وأيد هذا العمل عن طريق منح AI064184 وAI76322 من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وغرانت 61789-MA-MUR من مكتب أبحاث الجيش للبحوث MST كان مدعوما أيضا من قبل مؤسسة ولش منحة المعاهد الوطنية للصحة منح F1155 وR01GM103655 إلى JSB

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

في هذا البروتوكول قمنا المفصل عزلة هناك أنواع الدهون من الخلايا كاملة من البكتيريا، ووصف TLC أو الأساليب التحليلية القائمة على MS لتوصيف هذه المواد كيميائيا معزولة. جنبا إلى جنب مطياف الكتلة هو استراتيجية قوية لدي نوفو توصيف الهيكلية من المركبات البيولوجية، ولا ?...

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو جزيء السطح الخارجي رئيسية من الكائنات سالبة الجرام تقريبا كل ويتكون من ثلاثة مجالات الجزيئية: أ-O مستضد السكاريد البعيدة، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون المرتبطة الغشاء والمجال تترسب على النشرة الخارجي لل الغشاء الخارجي طبقة ثنائية 1،2. الدهون والمجال يتكون من 3 ديوكسي-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO) المخلفات والدهون والأنواع الجزيئية، حيث الدهون ويمكن تعريفها بأنها جزء من كلوروفورم للذوبان من LPS على التحلل خفيفة حمض 1، 2. الدهون القياسية جزيء يمكن تعريفها كيميائيا بمثابة العمود الفقري diglucosamine هذا هو ومكرر فسفرته-acylated سداسي؛ متسقة مع الأنواع الدهنية والتي لوحظت في نموذج كائن كولاي (كولاي) 1،2. تسعة جينات أعرب جوهري، الحفظ في جميع أنحاء البكتيريا سالبة الجرام، هي المسؤولة عن إنتاج الدهون مجال (الشكل 1) 1،2. معظم البكتيريا لديها مجموعة إضافية من الجينات، التي تختلف في درجة الحفظ النشوء والتطور، التي تشارك في مزيد من التعديل الكيميائي للدهون A 3. نزع الفسفات، وإزالة السلاسل أسيل، وإضافة الأنصاف الكيميائية مثل السكريات الأمينية (على سبيل المثال aminoarabinose) و / أو phosphoethanolamine هي الأكثر شيوعا لوحظ الأنشطة (الشكل 1). يتم تنشيط العديد من الإنزيمات المسؤولة عن الدهون والتعديل مباشرة عن طريق إشارات البيئية، مثل الكاتيونات ثنائي التكافؤ، أو ينظم التعبير عنها من قبل اثنين من أنظمة الاستجابة منظم مكون 3. وتتوسط الاعتراف الأنواع الدهون A من قبل المضيف نظام المناعة الفطرية التي تول مثل مستقبلات عامل التمايز 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) شارك في مستقبلات 4. قوات مسعور بين MD2 والدهون وسلاسل أسيل، وكذلك بين TLR4 و &#39;مجموعات الفوسفات 1 و 4 من الدهون وتعزيز علاقة قوية من الشفةمعرف A مع TLR4/MD2 4،5. التعديلات التي تغير حالة أسيلة أو شحنة سالبة من الدهون والدهون تأثير TLR4/MD2 يستند الاعتراف والتحفيز المصب من الاستجابة المناعية الفطرية تفعيل NF كيلوبايت وسطاء الالتهاب مثل TNFα وIL1-β 6،7. التعديلات التي تحجب شحنة سالبة من الدهون وأيضا منع جراثيم الببتيدات المضادة للميكروبات الموجبة من الربط إلى سالبة الجرام سطوح الخلايا 3،8. وافترض كثير من الدهون وتعديلات لزيادة اللياقة البدنية البكتيرية تحت ظروف بيئية معينة، مثل داخل المضيف الإنسان أو في مكانة الايكولوجية. لهذا السبب كثير من الإنزيمات تعديل أهدافا جذابة في تطوير عقلانية من المركبات المضادة للميكروبات. التنوع الكيميائي للهياكل الدهون A، فيما يتعلق الحي و / أو البيئة، والآثار البيولوجية من هذه الهياكل المتنوعة جعل توصيف الهيكلية من الدهون ومسعى هاما في روقال انه يدرس من البكتيريا سالبة الجرام. عزل جزيئات الدهون A من البكتيريا كله ينطوي على استخراج LPS من سطح الخلية البكتيرية، وهي خطوة المائي لتحرير الدهون A، يليه إجراء تنقية النهائي 9-11. الإجراء استخراج LPS في معظم الأحيان واستشهد هو الإجراء استخراج المياه الساخنة الفينول، لأول مرة من قبل ويستفال جن 10. بعد تعرض استخراج LPS كله إلى خفيفة حمض المائي الذي يفصل كيميائيا KDO من الهيدروكسيل-6&#39;من السكر الجلوكوزامين البعيدة من الدهون A (الشكل 1). وجود مطبات عديدة لإجراء المياه الساخنة الفينول بما في ذلك استخدام كاشف المخاطر العالية، يطلب ضرورة للحط من الأحماض المستخرجة التعاون النووي والبروتينات، وعدة أيام لاستكمال البروتوكول 10. وقد مختبرنا تطويرها استخراج وعزل الدهون وكما وضعت أول من Caroff ورايتز وهو 12،13. مقارنة مع الإجراءات المياه الساخنة الفينول، وطريقة المقدمة هنا هي أكثر سرعة وكفاءة ويستوعب مجموعة واسعة من وحدات التخزين الثقافة من 5 مل ليتر متعددة. وعلاوة على ذلك، على عكس الاستخراج المياه الساخنة الفينول، أسلوبنا لا تحديد لأنواع السلس الخام أو من LPS، وتوفير الانتعاش الأمثل من أنواع الدهون A. في بروتوكول لدينا، يتم تنفيذ تحلل المواد الكيميائية من الخلايا البكتيرية كله باستخدام مزيج من الكلوروفورم والميثانول والماء، حيث يمكن مكعبات LPS بواسطة الطرد المركزي. وتستخدم مجموعة من التحلل خفيفة الحمضية والاستخراج بالمذيبات (بلاي-داير) لتحرير الدهون A من السكاريد المرفقة تساهميا. تم تطبيق أسلوب بليغ وداير أولا إلى استخراج أنواع الدهون من مجموعة متنوعة من الأنسجة الحيوانية والنباتية 14 أو تعديلها هنا لفصل السكاريد تحلل من الدهون A. في هذه الخطوة الانفصال النهائي، والكلوروفورم الدهون القابلة للذوبان تقسيم انتقائي في أقل العضوية المرحلة. لمزيد من تنقية الدهون A، عكس المرحلة أوأنيوني عمود التبادل اللوني يمكن استخدام 12. بعد عزلة من نوع الدهون من الخلايا بأكملها، عددا من الأساليب التحليلية يمكن استخدامها لتوصيف التركيب الكيميائي للمواد المعزولة مثل الرنين المغناطيسي، TLC، وتحليل يستند إلى MS-. NMR يسمح للتوضيح الهيكلية غير مدمرة، ويقدم تفاصيل الهيكلية المتعلقة الروابط غليكوزيدية، الاحالة لا لبس فيه من مواقف سلسلة أسيل، وتعيين مواقع المرفقات للA التعديلات الدهون مثل aminoarabinose أو phosphoethanolamine 15-17. لم يتم مناقشتها تحليل NMR من الدهون وضمن بروتوكول لدينا، ولكن تم صفها على نحو كاف في أماكن أخرى 15،16. للتحليل السريع TLC استنادا تستخدم أساليب كثير من الأحيان، لكنه يفشل في تقديم معلومات مباشرة حول التركيبة الكيميائية غرامة. بروتوكولات MS تستند هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لتوصيف والهياكل الدهون 18،19. المصفوفة المرتبطة الليزر الامتزاز التأين (MALDIوكثيرا ما يستخدم)-MS لمسح الأنواع في البداية سليمة الدهون A. يتم إنشاء الأيونات المشحونة منفردة من الحليلة أعدت وفقا للإجراءات استخراج لدينا. كما هو مطلوب التحليل البنيوي أكثر غرامة، على أساس أساليب MS / MS تكون أكثر إفصاحا من MALDI-MS. إلى جانب لالتأين electrospray (ESI) الدهون اتهم منفردة أو ضرب A أيونات السلائف هي مزيد مجزأة عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) أو الإنحلال الضوئي فوق البنفسجية (UVPD)، لتوليد أيونات المنتج بالمعلومات هيكليا 18،20،21. وكثيرا ما ولدت أيضا المنتجات وفقدان محايدة من الدهون والأيونات السلائف خلال ESI-MS توفير طبقة إضافية من المعلومات الهيكلية. وقد ثبت جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) لتكون وسيلة لا غنى عنها وتنوعا لتوضيح هياكل الدهون A. خلال MS / MS، يتم تنشيط أيونات لانتاج نمط تجزئة التشخيصية التي يمكن استخدامها لتوضيح هيكل أيون السلائف. لافا على نطاق واسعilable طريقة MS / MS هو CID. وتنتج هذه الطريقة الأيونات عبر جزء اصطدام السلائف أيون اختيارها بغاز خامل الهدف، مما أدى إلى ترسب الطاقة الذي يؤدي إلى التفكك. وقد ثبت CID أداة حاسمة في تخصيص الدهون هيكل لمجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية 22-33. على الرغم من أن إدارة البحث الجنائي هو الأكثر تنفيذا عالميا طريقة MS / MS، فإنه يولد مجموعة محدودة من الأيونات المنتج. 193 نانومتر UVPD هو البديل والتكميلي الأسلوب MS / MS. يستخدم هذا الأسلوب الليزر لأشرق الأيونات، وامتصاص الفوتونات النتائج في energization من الأيونات والتفكك اللاحقة. هذه الطاقة أعلى MS / MS تقنية تنتج مجموعة أكثر تنوعا من المنتجات من الأيونات CID وبالتالي يوفر أنماط تجزئة أكثر بالمعلومات. على وجه الخصوص، UVPD يتيح المعلومات حول التغييرات الطفيفة في أنواع الدهون وبناء على الانشقاقات في غليكوزيدية، أمين، أسيل وCC ربط السندات 18،21،34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو رئيسي جزيء سطح الخلية من البكتيريا سالبة الجرام، تترسب على النشرة الخارجي من طبقة ثنائية الغشاء الخارجي. ويمكن تقسيم LPS في ثلاثة مجالات: القاصي O-السكاريد، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون والمجال تتكون من الدهون والأنواع الجزيئية وبقايا حمض ديوكسي 3-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO). الدهون والمجال هو العنصر الوحيد الضروري لبقاء الخلية البكتيرية. التوليف التالية لها، والدهون غير معدلة كيميائيا في استجابة للضغوط البيئية مثل درجة الحموضة أو درجة الحرارة، لتعزيز المقاومة لمركبات المضادات الحيوية، والتهرب من الاعتراف من قبل وسطاء من الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة. بروتوكول التالية تفاصيل العزلة الصغيرة والكبيرة الحجم والدهون A من البكتيريا سالبة الجرام. ثم وتتميز المواد معزولة كيميائيا بواسطة طبقة رقيقة اللوني (TLC) أو مطياف الكتلة (MS). بالإضافة إلى مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت لوضوء (MALDI-TOF) MS، ونحن أيضا تصف جنبا إلى جنب MS بروتوكولات لتحليل الدهون والأنواع الجزيئية باستخدام التأين electrospray (ESI) بالإضافة إلى الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) والإنحلال الضوئي فوق البنفسجية المستخدمة حديثا (UVPD) الأساليب. بروتوكولات MS دينا تسمح لتحديد لا لبس فيه من التركيب الكيميائي، أهمية قصوى لتوصيف جزيئات الدهون والتي تحتوي على التعديلات الكيميائية الفريدة أو الرواية. نحن أيضا وصف تسمية بالنظائر المشعة، والعزلة لاحقة، من الدهون (أ) من الخلايا البكتيرية لتحليلها من قبل TLC. نسبة إلى بروتوكولات يستند إلى MS-، TLC يوفر طريقة توصيف أكثر اقتصادا وسريع، ولكن لا يمكن أن تستخدم لتعيين بشكل لا لبس فيه الدهون والبنى الكيميائية دون استخدام معايير التركيبة الكيميائية المعروفة. على مدى العقدين الماضيين أدى عزل وتوصيف الدهون A إلى العديد من الاكتشافات المثيرة التي تحسنت فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من البكتيريا سالبة الجرام، آليات المقاومات للمضادات الحيويةوقد وفرت اتجهت الاستجابة المناعية الفطرية الإنسان، والعديد من أهداف جديدة في تطوير مركبات مضادة للجراثيم.

الكنسي الدهون ألف من E. كولاي والسالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية هو ديساكهارايد-acylated سداسي الجلوكوزامين مع مجموعات الفوسفات في 1 - 4 و&#39;المواقف. خلال النمو في وسائل الإعلام الغنية (مثل لوريا مرق) جزء من الدهون ويحتوي على مجموعة بيروفوسفات في موق...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

عزل وتوصيف الدهون ومجال عديد السكاريد الشحمي (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام يوفر نظرة ثاقبة الآليات القائمة على سطح الخلية المقاومة للمضادات الحيوية، وبقاء البكتيرية واللياقة البدنية، وكيف كيميائيا الدهون المتنوعة والأنواع الجزيئية تعدل تفاضلي المضيف الاستجابات المناعية الفطرية.

عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

31.5K Views.  The University of Texas at Austin.  عزل وتوصيف الدهون ومجال عديد السكاريد الشحمي (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام يوفر نظرة ثاقبة الآليات القائمة على سطح الخلية المقاومة للمضادات الحيوية، وبقاء البكتيرية واللياقة البدنية، وكيف كيميائيا الدهون المتنوعة والأنواع الجزيئية تعد?...

Video: Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

الجذور الحرة في علم الأحياء الكيميائي: من السلوك الكيميائي للتنمية العلامات البيولوجية

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

للطي وتوصيف روبوت الحيوية استجابة من الحمض النووي اوريغامي

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

نوكليوزيد Triphosphates - من توليف لتوصيف الكيمياء الحيوية

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

منهج تحليل معكوس لتوصيف النقل الكيميائية في مواد الطلاء

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

أطر توليف وتوصيف بين functionalized المعدنية العضوية

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

توليف وتوصيف المواد الغروية Supramolecular

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

الغزل الجاف موائع جزيئية وتوصيف الألياف المجددة Fibroin الحرير

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

توليف وتقييم مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية المستندة إلى الروثينيوم

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.