저자는이 논문에서 사용 된 세포주를 제공하기 위해 펜실베니아 대학에서 박사 폴 Janmey 감사합니다. QW는 AFM 기술에 대한 통찰력있는 논의를 위해 JF 바이 필드와 에반 앤더슨을 인정합니다.

1. 캔틸레버의 스프링 상수 보정 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 AFM으로 캔틸레버를 넣습니다. 그것은 어떤 실험을하기 전에 에탄올로 캔틸레버 홀더를 청소해야합니다. 이 AFM 측정시 문화 세균 오염을 제한하는 데 도움이됩니다. </li><li> InvOLS을 (역 광 레버 감도) 보정합니다. 이 매개 변수는 캔틸레버 편향 나노 미터 당 다이오드 응답 (볼트)의 양을 설명합니다. </li><li> 샘플 무대에 깨끗한 유리 슬라이드를로드 한 후 제조업체의 지침에 따라 AFM 헤드를 설치하고 레이저 빔과 정렬을 조정합니다. 유리 슬라이드에 AFM 팁을 갖습니다. </li><li> 압전 철회로, -2의 포토 다이오드 독서 미러를 다시 정렬 V. +2의 트리거 포인트 (최대 다이오드 응답)에 힘 분광 측정을 수행 V. </li><li> 압전 철회로, -2의 포토 다이오드 독서 미러를 다시 정렬 V. FO를 수행+2 V. 노트의 트리거 포인트 (최대 다이오드 응답)로 경찰 분광 측정 : 여기 전압 값은 정신 병원 AFM에 따라 다릅니다. 이 값은 제조업체에서 제공하는 사양에 따라 설정해야합니다. 데이터 수집이 완료되면, 힘 곡선의 확고한 접촉 영역을 확대. V / 뉴 멕시코에있을 것이다 경사를 찾기 위해이 지역에 선형 피팅을 수행합니다. 이 값의 역수는 캔틸레버 다이오드 앙상블의 광 감도를 설명합니다. </li><li> 0의 무료 편향에 거울 정렬을 다시 V. </li><li> 캔틸레버의 스프링 상수 보정합니다. 열 조정 방법은 캔틸레버 28 스프링 상수를 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> InvOLS을 보정 한 후, 팁과 샘플 사이의 상호 작용이 없다는 것을 같은 샘플 단계에서 스캐너를 멀리 올립니다. </li><li> 열 데이터를 캡처 시작합니다. 이 과정에서, 외팔보의 열 진동 기록 병입니다라. AFM 소프트웨어는 열 진동 및 데이터 창에서 플롯을의 파워 스펙트럼을 분석합니다. </li><li> 데이터 수집의 몇 초 후에, 스프링 상수를 결정하기 위해 낮은 주파수 (기본 공명) 피크를 중심으로 데이터 세그먼트에 적합을 수행합니다. </li></ol> 2. 샘플을로드 <ol><li> AFM 무대에서 접시 히터 액세서리를 설치, 이미 장착되지 않은 경우. </li><li> 37 ° C 온도를 설정하고 안정적​​인 열적 평형에 도달하도록 시스템을위한 20 분을 기다립니다. </li><li> AFM 무대에서 배양 접시를 놓고 접시 히터와 함께 제공되는 클램프를 사용하여 고정합니다. 그것은 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세포에 외상을 방지하기 위해 무대에 배치 사이의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 30 분 이상 측정, CO 2 독립 매체는 일반 문화 매체를 대체하는 데 사용되어야한다. </li><li> T의 끝을 37 ° C 배양 배지의 작은 방울을 적용그는 AFM 캔틸레버와 팁 그냥 액체에 빠져들 때까지 AFM 헤드를 낮 춥니 다. </li><li> 상위 뷰 CCD 카메라를 사용하여 외팔보 (액체 정렬 때문에 매체의 굴절률의 변화, 공기 다를 것이다)에 레이저 빔을 맞 춥니 다. </li><li> 배양 접시의 청정 지역에서 AFM 팁을 갖습니다. </li><li> 액체 환경에서 캔틸레버 감도, 위에서 설명한대로 InvOLS 교정을 수행합니다. </li></ol> 참고 : 세포가 수화를 배양하는 경우)는, InvOLS의 교정은 세포 배양 매체로 가득 배양 접시의 바닥면에 대하여 사전에 수행해야합니다. 세포 샘플을 전환 할 때 특별한주의가 캔틸레버와 레이저 빔 정렬을 변경하지 지불해야합니다. B) InvOLS는 레이저 정렬에 변화가있을 때마다 다시 보정해야합니다. C) 그것은 또한 몇개의 교정 곡선의에서 값의 평균으로 InvOLS을하는 것이 좋습니다각 교정은 다른 InvOLS를 생성 인스. InvOLS의 변동은 평균값을 비교하지만, 작은 수 있습니다. 예를 들어, 100 배 0.06 N 액체 / m의 스프링 상수와 브루 커 DNP-10 캔틸레버를 교정하는 0.5 나노 / 표준 편차, 66.3 nm의 / V의 평균 InvOLS 값을 생성 V. 3. 셀의 들여 쓰기 힘 곡선 수집 <ol><li> 들여 쓰기 셀을 선택합니다. 광학 현미경의 도움으로, 끝이 요정 핵 지역에 위치한되도록 셀 위의 캔틸레버를 배치하는 단계를 이동합니다. 캔틸레버의 위치를​​ 정밀 조정은 X와 Y 스캐너에 오프셋을 적용하여 수행 할 수 있습니다. 참고 : AFM 캔틸레버가 대상 셀을 선택 샘플 스테이지를 이동하는 동안 시료 표면에서 인출 할 수있다. 시료 표면이 평평하지 않을 수 있기 때문에 이것은 샘플로 노크에서 캔틸레버를 보호합니다. </li><li> 분광학 모드를 강제로 전환합니다. 들여 쓰기를 설정유체 효과를 방지하기 위해 충분히 낮은 1-10 μm의 / 초 범위 내 속도. </li><li> 세포에 손상을 방지하기 위해 최대의 들여 쓰기 힘을 제한하는 편향 트리거 포인트를 설정합니다. 편향 신호의 모든 드리프트를 교정 할 상대 트리거링 옵션을 선택합니다. 2 윈은의 최대 힘은 대부분의 샘플에 대한 좋은 출발점입니다. 이 값은, 그러나, 샘플 강성에 따라 조정되어야한다. 부드러운 샘플 낮은 값은 샘플 과도한 들여 쓰기를 방지하기 위해 사용되어야한다. 뻣뻣한 샘플은 높은 값이 측정 들여 쓰기를 생성하는 데 사용되어야한다. </li><li> 끝이 완전히 힘의 측정과 세포에서 분리 될 수 있도록 충분히 큰 힘 거리를 설정합니다. 보통, 힘 거리가 5 μm의에서 설정됩니다. </li><li> 하나의 힘 곡선을 취할 수있는 AFM을 명령. </li><li> 각 셀의 요정 핵 영역의 다른 위치에서 적어도 세 힘 커브를 수집합니다. 그것은 여러를 취할 유용하지만너무 많은 힘 곡선을 가지고 신뢰할 수있는 통계 자료에 대한 각 셀 곡선, AFM 프로브에서 때문에 스트레스 세포 강성의 변화로 이어질 수 있습니다. </li><li> 데이터 수집이 완료되면, 팁을 철회하고, 특정 샘플 조건에서 세포의 강성 좋은 통계 데이터를 필요에 따라 반복은 많은 셀 3.1-3.6 단계를 반복합니다. 보통 30 세포는 각 조건에 대해 측정됩니다. </li></ol> 단일 셀 내에서 강성 분포의 특성을 강제 맵 모드가 적용됩니다. 강제 맵 모드에서, 관심의 영역을 포함하는 스캔 크기를 설정, 적절한 해상도를 설정하고, 하나의 힘 곡선 선택한 것과 같은 들여 쓰기 매개 변수를 설정, AFM는 정의 된 샘플 영역에 걸쳐 래스터하고 하나의 힘 곡선을 샘플 영역의 각 픽셀에서. 4. 데이터 분석 기록 된 힘 곡선은 세포의 강성을 계산하는 사용자 정의 MATLAB 프로 시저를 사용하여 분석. 다음은 MATLAB 절차에 대한 간략한 설명입니다 : <ol><li> . MATLAB 프로그램은 접점이 린 등에 의해 게시 방법에서 채택 된 알고리즘 29을 사용하여 (그림 1 참조) Z0와 D0 좌표를 식별합니다 : </li><li> 최대 세트, 힘 곡선의 각 데이터 포인트에 대해, 관심 지점의 왼쪽에있는 데이터의 선형 피팅을 수행하고, 헤르츠 모델은 오른쪽 (접점의 초기 지점으로 선택한 점 사용)에 적합 최대 들여 쓰기 (200-300 nm의 권장). </li><li> 각 포인트에 모두 적합의 상대 RMS 오차를 계산하고이 값을 합계입니다. </li><li> 최소 총 피팅 오류를 달성 점 접촉의 초기 점으로 선택됩니다. 참고 : 계산 시간이 아니라 선형 전체 힘 곡선을 스캔보다 황금 섹션 검색을 구현하여 줄일 수 있습니다. </li><li> 샘플 변형 δ와 힘 F를 들여 다음과 같이 계산된다 : <img alt="식 1"FO : 콘텐츠 너비 = &quot;3.073in&quot;FO : SRC = &quot;/이 files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot;/&gt; </li><li> 최소 제곱 피팅 대 F에 맞게 적용 포스트 접촉 영역에서 δ 데이터, Z ≥ Z 0,의 탄성 계수, 세포의 E를 추출하는 헤르츠 모델 : <img alt="식 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> 여기서 V는 푸 아송의 비율입니다. 참고 : δ는 샘플의 두께 (셀 높이)의 10 % 이상이면, 측정 셀 강성 기판 강성에 의해 영향을받습니다. 요정 핵 영역의 두께는 일반적으로 몇 마이크로 미터의 순서입니다. 따라서, F-δ 곡선의 첫 번째 200 ~ 300 nm의은 헤르츠 모델에 적합하다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+elasticity+in+biological+gels.">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li><li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+physics+of+the+cytoskeleton.">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State &amp; Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy.">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).</li><li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

AFM 들여 쓰기 방법은 살아있는 세포의 기계적 성질을 특성화하는 장점이 있습니다. piconewton 레벨 32 힘을 측정 할 수있는 자기 왜곡 세포 계측법 및 광학 핀셋보다 덜 민감이기는하지만, AFM은 힘의 범위를 비교 피코 뉴턴의 수십에서 나노 뉴턴의 수백에 이르는 샘플에서 저항 힘을 감지 할 수 마이크로 피펫 19을 사용하여 셀에 적용 할 수 있습니다. 힘의이 범위는 셀 19의 ?...

각각의 세포와 그 주변의 세포 외 기질의 기계적 특성, 특히 강성 (ECM)은 세포 성장, 운동, 분열, 분화 및 조직 항상성 등 많은 생물 학적 과정에 중요한 1. 그것은 세포 기계적 강성은 주로에 의해 결정되는 증명되었다 악틴 및 중간 필라멘트의 체외 네트워크에서의 기계적 시험의 골격, 악틴 및 중간 필라멘트 및 그와 관련된 다른 단백질 특히 네트워크 2. 결과는 세포 역학의 골격 구조와 미리 스트레스에 크게 의존하는 것이 좋습니다 세포 골격. 살아있는 세포의 3-5 강성은 다음 골격 구조 6, 미오신 활동 7 및 다른 많은 세포 과정을 평가하는 지표로 간주됩니다. 더 중요한 것은, 세포 기계적 성질의 변화는 종종 밀접하게 연관된다는 것을 발견하는종양의 형성과 전이 등 다양한 질병 상태와 ated 8-10 모니터링 살아있는 세포의 기계적 강성 따라서 세포 생리학을 모니터링하는 새로운 방법을 제공 할 수 있습니다. 감지 및 질병에게 8을 진단;. 및 약물 치료의 효과를 평가하기 11 12 입자 추적 미세 유변학, 13-16 자기 왜곡 세포 계측법, 17 micropipette의 열망 18,19 및 microindentation 20-22 등 다양한 방법이 세포의 탄력성을 측정하기 위해 개발되었습니다. 입자 추적 미세 유변학은 세포의 cytoskeleton 세포 내부 또는 기준점 표지에 주입 미크론 형광 입자 하나의 열 진동을 추적합니다. 세포의 23 탄성과 점성 특성이 변동 방산 정리를 사용하여 측정 된 입자의 변위에서 계산됩니다. 14,23이 방법은 수 지역의 동시 측정셀에 다른 장소에서 높은 공간 해상도를 가진 기계적 성질. 그러나 세포에 형광 입자를 주입하면 세포 기능의 변화, 세포 골격 구조, 따라서 세포 역학으로 이어질 수 있습니다. micropipette의 열망 방법은 피펫으로 세포막의 작은 조각을 빨아 1 ~ 5 μm의에 이르기까지 직경 마이크로 피펫에 부정적인 압력을 적용합니다. 세포의 강성이 적용 부정적인 압력과 세포막의 변형. 18이 방법은 계산한다, 그러나, 세포를 통해 강성의 불균일 분포를 감지 할 수 없습니다. 자기 왜곡 세포 계측법 (MTC)는 세포막에 부착 된 초 상자성 구슬 토크를 생성하는 자기장을 적용합니다. 17 셀 강성이 적용되는 토크와 세포막의 왜곡 변형 사이의 관계에서이 방법으로 파생됩니다. 그것은 MTC 방법에 자석 구슬의 위치를​​ 제어하기 어렵고, 또한 challengi입니다높은 해상도 왜곡 변형의 특성을 NG. Microindentation은 세포에 구멍을 뚫을 수있는 잘 정의 된 지오메트리 압자를 적용합니다. 들여 쓰기 힘과 세포의 결과 들여 쓰기는 종종 헤르츠 모델의 예측을 수행합니다. 세포의 영의 계수는 헤르츠 모델로 피팅에 의해 강제 압입 곡선으로부터 계산 될 수있다. 이 방법은 널리 접점 결정, 헤르츠 모델의 적용, 물리적으로 세포를 손상하는 가능성의 불확실성 등의 한계에도 불구하고 조직과 세포의 기계적 특성을 시험하기 위하여 적용되었습니다. microindentaion 20 많은 장치 사이에서 원자 힘 현미경 (AFM)은 시판되고 널리 살아있는 세포와 조직 21,24-27의 기계적 성질을 특성화하기 위해 적용되었습니다. 이 논문은 세포 역학의 특성을 정신 병원 MFP3D 바이오 AFM을 사용하는 절차를 보여줍니다. AFM하지에LY 세포의 고해상도 지형을 제공하지만 또한 널리 조직 세포의 기계적 특성을 특성화하기 위해 적용되었습니다. AFM 들여 쓰기의 원리는 그림 1에 나와 있습니다. AFM 캔틸레버는 위의 몇 마이크로 미터에서 셀을 접근, 세포와의 접촉을 만든다; 들여 쓰기 셀 캔틸레버 편향이 미리 선택된 세트 포인트에 도달 할 수 있도록하고, 멀리 셀에서 가져옵니다. 그림 1과 같이이 과정에서 캔틸레버의 처짐은 그 위치의 함수로 기록됩니다. 세포와 접촉하기 전에, 캔틸레버는 명백한 편향하지 않고 중간에 이동합니다. 셀 캔틸레버 굴절과 편향 신호 증가에 들여 쓰기를합니다. 캔틸레버들은 편향은 셀에 적용된 힘에 비례하도록 탄성 빔으로 모델링된다. 최대 캔틸레버 편향을 설정하여 샘플에 적용되는 힘의 최대 크기는 D를 방지하기 위해 제한됩니다세포 amage. 셀에 팁 들여 쓰기는 세포의 강성을 추출 헤르츠 모델에 적합하다 그림 1에서 C를 가리 B 지점에서 힘 곡선의 부분입니다. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> 그림 1. AFM의 microindentation와 힘 곡선의 해석의 그림입니다. 상단 패널은 피에조 스캐너에 의한 AFM 캔틸레버의 움직임을 보여줍니다. 캔틸레버 Z와 캔틸레버 편향 신호 D의 수직 위치는 과정에서 기록됩니다. 캔틸레버 포인트, 셀 위의 몇 마이크로 미터부터 시작합니다. 셀을 접근하면서 끝이 세포와 접촉에 와서 B 지점에 도달 할 때까지, 샘플 들여 쓰기 δ 제로 남아있다. 플롯의 점 B의 좌표는 중요한 값이다데이터 분석, (Z 0, D 0&gt;)로 표시. B에서 C로, 셀에 캔틸레버 들여 쓰기 캔틸레버 편향 대상으로 최대의 들여 쓰기 힘과 상수 캔틸레버 봄의 비율로 설정되어 세트 포인트에 도달 할 때까지. 편향 신호가 설정 한 최대 값에 도달하면, 캔틸레버 다음 셀은 종종 팁 - 샘플 부착으로 인해 아래를 뽑아 점 D에 철회 세포를 반환에서 전자의 초기 위치로 분리되어 있습니다. 오른쪽 패널은 들여 쓰기 및 기록 Z와 D 신호 사이의 관계를 보여줍니다. 왼쪽 하단 패널에있는 스프링 상수가 M / 0.07N로 측정하는 대표 힘 곡선, 외팔보의 최대 들여 쓰기의 음모로는 최대의 들여 쓰기 힘에 적용될 수 있도록 17 나노로 설정되어 있습니다 예제 1.2 윈은입니다. 들여 쓰기를하는 동안 키 위치가 표시됩니다.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

세포와 세포 외 기질 (ECM)의 기계적인 특성은 줄기 세포 분화, 종양 형성, 상처 치유 등 많은 생물 학적 과정에 중요한 역할을한다. 세포와 ECM의 강성의 변화는 종종 세포 생리학 또는 조직의 질병의 변화의 징후입니다. 따라서, 세포 강성 세포 배양의 상태를 평가하는 인덱스입니다. 세포와 조직의 강성을 측정하는 적용 방법의 무리 사이, 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 마이크로 들여 쓰기 안정적으로 살아있는 세포의 강성을 측정하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 널리 금속 표면에서 부드러운 생물학적 조직과 세포에 이르기까지 다양한 재료에 대한 마이크로 스케일 강성의 특성을 적용하고있다. 이 방법의 기본 원리는 선택한 형상 AFM 팁과 셀을 들여 쓰기 AFM 캔틸레버의 휨에서 적용되는 힘을 측정하는 것입니다. 헤르츠 모드로 강제 압입 곡선을 피팅해당 팁 지오메트리 난 재료 강성의 정량적 측정을 제공 할 수 있습니다. 이 논문은 AFM을 이용하여 살아있는 세포의 강성을 특성화하는 과정을 보여줍니다. MATLAB 루틴을 사용하여 AFM 교정 과정, 강제 곡선 수집, 데이터 분석 등 주요 단계를 설명합니다. 이 방법의 제한 사항에 대해서도 설명합니다.

그림 2a는 각각 플라스틱 표면, 영의 계수 3000 아빠와 17,000 아빠의 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 3T3 섬유 아세포에서 가져온 세 가지 대표적인 힘 곡선을 보여줍니다. 조심스럽게 곡선의 접점을 식별 한 후, 세포 변형 함수로 들여 힘은 그림 2B에 나타내었다. 0.3 윈은, 3 kPa의 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 세포에 피라미드 모양의 팁 들여 3 마이크로 미터보다 작은 크?...

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.6K 조회수.  Worcester Polytechnic Institute. 이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

연구

생체공학

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

입자 추적 Microrheology에 의한 바이오 필름의 기계적 성질의 제자리 매핑에서

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...