénica que muestra núcleos GFP-positivas. Tenga en cuenta la diferencia en la señal de GFP en la región ventricular. v: ventrículo. (C) PCNA inmunotinción en el control de morfolino-inyectado cerebro que muestran la distribución generalizada de células PCNA positivas. ( <strong&gt; D) PCNA PCNA inmunoticción en antisentido morpholino cerebros de inyección que muestran significativamente reducidas cantidades de células PCNA positivas, demostrando que CVMI lata desmontables genes endógenos. (E) y BrdU HuC / D inmunotinción en el control morpholino-inyectados cerebros para determinar las neuronas recién nacidas después de un experimento BrdU pulso-caza descrito antes de los 22. (F) y BrdU HuC / D inmunotinción de PCNA cerebros antisentido morpholino-inyectados para determinar las neuronas recién nacidas después de un experimento BrdU pulso-caza descrito antes de los 22. (G) Golpear-PCNA hacia abajo conduce a una reducción significativa en la generación de neuronas recién nacidas, lo que indica que CVMI se puede utilizar para desmontables genes endógenos, que dan lugar a consecuencias funcionales. Todos los paneles fueron adaptadas de ref. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K vistas.  Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden. En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Video: Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Investigación

Neurociencias

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

En Vivo Control de la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático de ratón usando fluorescencia Reporteros

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...