Yazarlar bu çalışmada kullanılan hücre hatları sağlamak için Pennsylvania Üniversitesi&#39;nden Dr Paul Janmey teşekkür ederim. QW da AFM teknikleri üzerine anlayışlı tartışmalar için JF Byfield ve Evan Anderson kabul.

1. Konsol ve Bahar Sabit kalibre <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre AFM konsol içine yerleştirin. Bu, herhangi bir deney önce etanol ile konsol tutucu temizlenmesi gereklidir. Bu AFM ölçümleri sırasında kültüre bakteriyel kontaminasyon sınırı yardımcı olacaktır. </li><li> InvOLS (Ters Optik Kol Hassasiyet) kalibre edin. Bu parametre konsol sapma nanometre başına fotodiyot yanıt (Volt) miktarını açıklar. </li><li> Örnek sahneye temiz bir cam slayt yükleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre AFM baş yüklemek ve lazer ışını ve hizalama ayarlayın. Cam slayt AFM ucu meşgul. </li><li> Piezo geri ile, -2 bir fotodiyot okuma ayna yeniden düzenlemek V. +2 tetik nokta (maksimum fotodiyot tepki) ile bir kuvvet spektroskopi ölçüm yapın V. </li><li> Piezo geri ile, -2 bir fotodiyot okuma ayna yeniden düzenlemek V. fo gerçekleştirin+2 V. Not bir tetik nokta (maksimum fotodiyot tepki) ile rce spektroskopisi ölçümü: Burada gerilim değerleri Sığınma AFM özgüdür. Bu değer üretici tarafından sağlanan teknik özelliklere göre ayarlanmalıdır. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, kuvvet eğrisinin firma temas bölgesi yakınlaştırmak. V / nm olacak eğim, bulmak için bu bölgeye doğrusal bir uyum gerçekleştirin. Bu değerin karşılıklı konsol-fotodiyot topluluk optik hassasiyeti açıklar. </li><li> 0 ücretsiz bir sapma için ayna uyum sıfırlayın V. </li><li> Konsol yay sabiti kalibre edin. Bir ısı ayar yöntemi konsol 28 yay sabitesi olduğu da tespit etmek için kullanılır. </li><li> InvOLS ayarladıktan sonra ucu ve örnek arasında etkileşim olduğunu bu örnek aşamasından tarayıcı uzak yükseltmek. </li><li> Termal veri yakalama başlayın. Bu işlem sırasında, bir kirişin termal titreşim recorde olduğud. AFM yazılım böyle bir termal titreşim ve bir veri pencerede araziler bunun bir güç spektrumu analiz eder. </li><li> Veri toplama bir kaç saniye sonra, yay sabiti belirlemek için düşük frekanslı (temel rezonans) zirvesinde merkezli veri kesimi için bir uyum gerçekleştirin. </li></ol> 2. Örnek yükleme <ol><li> AFM sahnede Bulaşık Isıtıcı aksesuar yükleyin, zaten varsa değil. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar sıcaklık ayarlama ve istikrarlı bir termal dengeye ulaşmak için sistem 20 dakika boyunca bekleyin. </li><li> AFM sahnede kültür çanak yerleştirin ve çanak ısıtıcı ile sağlanan kelepçe kullanarak sabitleyin. Bu inkübatör çanak çıkarılması ve hücreler, travma önlemek için, sahne üzerine yerleştirerek arasındaki zamanı en aza indirmek için önemlidir. 30 dakika daha uzun bir ölçüm yapmak için, CO2 bağımsız ortamı, normal kültür ortamı değiştirmek için kullanılmalıdır. </li><li> T ucuna 37 ° C kültür ortamı küçük bir damla uygulayıno AFM konsol ve ucu sadece sıvı batık kadar AFM baş indirin. </li><li> Üst-view CCD kamera kullanarak, konsol (sıvı içinde uyum nedeniyle ortamın kırılma endeksi değişim, havada daha farklı olacaktır) üzerine lazer ışını yeniden hizalayın. </li><li> Kültür çanak temiz bir alan üzerinde AFM ucu meşgul. </li><li> Sıvı bir ortamda konsol hassasiyet için, yukarıda tarif edildiği gibi InvOLS kalibrasyonu yapın. </li></ol> Not: hücreler hidrojeller üzerinde kültive edildiğinde, a) Eğer InvOLS arasında kalibrasyon hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş bir kültür kabı alt yüzeyine karşı önceden yapılmalıdır. Hücre örnekleri geçiş yaparken, özel dikkat konsol ile lazer ışını hizalama değişmez ödenecek vardır. b) InvOLS lazer hizalama bir değişiklik olduğu takdirde tekrar kalibre edilmesi gerekir. c) Ayrıca çeşitli kalibrasyon eğrileri, s değerinin ortalaması olarak InvOLS almak tavsiye edilirher kalibrasyon farklı bir InvOLS oluşturur ince. InvOLS farklılaĢma ortalama değeri ile karşılaştırarak, ancak, küçüktür. Örneğin, 100 kat 0.06 Yok sıvı / m sabit yaylı bir Bruker DNP-10 konsol kalibre sadece 0.5 nm / standart sapma ile, 66.3 nm / V ortalama InvOLS değer üreten V. 3. Hücre Girinti Kuvvet Eğrileri Toplama <ol><li> Girinti için bir hücre seçin. Optik mikroskop yardımı ile, ucu, peri-çekirdek bölgesinde yer alır, böylece hücrenin üstündeki konsol konumlandırmak için sahne hareket eder. Konsol konumunun hassas ayarı X ve Y tarayıcılar için uzaklıklar uygulayarak gerçekleştirilebilir. Not: AFM konsol bir hedef hücre seçmek için örnek sahne hareket ederken numune yüzeyinden geri gerekir. Örnek yüzeyi düz olmayabilir çünkü bu, örnek içine vurma gelen konsol korur. </li><li> Spektroskopisi modu Kuvvet geçin. Girinti ayarlayınhidrodinamik etkileri önlemek için yeterince düşük 1-10 mm / sn aralığında hızı. </li><li> Hücrelere zarar vermemek için azami girinti kuvvetini sınırlandırır sapma tetik nokta, ayarlayın. Sapma sinyali herhangi bir sürüklenme için düzeltecektir Bağıl tetikleme seçeneği seçin. 2 nN en fazla gücü en örnekleri için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Bu değer, ancak, Örnek sertlik göre ayarlanmalıdır. Yumuşak örnekleri için daha düşük bir değere örnek aşırı girinti önlemek için kullanılmalıdır. Sert örnekleri için yüksek bir değer ölçülebilir girinti oluşturmak için kullanılmalıdır. </li><li> Ucu tam kuvvet ölçümleri arasındaki hücre ayrılmış olacak sağlamak için yeterince büyük kuvvet mesafeyi ayarlayın. Genellikle, kuvvet mesafe 5 mikron olarak belirlenmiştir. </li><li> Tek bir güç eğrisi almak için AFM komut. </li><li> Her hücrenin peri-çekirdek bölgesinde farklı yerlerde en az üç kuvvet eğrileri toplayın. Birden fazla çekmek için yararlı olmakla birlikteçok fazla güç eğrileri alarak güvenilir istatistiki veriler için her hücre üzerinde eğriler, AFM prob alacaklar strese hücre sertlik değişikliklere yol açabilir. </li><li> Veri toplama tamamlandığında, ucu geri ve belirli bir örnek koşul altında hücre sertliği üzerinde iyi istatistiki veriler için gerektiği kadar tekrar kadar hücreler için 3.1-3.6 adımları. Genellikle, 30 hücreleri her bir durum için ölçülür. </li></ol> Tek bir hücre içinde sertlik dağılımını karakterize için, zorla harita modu uygulanır. Kuvvet-Harita modunda, ilgi bölgeye dahil etmek için bir tarama boyutunu ayarlamak; uygun bir çözünürlük ayarlamak; tek bir güç eğrileri için seçilen gibi girinti parametrelerini ayarlamak, AFM sonra tanımlanan örnek alan üzerinde raster ve tek bir güç eğrileri almak Örnek bölgedeki her bir pikselde. 4. Veri Analizi Kaydedilen kuvvet eğrileri hücre sertliği hesaplamak için özel bir MATLAB prosedürü kullanılarak analiz edilmektedir. Aşağıdaki MATLAB prosedürün kısa bir açıklaması: <ol><li> . MATLAB programı temas noktası Lin ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir yöntemi kabul bir algoritma 29 kullanılarak (bkz. Şekil 1) z0 ve d0 koordine tanımlar: </li><li> Kadar ayarlamak için, kuvvet eğrisi her veri noktası için, ilgi noktasının solunda verilerin doğrusal bir uyum gerçekleştirmek ve Hertz modeli doğru (temas başlangıç ​​noktası olarak seçilen noktasını kullanarak) için uygun maksimum girinti (200-300 nm önerilir). </li><li> Her nokta için, her iki uyan göreli RMS hata hesaplamak ve bu değerleri toplamı. </li><li> Minimum toplam montaj hatası elde ediyor Nokta ilk noktası olarak seçilir. Not: Hesaplama zaman yerine doğrusal tüm güç eğrisi tarama daha altın bölüm arama uygulayarak azaltılabilir. </li><li> Örnek deformasyon δ ve kuvvet F girinti olarak hesaplanır: <img alt="Denklem 1"fo: içerik width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> En küçük kareler uydurma vs F uyacak şekilde uygulanır sonrası temas bölgesinde δ veri, z ≥ z 0, en Young modülü, hücrenin E ayıklamak için Hertz modeli için: <img alt="Denklem 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , V Poisson oranıdır. Not: δ numune kalınlığının (hücre yükseklik)% 10&#39;dan fazla olduğunda, ölçülen hücre sertliği tabaka sertliği ile etkilenir. Peri-nükleer bölgenin kalınlığı genellikle birkaç mikrometre civarındadır. Bu nedenle, F-δ eğrisinin sadece ilk 200-300 nm Hertz modeline uygundur. </li></ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Wagner, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Softness,+strength+and+self-repair+in+intermediate+filament+networks.">Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks.</a> Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model.">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells.">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).</li><li>Kasza, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A+is+essential+for+active+cell+stiffening+but+not+passive+stiffening+under+external+force.">Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force.</a> Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).</li><li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanics+as+an+indicator+of+cytoskeletal+structure+and+function.">Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).</li><li>Schafer, A., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+myosin+II+activity+on+stiffness+of+fibroblast+cells.">Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells.</a> Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).</li><li>Guck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deformability+as+an+inherent+cell+marker+for+testing+malignant+transformation+and+metastatic+competence.">Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence.</a> Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).</li><li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer.">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).</li><li>Rotsch, C., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+changes+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+in+fibroblasts:+an+atomic+force+microscopy+study.">Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.</a> Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+extract+selectively+targets+nanomechanics+of+live+metastatic+cancer+cells.">Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 22, 215101 (2011).</li><li>Hoffman, B. D., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+dissecting+the+physical+responses+of+cells+to+force.">Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).</li><li>Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consensus+mechanics+of+cultured+mammalian+cells.">The consensus mechanics of cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).</li><li>Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology,+stress+fluctuations,+and+active+behavior+of+living+cells.">Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells.</a> Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+probes+length+scale+dependent+rheology.">Microrheology probes length scale dependent rheology.</a> Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).</li><li>Deng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+slow+dynamics+of+the+cytoskeleton.">Fast and slow dynamics of the cytoskeleton.</a> Nature Materials. 5, 636-640 (2006).</li><li>Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+Aspiration+of+Substrate-attached+Cells+to+Estimate+Cell+Stiffness.">Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness.</a> J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).</li><li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+living+cells.">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).</li><li>Levental, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+indentation+device+for+measuring+micrometer-scale+tissue+stiffness.">A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness.</a> J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).</li><li>Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+viscoelastic+properties+of+thin+regions+of+fibroblasts+using+atomic+force+microscopy.">Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+elastic+properties+of+biological+samples+with+the+AFM.">Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine &amp; Biology Society. 16, 47-57 (1997).</li><li>Crocker, J. C., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+and+two-point+microrheology+in+cells.">Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).</li><li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy.">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates.">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).</li><li>Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+l929+cells+measured+by+atomic+force+microscopy:+Effects+of+anticytoskeletal+drugs+and+membrane+crosslinking.">Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking.</a> Scanning. 20, 389-397 (1998).</li><li>Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+viscoelastic+properties+of+human+platelets+with+the+atomic+force+microscope.">Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).</li><li>Levy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers:+thermal+fluctuations+and+other+methods.">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).</li><li>Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cell+expression+of+genes+implicated+in+proliferative+vitreoretinopathy+is+influenced+by+substrate+elastic+modulus.">Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).</li><li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+elasticity:+Measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation.">Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li><li>Lele, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+cell+mechanics+and+mechanotransduction.">Tools to study cell mechanics and mechanotransduction.</a> Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).</li><li>A-Hassan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy.">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+approach+to+analyzing+mechanical+properties+of+endothelial+cells+probed+by+atomic+force+microscopy.">Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).</li><li>Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+nanomechanics+of+live+neuronal+growth+cones+analyzed+by+atomic+force+microscopy.">Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).</li><li>Byfield, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+filamin+A+prevents+cells+from+responding+to+stiffness+gradients+on+gels+coated+with+collagen+but+not+fibronectin.">Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin.</a> Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).</li><li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+analysis+of+human+metastatic+cancer+cells.">AFM-based analysis of human metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 19, 384003 (2008).</li><li>Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+elasticity+in+biological+gels.">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li><li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+physics+of+the+cytoskeleton.">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State &amp; Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy.">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).</li><li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

AFM girinti yöntemi canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için avantajları vardır. Piconewton düzeyinde 32 kuvvetleri ölçebilirsiniz manyetik büküm sitometri ve optik cımbız, daha az hassas olsa, AFM kuvvet aralığı ile karşılaştırılabilir pico-Newton onlarca nano-Newton yüzlerce kadar örnekleri, gelen direnç kuvveti algılayabilir Mikropipet 19 kullanarak hücrelere uygulanabilir. Kuvvet Bu dizi hücre 19 her türlü ölçülebilir deformasyonl...

Tek tek hücrelerin kendi çevre hücre dışı matris mekanik özellikleri, özellikle sertlik, (ECM), hücre büyümesi, motilite, bölünmesi, farklılaşma ve doku homeostazında de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri için kritiktir. 1 Bu hücre mekanik sertliği esas olarak kararlı olduğu kanıtlanmıştır Aktin ve arafilamentlerin in vitro şebekelerinde üzerinde mekanik testlerden iskeleti, aktin ve ara filamentler ve onlarla ilişkili diğer proteinlerden, özellikle ağ. 2 Sonuç hücre mekanik iskelet yapısı ve ön-stres büyük ölçüde bağlı olduğunu düşündürmektedir hücre iskeleti. canlı hücrelerin 3-5 Sertlik sonra iskelet yapısı 6, miyozin aktivite 7 ve diğer birçok hücresel süreçleri değerlendirmek için bir dizin olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, hücre mekanik özelliklerinde değişiklikler de genellikle yakından ilişkili olduğu bulunmuşturtümör oluşumu ve metastaz gibi çeşitli hastalık koşulları ile ated 8-10 İzleme canlı hücrelerin mekanik sertliği dolayısıyla hücre fizyolojisi izlemek için yeni bir yol sağlayabilir,. tespit etmek ve hastalıkları 8 teşhis etmek,. ve ilaç tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için 11 , 12 Parçacık izleme microrheology, 13-16 manyetik büküm sitometri, 17 mikropipet aspirasyon 18,19 ve microindentation 20-22 dahil olmak üzere birden çok yöntem hücrelerin esnekliğini ölçmek için geliştirilmiştir. Parçacık izleme microrheology hücre iskeleti içindeki hücreler ya da indirgeme işaretleri enjekte mikrondan küçük floresan parçacıkların birinin termal vibrasyonlar izler. Hücreler 23 elastik ve yapışkan özelliklerini salınım-kayıp teoremi kullanılarak ölçülen partikül değiştirmeler hesaplanır. 14,23 Bu yöntem sağlar: yerel eş zamanlı ölçümleriniBir hücrede farklı yerlerde yüksek uzaysal çözünürlüğü ile mekanik özellikleri. Bununla birlikte, parçacıkların hücre içine floresan enjekte hücresel işlevde değişikliği, hücre iskeletinin yapısı, ve bu nedenle hücre mekanik yol açabilir. Mikropipet aspirasyon yöntemi pipet içine hücre zarı küçük bir parça emmek için 1 ila 5 mikron arasında değişen çaplı bir mikropipet negatif basınç uygular. Hücre sertliği uygulanan negatif basınç, hücre membranı ve deformasyonu. 18 Bu yöntem ile hesaplanır, ancak, hücre boyunca sertliğinin heterojen dağılımı tespit edemez. Manyetik büküm sitometri (MTC) hücre zarı bağlı süper paramanyetik boncuk tork üretmek için manyetik alan uygulanır. 17 Hücre sertliği uygulanan tork ve hücre zarının büküm deformasyon arasındaki ilişki bu yöntemde elde edilir. Bu MTC yöntemde manyetik boncuk yerini kontrol etmek zordur, ve aynı zamanda bir challengiyüksek çözünürlüklü büküm deformasyon karakterize etmek ng. Microindentation hücre içine yumruk iyi tanımlanmış geometri ile bir delici geçerlidir. Girinti kuvvet ve hücrelerde ortaya çıkan girinti genellikle Hertz modelinin tahmin izleyin. Hücre Young modülü Hertz modeli onları takarak kuvvet girinti eğrileri hesaplanabilir. Bu yöntem yaygın olarak temas noktası belirleme, Hertz modelin uygulanabilirliği ve fiziksel olarak hücrelere zarar potansiyeline belirsizlik olarak sınırlamalar rağmen doku ve hücrelerin mekanik özelliklerini test etmek için uygulanmıştır. Microindentaion 20 için birçok cihaz arasında, bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM), ticari olarak mevcuttur ve yaygın olarak canlı hücreler ve dokuların 21,24-27 mekanik özelliklerini karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu kağıt hücre mekaniği karakterize bir Sığınma MFP3D-Bio AFM kullanarak prosedürü göstermektedir. AFM değil üzerindely hücrelerin yüksek çözünürlüklü topografya sağlar ama aynı zamanda yaygın doku hücrelerinin mekanik özelliklerini karakterize etmek için uygulanmıştır. AFM girinti çalışma prensibi Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. AFM konsol üzerinde birkaç mikrometre hücre yaklaşımlar, hücre ile temas, girintiler hücre konsol sapma önceden seçilmiş bir ayar noktasına ulaşacak şekilde ve uzak hücreden çeker. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bu süreç sırasında dirsekli bükülme konumu bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir. Hücre ile temas etmeden önce, konsol belirgin bir sapma olmadan ortamda hareket eder. Hücre, konsol virajlı ve sapma sinyali artar girinti zaman. Çıkma kendi saptırma hücreye tatbik edilen kuvvet ile orantılıdır, böylece elastik kirişler olarak modellenmiştir. En fazla konsol sapma ayarlayarak, örnek uygulanan kuvvetin maksimum büyüklüğü d önlemek için sınırlıdırhücrelere ermeden. Hücre içine ucu girintiler, hücre sertliği ayıklamak için hertz modele uygundur Şekil 1, c noktadan noktaya b kuvvet eğrisinin kısmı. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Şekil 1. AFM microindentation ve kuvvet eğrisinin yorumlanması İllüstrasyon. Üst paneli piezo tarayıcı tarafından tahrik AFM konsol hareketini gösterir. Konsol, z ve konsol sapma sinyalini d dikey konumu işlemi sırasında kaydedilir. Konsol noktası, hücrenin üstündeki birkaç mikrometre başlar. Hücre yaklaşırken iken uç hücre ile temas alanına, b ulaşıncaya kadar, örnek girinti δ sıfır olarak kalır. Arsa nokta b koordinatları kritik değerlerdirveri analizi için, (z 0, d 0&gt;) ile gösterilir. B c, hücre içine konsol girintiler konsol sapma hedeflenen maksimum girinti gücü ve sürekli konsol bahar arasındaki oran olarak ayarlanmış bir ayar noktası, ulaşana kadar. Sapma sinyali önceden ayarlanmış maksimum değeri ulaştığında, konsol sonra, hücreden genellikle uç-örnek yapışma nedeniyle aşağıya çekilebilir noktası d, çekilmiş hücre ve döner e onun ilk konuma ayırır edilir. Sağ panel girinti ve kaydedilen z ve d sinyal arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sol alt panelde bulunan yay sabiti m / 0.07N olarak ölçüldüğü bir temsilcisi kuvveti eğrisi, bir konsol en fazla girinti, bir çizimidir fazla girinti kuvvet uygulanır ve böylece 17 nm olarak ayarlanmıştır Örnek 1.2 nN olduğunu. Girinti sırasında önemli yerlerde işaretlenmiştir.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

Hücre ve hücre dışı matriks (ECM) mekanik özellikleri kök hücre farklılaşması, tümör oluşumu ve yara iyileşmesi gibi birçok biyolojik süreçlerde önemli rol oynar. Hücreler ve ECM sertliği değişiklikler genellikle hücre fizyolojisi veya doku hastalıklarında değişim işaretleri vardır. Bu nedenle, hücre sertlik hücre kültürlerinin durumunu değerlendirmek için bir endekstir. Hücre ve dokuların sertlik ölçmek için uygulanan yöntemler çok sayıda arasında, bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak mikro girinti güvenilir canlı hücrelerin sertliği ölçmek için bir yol sağlar. Bu yöntem, yaygın olarak metal yüzeyler yumuşak biyolojik dokular ve hücreler arasında değişen çeşitli malzemeler için mikro ölçekli sertliği karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu yöntemin temel prensibi seçilen bir geometri AFM ucu olan bir hücre girinti ve AFM dirsekli bükme ile uygulanan kuvvet ölçmektir. Hertz moduna kuvvet girinti eğrisi takılmasıilgili uç geometrisi l malzeme sertliği kantitatif ölçümler verebilir. Bu kağıt AFM kullanarak canlı hücrelerin sertliği karakterize etmek için prosedürü göstermektedir. Bir MATLAB rutin kullanarak AFM kalibrasyon süreci, kuvvet eğrisi satın alma ve veri analizi de dahil olmak üzere önemli adımlar gösterilmektedir. Bu yöntemin sınırlamaları da tartışılmıştır.

Şekil 2a sırasıyla plastik yüzey, Young modülü 3000 Pa ve 17.000 Pa poliakrilamid jel, kültüre 3T3 fibroblast alınan üç temsilcisi güç eğrilerini gösterir. Dikkatlice eğrileri temas noktaları tespit edilmesinden sonra, hücre deformasyon fonksiyonu olarak girinti kuvvet Şekil 2b&#39;de çizilir. 0.3 nN, 3 kPa poliakrilamid jel üzerinde kültüre bir hücreye bir piramit şekli ucu girintiler 3 mikrometre daha küçük büyüklükte bir kuvvet altında. Buna karşılı...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.6K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.