الكتاب أشكر الدكتور بول Janmey في جامعة ولاية بنسلفانيا لتوفير خطوط الخلايا المستخدمة في هذه الورقة. QW نعترف أيضا JF في Byfield وايفان اندرسون للمناقشات الثاقبة على تقنيات AFM.

1. معايرة الربيع ثابت من الكابولي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ناتئ إلى AFM وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. فمن الضروري لتنظيف حامل ناتئ مع الايثانول قبل أي تجارب. وهذا سوف يساعد الحد من التلوث الجرثومي للثقافة خلال قياسات AFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة InvOLS (معكوس بصري حساسية ليفر). يصف هذه المعلمة مقدار استجابتها الثنائي الضوئي (فولت) لكل نانومتر من انحراف ناتئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل شريحة زجاجية نظيفة على خشبة المسرح عينة، ثم تثبيت الرأس AFM وضبط شعاع الليزر والمحاذاة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إشراك طرف فؤاد على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع بيزو سحب، إعادة تنظيم المرآة لقراءة الضوئي -2 V. إجراء القياس الطيفي قوة مع نقطة الزناد (الحد الأقصى استجابة الثنائي الضوئي) من +2 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع بيزو سحب، إعادة تنظيم المرآة لقراءة الضوئي -2 V. إجراء FOالقياس الطيفي RCE مع نقطة الزناد (الحد الأقصى استجابة الثنائي الضوئي) من +2 V. ملاحظة: القيم الجهد هنا هي محددة إلى اللجوء AFM. يجب أن يتم تعيين هذه القيمة وفقا للمواصفات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. بعد الحصول على البيانات كاملة، وتكبير لمنطقة الشركة التي الاتصال من منحنى القوة. إجراء مناسبا خطي إلى هذه المنطقة للعثور على المنحدر، والتي ستكون في الخامس / نانومتر. معكوس هذه القيمة يصف الحساسية الضوئية من الفرقة ناتئ-الثنائي الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعيين محاذاة مرآة لانحراف خالية من 0 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة الربيع ناتئ المستمر. استخدمت طريقة الحرارية تصل قيمتها لتحديد الربيع المستمر للناتئ 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد معايرة InvOLS، ورفع الماسح الضوئي بعيدا عن مرحلة عينة مثل عدم وجود تفاعلات بين طرف وعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التقاط البيانات الحرارية. خلال هذه العملية، واهتزاز الحراري للشعاع ناتئ هو recordeد. البرنامج AFM يحلل طيف الطاقة من مثل هذا الاهتزاز الحراري والمؤامرات في نافذة البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بضع ثوان من الحصول على البيانات، إجراء مناسبا لمقطع البيانات تركزت على أدنى تردد (صدى الأساسية) لتحديد الذروة في ربيع دائم. </li></ol> 2. تحميل عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت ملحق سخان طبق على المرحلة AFM، إن لم يكن مجهزة بالفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وانتظر لمدة 20 دقيقة للنظام من أجل التوصل إلى التوازن الحراري مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق الثقافة على المسرح AFM وضمان الحصول عليها باستخدام المشبك المتوفرة مع سخان الطبق. فمن المهم لتقليل الوقت بين إزالة الطبق من الحاضنة ووضعه على المسرح، لتجنب الصدمة إلى الخلايا. لقياس أطول من 30 دقيقة، CO 2 متوسطة المستقل ينبغي أن تستخدم لتحل محل ثقافة المتوسط ​​العادي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطرة صغيرة من 37 ° C مستنبت لغيض من رانه AFM ناتئ، وخفض رأس AFM حتى يتم المغمورة غيض فقط في السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أفضل كاميرا الرؤية CCD، يعيد تنظيم شعاع الليزر على ناتئ (سوف المحاذاة في السائل تكون مختلفة مما كانت عليه في الهواء، وذلك بسبب التغير في معامل الانكسار للوسط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إشراك طرف فؤاد على منطقة نظيفة من صحن الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المعايرة للInvOLS كما هو موضح أعلاه، لحساسية ناتئ في البيئة السائلة. </li></ol> ملاحظة: أ) إذا يتم استزراع الخلايا على الهلاميات المائية، ومعايرة InvOLS يجب أن يتم تنفيذ مقدما ضد السطح السفلي من صحن الثقافة مليئة سائل الإعلام والثقافة الخلية. عند التبديل إلى عينات الخلايا، اهتماما خاصا يجب أن يدفع لعدم تغيير محاذاة شعاع الليزر مع ناتئ. ب) لديه InvOLS أن تعديلها كلما كان هناك تغيير في محاذاة الليزر. ج) كما يوصى لاتخاذ InvOLS على أنه متوسط ​​قيمة من عدة منحنيات المعايرة، قاينس كل معايرة يولد InvOLS مختلفة. الاختلاف في InvOLS هو، ومع ذلك، صغيرة مقارنة مع القيمة المتوسطة. على سبيل المثال، معايرة وبروكر DNP-10 ناتئ مع الربيع الدائم 0.06 نيوتن / متر في السائل بواسطة 100 مرة تنتج قيمة InvOLS متوسط ​​66.3 نانومتر / V، مع انحراف معياري من نانومتر فقط 0.5 / V. 3. جمع منحنيات القوة المسافة البادئة الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خلية للتسنن. مع المعونة من المجهر الضوئي، حرك مرحلة لوضع ناتئ فوق الخلية بحيث يقع طرف في المنطقة شبه نوى. التعديل الدقيق للموقف ناتئ ويمكن تحقيق ذلك بتطبيق إزاحة إلى X و Y الماسحات الضوئية. ملاحظة: ناتئ AFM لابد من سحبها من سطح العينة في الوقت الذي يتجه المرحلة عينة لتحديد خلية الهدف. هذا يحمي ناتئ من يطرق في العينة، حيث أن سطح العينة قد لا تكون مسطحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى الوضع فرض الطيفي. تعيين المسافة البادئةمعدل إلى ضمن مجموعة من 1-10 ميكرون / ثانية، منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب الآثار الهيدروديناميكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين نقطة الزناد انحراف، الأمر الذي يحد من الحد الأقصى للقوة الطعج لتجنب الضرر للخلايا. حدد الخيار اثار النسبية، والتي سوف تصحيح أي انحراف في إشارة انحراف. قوة أقصى 2 ن ن هي نقطة انطلاق جيدة بالنسبة لمعظم العينات. هذه القيمة، ومع ذلك، ينبغي تعديلها وفقا للصلابة العينة. للحصول على عينات لينة انخفاض قيمة ينبغي أن تستخدم لتجنب المسافة البادئة المفرط للعينة. للحصول على عينات شديدة قيمة عالية وينبغي أن تستخدم لتوليد المسافة البادئة قابلة للقياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مسافة قوة كبيرة بما يكفي لضمان أن غيض سيتم فصل كامل من الخلية بين قياسات القوة. عادة، يتم تعيين مسافة النفاذ في 5 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قيادة AFM أن تأخذ منحنى قوة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما لا يقل عن ثلاثة منحنيات القوة في مواقع مختلفة في منطقة شبه نواة كل خلية. على الرغم من أنه هو مفيد لاتخاذ متعددةالمنحنيات على كل خلية لبيانات إحصائية موثوقة، مع الكثير من المنحنيات القوة يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في صلابة الخلية بسبب الإجهاد من التحقيق فؤاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما جمع البيانات كاملة، سحب الحافة، وكرر الخطوات من 3،1-3،6 لأكبر عدد من الخلايا حسب الحاجة للبيانات إحصائية جيدة على صلابة الخلية تحت بعض حالة العينة. عادة، يتم قياس 30 خلايا لكل حالة. </li></ol> لتوصيف توزيع صلابة داخل خلية واحدة، يتم تطبيق وضع قوة الخريطة. في وضع قوة الخريطة، وتعيين حجم المسح الضوئي لتشمل المنطقة من الفائدة؛ تعيين القرار المناسب؛ تعيين المعلمات المسافة البادئة لتلك التي اختيرت لمنحنيات قوة واحدة؛ سوف AFM ثم النقطية عبر منطقة العينة المحددة وتأخذ منحنيات قوة واحدة في كل بكسل في المنطقة عينة. 4. تحليل البيانات ويتم تحليل منحنيات القوة تسجيلها باستخدام إجراء مخصص MATLAB لحساب صلابة الخلية. وفيما يلي وصفا موجزا لإجراء MATLAB: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحدد برنامج MATLAB نقطة الاتصال بتنسيق Z0 وD0 (انظر الشكل 1) باستخدام خوارزمية اعتمد من أسلوب نشرته لين وآخرون 29.: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل نقطة بيانات في منحنى القوة، نفذ نوبة خطية من البيانات إلى يسار نقطة من الفائدة، ونموذجا يصلح هيرتز إلى اليمين (باستخدام نقطة المحددة كنقطة اتصال أولية)، وصولا إلى مجموعة أقصى المسافة البادئة (200-300 نانومتر مستحسن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل نقطة، وحساب الخطأ RMS النسبية لكلا متقطعة وخلاصة هذه القيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد النقطة التي يبلغ الحد الأدنى المشاركات الخطأ المناسب كنقطة اتصال أولية. ملاحظة: يمكن تخفيض الوقت اللازم للحساب من خلال تنفيذ البحث المقطع الذهبي، بدلا من المسح الضوئي خطيا منحنى القوة بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم احتساب عينة δ تشوه والطعج قوة F على النحو التالي: <img alt="المعادلة 1"FO: محتوى العرض = &quot;3.073in&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تطبيق المربعات الصغرى المناسب لتناسب F مقابل البيانات δ في المنطقة بعد الاتصال، Z ≥ Z 0، لنموذج هيرتز لاستخراج معامل يونغ، E للخلية: <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> ، حيث v هي النسبة بواسون. ملاحظة: عندما يكون δ هو أكثر من 10٪ من عينة سماكة (ارتفاع الخلية)، يتأثر صلابة الخلية تقاس صلابة الركيزة. سمك منطقة شبه النووي هو عادة بناء على أمر من بضعة ميكرومتر. لذلك، ولا يصلح إلا للنانومتر 200-300 أول من F-δ للنموذج منحنى هيرتز. </li></ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Wagner, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Softness,+strength+and+self-repair+in+intermediate+filament+networks.">Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks.</a> Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model.">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells.">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).</li><li>Kasza, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A+is+essential+for+active+cell+stiffening+but+not+passive+stiffening+under+external+force.">Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force.</a> Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).</li><li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanics+as+an+indicator+of+cytoskeletal+structure+and+function.">Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).</li><li>Schafer, A., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+myosin+II+activity+on+stiffness+of+fibroblast+cells.">Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells.</a> Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).</li><li>Guck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deformability+as+an+inherent+cell+marker+for+testing+malignant+transformation+and+metastatic+competence.">Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence.</a> Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).</li><li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer.">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).</li><li>Rotsch, C., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+changes+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+in+fibroblasts:+an+atomic+force+microscopy+study.">Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.</a> Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+extract+selectively+targets+nanomechanics+of+live+metastatic+cancer+cells.">Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 22, 215101 (2011).</li><li>Hoffman, B. D., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+dissecting+the+physical+responses+of+cells+to+force.">Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).</li><li>Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consensus+mechanics+of+cultured+mammalian+cells.">The consensus mechanics of cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).</li><li>Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology,+stress+fluctuations,+and+active+behavior+of+living+cells.">Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells.</a> Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+probes+length+scale+dependent+rheology.">Microrheology probes length scale dependent rheology.</a> Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).</li><li>Deng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+slow+dynamics+of+the+cytoskeleton.">Fast and slow dynamics of the cytoskeleton.</a> Nature Materials. 5, 636-640 (2006).</li><li>Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+Aspiration+of+Substrate-attached+Cells+to+Estimate+Cell+Stiffness.">Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness.</a> J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).</li><li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+living+cells.">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).</li><li>Levental, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+indentation+device+for+measuring+micrometer-scale+tissue+stiffness.">A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness.</a> J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).</li><li>Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+viscoelastic+properties+of+thin+regions+of+fibroblasts+using+atomic+force+microscopy.">Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+elastic+properties+of+biological+samples+with+the+AFM.">Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine &amp; Biology Society. 16, 47-57 (1997).</li><li>Crocker, J. C., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+and+two-point+microrheology+in+cells.">Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).</li><li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy.">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates.">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).</li><li>Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+l929+cells+measured+by+atomic+force+microscopy:+Effects+of+anticytoskeletal+drugs+and+membrane+crosslinking.">Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking.</a> Scanning. 20, 389-397 (1998).</li><li>Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+viscoelastic+properties+of+human+platelets+with+the+atomic+force+microscope.">Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).</li><li>Levy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers:+thermal+fluctuations+and+other+methods.">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).</li><li>Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cell+expression+of+genes+implicated+in+proliferative+vitreoretinopathy+is+influenced+by+substrate+elastic+modulus.">Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).</li><li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+elasticity:+Measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation.">Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li><li>Lele, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+cell+mechanics+and+mechanotransduction.">Tools to study cell mechanics and mechanotransduction.</a> Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).</li><li>A-Hassan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy.">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+approach+to+analyzing+mechanical+properties+of+endothelial+cells+probed+by+atomic+force+microscopy.">Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).</li><li>Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+nanomechanics+of+live+neuronal+growth+cones+analyzed+by+atomic+force+microscopy.">Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).</li><li>Byfield, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+filamin+A+prevents+cells+from+responding+to+stiffness+gradients+on+gels+coated+with+collagen+but+not+fibronectin.">Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin.</a> Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).</li><li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+analysis+of+human+metastatic+cancer+cells.">AFM-based analysis of human metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 19, 384003 (2008).</li><li>Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+elasticity+in+biological+gels.">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li><li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+physics+of+the+cytoskeleton.">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State &amp; Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy.">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).</li><li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأسلوب المسافة البادئة AFM له مزايا لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الحية. وإن كان أقل حساسية من الخلوي التواء المغناطيسي وملاقط بصرية، والتي يمكن قياس القوى على مستوى piconewton 32، يمكن للAFM كشف قوة المقاومة من عينات تتراوح بين عشرات بيكو نيوتن لمئات من النانو ن?...

الخصائص الميكانيكية، خصوصا صلابة، من الخلايا الفردية ومصفوفات المحيطة بهم خارج الخلية (ECM) هي الحاسمة بالنسبة لكثير من العمليات البيولوجية بما في ذلك نمو الخلايا، حركية، وتقسيم، والتمايز، وتوازن الأنسجة. 1 وقد ثبت أن صلابة ميكانيكية الخلية يتحدد أساسا من قبل الهيكل الخلوي، وخصوصا شبكات الأكتين وخيوط الوسيطة وغيرها من البروتينات المرتبطة بها. 2 من نتائج الإختبارات الميكانيكية للشبكات في المختبر من الأكتين وخيوط الوسيطة تشير إلى أن ميكانيكا خلية يعتمد إلى حد كبير على الهيكل هيكل الخلية وقبل الإجهاد في ثم يعتبر الهيكل الخلوي. 3-5 تصلب الخلايا الحية وذلك في مؤشر لتقييم هيكل هيكل الخلية 6، النشاط الميوسين 7 والعديد من العمليات الخلوية الأخرى. الأهم من ذلك، وأيضا كثيرا ما وجدت تغيرات في الخواص الميكانيكية الخلية ليكون associ عن كثبانبعاث العوادم مع الحالات المرضية المختلفة مثل تشكيل الورم والانبثاث 8-10 الرصد وبالتالي يمكن للصلابة الميكانيكية للخلايا الحية توفر وسيلة جديدة لمراقبة فسيولوجيا الخلية؛ لكشف وتشخيص الأمراض 8؛ وتقييم فعالية العلاج بالعقاقير 11 ، 12 وقد تم تطوير طرق متعددة بما في ذلك microrheology الجسيمات تتبع، 13-16 المغناطيسي الخلوي التواء، 17 micropipette تطلع 18،19 وmicroindentation 20-22 لقياس مرونة من الخلايا. الجسيمات تتبع microrheology يتتبع الاهتزازات الحرارية إما جزيئات الفلورسنت submicron حقنها في الخلايا أو علامات إيمانية داخل الهيكل الخلوي الخلية. تحسب 23 خصائص المرونة واللزوجة من الخلايا من التشريد الجسيمات قياسها باستخدام نظرية تقلب تبديد. 14،23 يسمح هذا الأسلوب القياسات في وقت واحد من المحليةالخواص الميكانيكية لقرار مكانية عالية في أماكن مختلفة في خلية. ومع ذلك، حقن جزيئات الفلورسنت في الخلايا قد تؤدي إلى تغييرات في وظيفة الخلوية وبناء الهيكل الخلوي، وبالتالي آليات الخلية. طريقة الرشف micropipette ينطبق الضغط السلبي في micropipette من بقطر يتراوح من 1 إلى 5 ميكرون حتى تمتص قطعة صغيرة من غشاء الخلية في ماصة. يتم احتساب صلابة خلية من الضغط السلبي التطبيقية وغشاء الخلية تشوه. 18 هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يمكن الكشف عن التوزيع غير متجانسة من صلابة عبر الخلية. الخلوي التواء المغناطيسي (MTC) ينطبق المجال المغناطيسي لتوليد عزم الدوران على الخرز ممغطس السوبر تعلق على غشاء الخلية. مشتق 17 صلابة الخليوي في هذا الأسلوب من العلاقة بين عزم الدوران التطبيقية وتشوه التواء من غشاء الخلية. فمن الصعب السيطرة على الموقع من الخرز المغناطيسي في طريقة MTC، وأنه هو أيضا challengiنانوغرام لتوصيف تشوه التواء مع ارتفاع القرار. Microindentation ينطبق على إندينتر مع هندسة واضحة المعالم لكمة في الخلية. قوة الطعج والمسافة البادئة الناتجة في الخلايا غالبا ما تتبع التنبؤ للنموذج هيرتز. ويمكن حساب معاملات الرجوعية الشباب من الخلايا من منحنيات قوة المسافة البادئة من المناسب لهم لنموذج هيرتز. وقد تم تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لاختبار الخواص الميكانيكية للأنسجة وخلايا رغم من حدودها مثل عدم اليقين في تحديد نقطة الاتصال، انطباق نموذج هيرتز، والقدرة على الإضرار بدنيا الخلايا. من بين العديد من الأجهزة لmicroindentaion 20، مجهر القوة الذرية (AFM) متاحة تجاريا وأنها طبقت على نطاق واسع لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الحية والأنسجة 21،24-27. يوضح هذا الإجراء من ورقة باستخدام اللجوء MFP3D بيو AFM لتوصيف ميكانيكا الخلية. AFM ليس علىيوفر لاي تضاريس عالية الدقة من الخلايا ولكن أيضا تم تطبيقه على نطاق واسع لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الأنسجة. ويتضح مبدأ AFM المسافة البادئة في الشكل 1. ناتئ AFM تقترب الخلية من بضعة ميكرومتر أعلاه؛ يجعل الاتصال مع الخلية؛ المسافات البادئة الخلية بحيث انحراف ناتئ تصل إلى نقطة مجموعة انتقاؤه، وتسحب بعيدا عن الخلية. أثناء هذه العملية يتم تسجيل انحراف ناتئ بوصفها وظيفة من موقعه كما هو مبين في الشكل 1. قبل إجراء الاتصال مع الخلية، ينتقل ناتئ في الوسط دون أي انحراف واضح. عندما الطعج على الخلية، والانحناءات ناتئ والزيادات إشارة انحراف. وعلى غرار الكابولي كما الحزمة مرنة بحيث انحراف بهم يتناسب مع القوة المطبقة على الخلية. عن طريق تحديد الحد الأقصى للانحراف ناتئ، والحد الأقصى لحجم القوة المطبقة على عينة محدودة لتجنب Damage إلى الخلايا. جزء من منحنى القوة من نقطة إلى نقطة ب ج في الشكل 1، حيث المسافات البادئة طرف في الخلية، ولا يصلح لنموذج هيرتز لاستخراج صلابة الخلية. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> الشكل 1. التوضيح من AFM microindentation وتفسير منحنى القوة. لوحة العلوي يظهر حركة AFM ناتئ مدفوعا الماسح الضوئي بيزو. يتم تسجيل موقع العمودي ناتئ Z وناتئ انحراف إشارة د أثناء العملية. يبدأ ناتئ من النقطة (أ)، وعدد قليل ميكرومتر أعلى الخلية. بينما تقترب الخلية، يبقى δ المسافة البادئة عينة الصفر حتى يصل إلى نقطة (ب)، حيث يأتي في اتصال مع طرف الخلية. إحداثيات النقطة (ب) في المؤامرة هي القيم الحرجةلتحليل البيانات، يشار إليه ب (Z 0، د 0&gt;). من B إلى C، البادئة ناتئ في الخلية حتى انحراف ناتئ تصل إلى نقطة المجموعة، والتي من المقرر أن تكون النسبة بين الحد الأقصى الطعج القوة المستهدفة والربيع ناتئ المستمر. مرة واحدة في إشارة انحراف تصل القيمة القصوى محددة مسبقا، ثم يتم سحب ناتئ من الخلية إلى نقطة التطوير، حيث أنه غالبا ما يتم سحبها إلى الأسفل بسبب التصاق بلاغ عينة، يفصل من الخلية ويعود إلى المكان الأولي في البريد. يوضح اللوحة اليمنى العلاقة بين المسافة البادئة وZ المسجلة وإشارة د. في على اللوحة اليسرى السفلى هو مؤامرة من منحنى ممثل القوة، والحد الأقصى المسافة البادئة من ناتئ، من الذي يقاس ثابت الربيع ليكون 0.07N / م، ومن المقرر أن يكون 17 نانومتر بحيث الحد الأقصى للقوة الطعج تطبيقها على العينة 1.2 ن ن. يتم وضع علامة على المواقع الرئيسية خلال المسافة البادئة.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

الخواص الميكانيكية للخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) تلعب دورا هاما في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية، وتشكيل الورم، والتئام الجروح. التغييرات في تصلب الخلايا وECM غالبا ما تكون علامات تغيرات في علم وظائف الأعضاء أو خلية أمراض في الأنسجة. وبالتالي، وصلابة الخلية هو مؤشر لتقييم الوضع من مزارع الخلايا. من بين العديد من الأساليب التطبيقية لقياس صلابة من الخلايا والأنسجة، والصغرى المسافة البادئة باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) يوفر وسيلة لقياس موثوق صلابة من الخلايا الحية. وقد تم تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لتوصيف صلابة الصغيرة الحجم لمجموعة متنوعة من المواد تتراوح بين السطوح المعدنية إلى الأنسجة البيولوجية لينة والخلايا. المبدأ الأساسي لهذه الطريقة هو أن المسافة البادئة خلية مع تلميح AFM الهندسة المختارة وقياس القوة المطبقة من الانحناء للناتئ فؤاد. تركيب منحنى قوة المسافة البادئة إلى وضع هيرتزL للهندسة طرف المقابل يمكن أن تعطي قياسات كمية من صلابة المواد. يوضح هذا الإجراء ورقة لتوصيف صلابة من الخلايا الحية باستخدام AFM. وأظهرت الخطوات الرئيسية بما في ذلك عملية AFM المعايرة، واكتساب قوة منحنى، وتحليل البيانات باستخدام MATLAB الروتينية. وتناقش أيضا القيود المفروضة على هذه الطريقة.

ويبين الشكل 2A ثلاثة منحنيات القوة الممثلة المأخوذة من الخلايا الليفية 3T3 مثقف على سطح البلاستيك، هلام بولي أكريلاميد من الشباب معاملات الرجوعية 3،000 باسكال و17،000 باسكال، على التوالي. بعد تحديد دقيق لنقاط الاتصال في المنحنيات، يتم رسم قوة الطعج وظيفة من تشوه ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

يوضح هذه الورقة على بروتوكول لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الحية عن طريق microindentation باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.7K Views.  Worcester Polytechnic Institute. يوضح هذه الورقة على بروتوكول لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الحية عن طريق microindentation باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM).

Video: Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

قياس الخواص الميكانيكية للالكنان السكري غشائي مع مجهر القوة الذرية

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

في الموقع خارطة الخواص الميكانيكية لالأغشية الحيوية التي تتبع الجسيمات Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

باستخدام البيولوجيا الاصطناعية إلى المهندس الخلايا الحية تتفاعل مع المواد القابلة للبرمجة

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

نظام ملليمتر اختبار العاطفة مقياس لقياس الخواص الميكانيكية للاسفنج البحري سبيكوليس

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...