Die Autoren danken Dr. Paul Janmey an der University of Pennsylvania für die Bereitstellung von Zelllinien in diesem Papier verwendet. QW auch anerkennen, JF Byfield und Evan Anderson für ihre aufschlussreichen Diskussionen über AFM-Techniken.

1. Kalibrieren Sie die Federkonstante der Cantilever <ol><li> Legen Sie den Ausleger in die AFM gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es ist notwendig, die Cantileverhalters mit Ethanol gereinigt vor allen Experimenten. Dies wird Ihnen helfen zu begrenzen bakterielle Kontamination der Kultur in den AFM-Messungen. </li><li> Kalibrieren InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity). Dieser Parameter beschreibt die Menge der Photodiode Antwort (Volt) pro Nanometer Cantileverauslenkung. </li><li> Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die Probe Bühne, installieren Sie dann die AFM Kopf und stellen Sie den Laserstrahl und die Ausrichtung nach den Anweisungen des Herstellers. Rasten Sie die AFM-Spitze auf dem Objektträger. </li><li> Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie eine Kraft-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V. </li><li> Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie einen foRCE-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V. Hinweis: Die Spannungswerte hier sind spezifisch für die Asylum AFM. Dieser Wert sollte nach den Vorgaben des Herstellers vorgesehen eingestellt werden. Nach der Datenerfassung abgeschlossen ist, in der Firma-Kontaktbereich der Kraftkurve vergrößern. Führen Sie eine lineare Anpassung in diese Region, um die Steigung, die in V / nm finden. Der Kehrwert dieser Wert beschreibt die optische Empfindlichkeit des Auslegers-Photodiode Ensemble. </li><li> Setzen Sie den Spiegel Ausrichtung zu einer freien Auslenkung von 0 V. </li><li> Kalibrieren der Cantilever Federkonstante. Ein thermischer-tune Verfahren wird verwendet, um die Federkonstante der Ausleger 28 zu bestimmen. </li><li> Nach der Kalibrierung des InvOLS, erhöhen den Scanner von dem Probentisch derart, dass es keine Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe. </li><li> Beginnen Erfassung thermischen Daten. Dabei ist die thermische Schwingung des Freiträger Recorded. Die AFM-Software analysiert ein Leistungsspektrum eines solchen thermischen Schwingungen und zeichnet es in einem Datenfenster. </li><li> Nach ein paar Sekunden der Datenerfassung, führen Sie eine Anpassung an die Daten-Segment an der niedrigsten Frequenz (Grundresonanz) Spitze zu bestimmen, die Federkonstante zentriert. </li></ol> 2. Laden der Probe <ol><li> Installieren Sie die Dish Heizung Zubehör auf dem AFM Bühne, wenn nicht bereits ausgestattet. </li><li> Die Temperatur auf 37 ° C und für 20 Minuten warten, bis das System eine stabile thermische Gleichgewicht zu erreichen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale auf dem AFM Bühne und sichern Sie es mit der Schelle mit der Schale Heizung vorgesehen. Es ist wichtig, um die Zeit zwischen Entnahme der Schale aus dem Inkubator und der ihn in der Phase, die Traumatisierung der Zellen zu vermeiden, zu minimieren. Für Messungen länger als 30 min sollte CO 2 eigenständiges Medium verwendet werden, um den normalen Kulturmedium ersetzen. </li><li> Tragen Sie einen kleinen Tropfen von 37 ° C Kulturmedium an der Spitze von Ter AFM-Cantilever, und senken Sie die AFM Kopf, bis die Spitze gerade in Flüssigkeit eingetaucht. </li><li> Mit dem Top-View CCD-Kamera, richten Sie den Laserstrahl auf den Cantilever (die Ausrichtung in flüssiger wird anders sein als in der Luft, wegen der Änderung des Brechungsindex des Mediums). </li><li> Rasten Sie die AFM-Spitze auf einer sauberen Fläche von der Kulturschale. </li><li> Durchführen der Kalibrierung der InvOLS wie oben für den Ausleger Empfindlichkeit in der flüssigen Umgebung beschrieben. </li></ol> Hinweis: a) Wenn Zellen auf Hydrogele kultiviert werden, die Kalibrierung der InvOLS sollten im Voraus gegen die Bodenfläche einer Kulturschale mit Zellkulturmedium gefüllt durchgeführt werden. Beim Umschalten auf Zellproben, hat besondere Aufmerksamkeit zu zahlen, um nicht die Laserstrahl Ausrichtung des Auslegers werden. b) InvOLS muss neu kalibriert, wenn es eine Änderung in der Laserausrichtung werden. c) Es wird auch empfohlen, InvOLS als Durchschnitt der Wert nehmen aus mehreren Eichkurven, seit jede Kalibrierung erzeugt eine andere InvOLS. Die Variation in InvOLS ist jedoch gering im Vergleich zu dem Mittelwert. Zum Beispiel, Kalibrieren eines Bruker DNP-10 Freischwinger mit Federkonstante 0,06 N / m in Flüssigkeit durch 100 mal produzieren einen mittleren Wert von 66,3 InvOLS nm / V, mit einer Standardabweichung von nur 0,5 nm / V. 3. Sammeln Kraftkurven of Cell Einzug <ol><li> Markieren Sie eine Zelle für den Einzug. Mit Hilfe des optischen Mikroskops, zum Bewegen der Plattform, um den Ausleger über der Zelle so zu positionieren, daß die Spitze in der peri-Kerne Region befindet. Eine genaue Einstellung der Position des Auslegers kann durch Aufbringen Offsets auf die X-und Y-Scannern durchgeführt werden. Hinweis: Die AFM-Cantilever muss von der Probenoberfläche zurückgezogen werden beim Bewegen der Probe Bühne, um eine Zielzelle auszuwählen. Dies schützt den Ausleger von Klopfen in der Probe, da die Probenoberfläche eventuell nicht flach. </li><li> Wechseln Sie zu Spektroskopie-Modus zu erzwingen. Stellen Sie den EinzugRate im Bereich von 1-10 um / sec, niedrig genug ist, um hydrodynamischen Effekte zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie die Ablenkung Triggerpunkt, der die maximale Eindruckkraft begrenzt, um Schäden an Zellen zu vermeiden. Wählen Sie die Relative Auslösung Option, die für jeden Drift im Ablenksignal korrigieren. Eine maximale Kraft von 2 nN ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Proben. Dieser Wert sollte jedoch nach der Probe Steifigkeit eingestellt werden. Für weiche Proben einen niedrigeren Wert sollte verwendet werden, um übermäßige Vertiefung der Probe zu vermeiden. Für steife Proben einen hohen Wert sollte verwendet werden, um messbare Vertiefung erzeugen. </li><li> Stellen Sie die Kraft Abstand groß genug, um sicherzustellen, dass die Spitze vollständig aus der Zelle zwischen Kraftmessungen abgenommen werden. Üblicherweise wird die Kraft-Weg bei 5 um eingestellt. </li><li> Befehl die AFM zu einer einzigen Kraft Kurve zu nehmen. </li><li> Sammeln mindestens drei unterschiedlichen Kennlinien an verschiedenen Stellen in der peri-Kerne Bereich jeder Zelle. Obwohl es vorteilhaft ist, mehrere nehmenKurven auf jeder Zelle für zuverlässige statistische Daten zu viele Kraftkurven kann zu Veränderungen in der Zelle Steifigkeit aufgrund von Stress aus der AFM-Sonde führen. </li><li> Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Spitze, und wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 für so viele Zellen wie für gute statistische Daten über die Zelle Steifigkeit unter einer bestimmten Bedingung Probe benötigt. In der Regel werden 30 Zellen für jede Bedingung gemessen. </li></ol> Um die Verteilung der Steifigkeit in einer Zelle zu charakterisieren, wird eine Kraft-Karten-Modus angewendet wird. In der Kraft-Karten-Modus, stellen Sie eine Scan-Größe, um die Region in der Nähe sind, eine angemessene Auflösung; setzen die Vertiefung Parameter wie für einzelne Kraft Kurven ausgewählt, die AFM wird dann über den definierten Bereich Probe rastern und nehmen einzelne Kraft Kurven bei jedem Pixel in den Probenbereich. 4. Data Analysis Die aufgezeichneten Kraft Kurven werden unter Verwendung eines benutzerdefinierten MATLAB Verfahren, um die Zelle Steifigkeit berechnen. Das Folgende ist eine kurze Beschreibung der MATLAB Verfahren: <ol><li> Die MATLAB-Programm identifiziert die Kontaktstelle koordiniert z0 und d0 (siehe Abbildung 1) mit Hilfe eines Algorithmus aus einer publizierten Methode von Lin et al angenommen 29.: </li><li> Für jeden Datenpunkt in der Kraft-Kurve, eine lineare Anpassung der Daten auf der linken Seite zur Sehenswürdigkeit und ein Hertz-Modell auf der rechten Seite (mit dem gewählten Punkt als erste Anlaufstelle) passen, bis zu dem Satz maximale Vertiefung (200-300 nm empfohlen). </li><li> Für jeden Punkt, die Berechnung der relativen RMS Fehler von beiden passt und die Summe dieser Werte. </li><li> Der Punkt, der die insgesamt mindestens Anpassungsfehler erreicht wird als erste Anlaufstelle ausgewählt. Hinweis: Rechenzeit kann durch die Implementierung eines golden-Abschnitt Suche anstatt linear Scannen des gesamten Kraftkurve reduziert werden. </li><li> Probenverformung δ und Eindruckkraft F werden wie folgt berechnet: <img alt="Gleichung 1"fo: content-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Eine der kleinsten Quadrate angewendet wird, um die F vs passen δ Daten in der Post-Kontaktbereich, z ≥ z 0, nach Hertz Modell der Elastizitätsmodul, E der Zelle zu extrahieren: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Wobei v das Poisson-Verhältnis. Hinweis: Wenn δ mehr als 10% der Dicke der Probe (Zelle Höhe) ist die gemessene Zelle Steifigkeit wird durch das Substrat Steifigkeit betroffen. Die Dicke der perinukleären Region ist in der Regel in der Größenordnung von wenigen Mikrometern. Daher wird nur die ersten 200-300 nm von F-δ-Kurve nach Hertz-Modell passt. </li></ol>

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A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die AFM Vertiefung Methode hat Vorteile gegenüber mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen zu charakterisieren. Wenn auch weniger empfindlich als die magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie und optische Pinzette, die Kräfte auf die Pikonewton Stufe 32 messen kann, kann die AFM Widerstandskraft von Proben im Bereich von zig Pico-Newton, um Hunderte von nano-Newton, vergleichbar zu erfassen, um der Kraft reichen, dass Zellen können unter Verwendung einer Mikropipette 19 aufgebracht werden...

Mechanische Eigenschaften, insbesondere Festigkeit, der einzelnen Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidend für viele biologische Prozesse wie Zellwachstum, Motilität, Teilung, Differenzierung und Gewebshomöostase. 1 Es wurde gezeigt, dass die Zelle mechanische Steifigkeit wird hauptsächlich bestimmt durch das Zytoskelett, insbesondere die Netzwerke von Actin und intermediären Filamenten und andere Proteine ​​mit ihnen verbunden sind. 2 ergibt sich aus mechanischen Tests in vitro Netzwerke von Actin und Intermediärfilamenten vermuten, dass die Zelle Mechanik weitgehend abhängig von der Zytoskelett-Struktur und der Vorspannung ist in das Zytoskelett. 3-5 Steifigkeit von lebenden Zellen wird dann als Index für die Zytoskelett-Struktur 6, Myosin Aktivität 7 und viele andere zelluläre Prozesse evaluieren angesehen. Noch wichtiger ist, sind Veränderungen in der Zelle mechanische Eigenschaften auch oft festgestellt, dass nahe stehendeATED mit verschiedenen Krankheitszuständen wie Tumorbildung und Metastasenbildung 8-10 Kontrolle der mechanischen Steifigkeit von lebenden Zellen kann daher einen neuen Weg zur Zellphysiologie zu überwachen;. zu erkennen und zu diagnostizieren Krankheiten 8;. und um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlungen ausgewertet 11 , 12 Mehrere Verfahren, einschließlich Teilchen Tracking Mikrorheologie, 13-16 magnetischen Verdrehen Zytometrie 17 Mikropipette Streben 18,19 und Mikroindentation 20-22 wurden entwickelt, um die Elastizität der Zellen zu messen. Particle Tracking Mikrorheologie zeichnet die thermischen Schwingungen von entweder Submikron fluoreszierenden Teilchen in Zellen oder Bezugsmarkierungen in der Zelle Zytoskeletts injiziert. 23 elastischen und viskosen Eigenschaften von Zellen aus den gemessenen Verschiebungen Teilchen mit der Fluktuations-Dissipations-Theorem berechnet. 14,23 Dieses Verfahren ermöglicht gleichzeitige Messungen der lokalenmechanische Eigenschaften mit hoher räumlicher Auflösung an verschiedenen Orten in einer Zelle. Jedoch kann Einspritzen fluoreszierenden Teilchen in die Zellen auf Veränderungen in der zellulären Funktion, Zytoskelett-Struktur und damit die Zellmechanik führen. Die Mikropipette Aspiration Methode gilt Unterdruck in einer Mikropipette mit einem Durchmesser im Bereich von 1 bis 5 um ein kleines Stück von der Zellmembran in die Pipette saugen. Zelle Steifigkeit von der angelegten Unterdruck und Zellmembran Verformung. 18 Dieses Verfahren berechnet wird, kann jedoch nicht erkennen, die heterogene Verteilung der Steifigkeit über die Zelle. Magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie (MTC) gilt Magnetfeld Drehmoment an superparamagnetische Kügelchen, die an der Zellmembran zu erzeugen. 17 Handy Steifigkeit wird bei diesem Verfahren aus der Beziehung zwischen der angelegten Drehmoments und der Drehverformung der Zellmembran abgeleitet. Es ist schwierig, die Position der magnetischen Kügelchen in der MTC Verfahren zu steuern, und es ist auch challenging, die Verdrehungsdeformation mit hoher Auflösung zu charakterisieren. Mikroindentation gilt ein Stempel mit wohldefinierten Geometrie in die Zelle zu stanzen. Das Einrücken Kraft und die daraus resultierende Vertiefung in Zellen folgen oft die Vorhersage der Hertz-Modell. Young-Modul von Zellen aus den Kraft-Vertiefung Kurven durch Aufstecken auf die Hertz-Modell berechnet werden. Diese Methode wurde in großem Umfang eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe und Zellen trotz seiner Grenzen wie die Unsicherheit in Kontaktstelle Bestimmung Anwendbarkeit der Hertz-Modell, und das Potential zu Schäden am Zellen zu testen. Unter den vielen Geräten für microindentaion 20, ist der Atomic Force Microscope (AFM) im Handel erhältlich und wurde in großem Umfang angewendet, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen und Geweben 21,24-27 charakterisieren. Dieses Papier zeigt das Verfahren der Verwendung eines Asylum MFP3D-Bio AFM zu Zelle Mechanik charakterisieren. AFM nicht aufly liefert hochauflösende Topographie der Zellen, sondern auch weit verbreitet angewendet worden, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe-Zellen charakterisieren. Das Prinzip der AFM Vertiefung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die AFM-Cantilever nähert die Zelle von wenigen Mikrometern über, in Kontakt mit der Zelle; Einzüge die Zelle, so dass die Cantileverauslenkung erreicht einen vorgewählten Sollwert und zieht sich aus der Zelle. Dabei wird die freitragende Auslenkung in Abhängigkeit von seiner Lage aufgezeichnet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Vor dem Kontakt mit der Zelle bewegt sich der Ausleger in dem Medium ohne sichtbare Verformung. Wenn Einrücken auf der Zelle, den Freischwinger Kurven und den Ablenksignal zunimmt. Die Ausleger sind als elastische Strahlen, so dass die Auslenkung proportional zu der Kraft, die auf die Zelle modelliert. Durch die Einstellung der maximalen Cantileverauslenkung wird die maximale Größe der Kraft, die auf die Probe beschränkt d vermeidenAmage zu den Zellen. Der Abschnitt der Kraftverlauf von Punkt B nach C in Fig. 1, wobei die Spitze Vertiefungen in die Zelle, an die Hertz-Modell zu passen, um die Zelle zu extrahieren Steifigkeit zeigen. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Illustration von AFM Mikroindentation und Interpretation der Kraft-Kurve. Das obere Feld zeigt die Bewegung der AFM-Cantilever durch die Piezo-Scanner gefahren. Die vertikale Lage des Auslegers und der z Cantileverauslenkung D wird während des Verfahrens aufgezeichnet. Der Ausleger beginnt bei Punkt a, wenige Mikrometer über der Zelle. Bei Annäherung an die Zelle, bleibt die Probe Vertiefung δ Null bis Punkt B, wo die Spitze in Kontakt mit der Zelle erreicht. Die Koordinaten des Punktes b in der Handlung sind kritische Wertefür die Datenanalyse durch (z 0, d 0&gt;) bezeichnet. Von B nach C, die Cantilever-Einzüge in die Zelle, bis die Cantileverauslenkung erreicht einen Sollwert, der auf das Verhältnis zwischen der maximalen gezielte Eindruckkraft und Kragfeder Konstante sein wird. Sobald die Auslenkung Signal erreicht den vorgegebenen Maximalwert, wird der Ausleger dann aus der Zelle zu Punkt d, wo es oft nach unten durch Spitze-Probe Haftung gezogen werden zurückgenommen, löst sich von der Zelle und kehrt in seine ursprüngliche Lage am e. Das rechte Bild zeigt die Beziehung zwischen der Vertiefung und dem aufgezeichneten z und d-Signals. In der unteren linken Bereich ist eine graphische Darstellung eines repräsentativen Kraftverlauf, die maximale Vertiefung eines Auslegers, der die Federkonstante gemessen werden 0.07N / m ist, ist auf 17 nm, so dass die maximale Eindruckkraft anzuwendenden Probe ist 1,2 nN. Die wichtigsten Orten während der Vertiefung sind markiert.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

Mechanische Eigenschaften der Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen einschließlich Stammzelldifferenzierung, Tumorentstehung und Wundheilung. Änderungen in der Steifigkeit von Zellen und ECM sind oft Anzeichen von Veränderungen in der Zellphysiologie oder Krankheiten in Geweben. Somit ist Zelle Steifigkeit ein Index, um den Status von Zellkulturen zu bewerten. Unter der Vielzahl von Methoden angewandt, um die Steifigkeit von Zellen und Geweben zu messen, bietet Mikro-Vertiefung mit einem Atomic Force Microscope (AFM) einen Weg, um zuverlässig zu messen die Steifigkeit der lebenden Zellen. Diese Methode wurde in großem Umfang angewendet, um die mikro-Steifigkeit für eine Vielzahl von Materialien, angefangen von Metalloberflächen weichen biologischen Geweben und Zellen zu charakterisieren. Das Grundprinzip dieses Verfahrens ist es, Gedankenstrich eine Zelle mit einer AFM-Spitze aus Geometrie und messen die aufgebrachte Kraft aus der Biegung des AFM-Cantilever. Montage der Kraft-Einzug Kurve nach Hertz-Modusl für die entsprechende Geometrie der Spitze geben können quantitative Messungen der Steifigkeit des Materials. Dieses Papier zeigt das Verfahren, um die Steifigkeit von lebenden Zellen mit AFM charakterisiert. Die wichtigsten Schritte einschließlich des Prozesses der AFM Kalibrierung, Kraft-Kurve Erwerb und Datenanalyse unter Verwendung eines MATLAB Routine demonstriert. Einschränkungen dieser Methode werden ebenfalls diskutiert.

2a zeigt drei repräsentative Kraftkurven von 3T3 Fibroblasten auf Kunststoff-Oberfläche, Polyacrylamidgel von Young-Module 3.000 Pa und 17.000 Pa bzw. kultiviert gemacht. Nach sorgfältiger Ermittlung der Kontaktstellen in den Kurven wird das Einrücken Kraft als Funktion der Zelle Verformung in 2b dargestellt. Unter einer Kraft von Größenordnungen kleiner als 0,3 nN, eine Pyramidenform Spitze Spiegelstriche 3 Mikrometer in einer Zelle auf einer 3 kPa Polyacrylamidgel kultiviert. Im...

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.8K Aufrufe.  Worcester Polytechnic Institute. Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Serie: Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Forschung

Biotechnik

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Ein Millimeter Skala Biege-Prüfsystem zur Messung der mechanischen Eigenschaften von marinen Schwamm Knochensplitter

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...