עבודה זו נתמכה על ידי המענקים וAI064184 AI76322 מן המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ועל ידי גרנט 61,789-MA-MUR ממשרד המחקר של הצבא למחקר MST גם נתמכה על ידי הקרן וולש גרנט F1155 ומענק NIH R01GM103655 לJSB

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בפרוטוקול זה יש לנו מפורט הבידוד של מיני שומנים מהתאים של חיידקים כולה, ותיארו את TLC או שיטות אנליטיות המבוססות MS לאפיין חומר מבודד זה מבחינה כימית. ספקטרומטריית מסת טנדם היא אסטרטגיה רבת עוצמה לאפיון מבני דה נובו של תרכובות ביולוגיות, ולא יסולא בפז לאפיון הכימי ...

Lipopolysaccharide (LPS) הוא מולקולת המשטח החיצונית העיקרית של כמעט כל יצורי גרם שלילי והוא מורכב משלושה תחומים מולקולריים: פוליסכריד דיסטלי O-אנטיגן, oligosaccharide ליבה, והשומנים בדם הקרום הקשורים תחום שהופקד על העלון החיצוני של 1,2 bilayer קרום חיצוני. השומנים תחום מורכב משאריות 3-deoxy-D-manno באוק &#39;2-ulosonic (Kdo) ושומני מינים מולקולריים, שבו שומנים בדם יכול להיות מוגדרים כחלק מסיס בכלורופורם של LPS על הידרוליזה מתונה חומצת 1, 2. השומנים סטנדרטיים מולקולה יכולים להיות מוגדרים כימי כמו עמוד השדרה diglucosamine שהוא וbis-פוספורילציה-acylated שש; בקנה אחד עם מיני שומנים העיקריים שנצפו בcoli אורגניזם מודל Escherichia coli (E. coli) 1,2. תשעה גנים הביעו constitutively, נשמרו לאורך כל חיידקים גראם שלילית, הם אחראים לייצור של השומנים בדם תחום (איור 1) 1,2. רוב החיידקים סט נוסף של גנים, אשר משתנה במידת שימור פילוגנטי, המשתתפים בשינוי כימי נוסף של שומנים בדם 3. Dephosphorylation, הסרת חלק מרשתות acyl, והתוספת של moieties הכימי כגון סוכרים אמינו (למשל aminoarabinose) ו / או phosphoethanolamine הן הפעילויות (איור 1) נצפה הנפוצות ביותר. רבים מהאנזימים האחראים לשומני שינוי מופעלים ישירות על ידי אותות סביבתיים, כגון קטיונים דו ערכיים, או הביטוי שלהם מוסדר על ידי שתי מערכות תגובת רגולטור רכיב 3. הכרה של מיני שומנים בדם על ידי מערכת החיסון המולדת המארח מתווכת על ידי גורם הקולטן חיוג כמו בידול 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) שיתוף קולט 4. כוחות הידרופובי בין MD2 והשומנים בדם רשתות acyl, כמו גם בין TLR4 וקבוצות 1 ו -4 &quot;פוספט של שומנים בדם לקדם את הקשר החזק של שפהid עם TLR4/MD2 4,5. שינויים שמשנים את מצב acylation או המטען השלילי של שומנים שומנים מבוססי ההשפעה TLR4/MD2 הכרה וגירוי במורד הזרם של תגובת החיסון המולדת מטהרי NF-κB ומתווכים של דלקת כגון TNFα ו6,7 IL1-β. שינויים שלהסוות את המטען השלילי של שומנים בדם גם למנוע פפטידים מיקרוביאלית קטיוני bactericidal מלהיקשר לגראם שלילי משטחי תא 3,8. שינויי שומנים רבים שיערו להגדיל את כושר חיידקים בתנאים סביבתיים מסוימים, כגון בתוך המארח האנושי או בנישה אקולוגית. מסיבה זו אנזימי שינוי רבים הם מטרות אטרקטיביות בפיתוח רציונלים של תרכובות מיקרוביאלית. הגיוון הכימי של מבני שומנים בדם, ביחס לאורגניזם ו / או בסביבה, ואת ההשלכות הביולוגיות של המבנים המגוונים הללו להפוך את האפיון המבני של שומנים בדם חשוב במאמץ לאהוא לומד של חיידקי גרם שלילי. בידוד של מולקולות שומנים מכל חיידקים כרוך החילוץ של LPS מתא השטח בקטריאלי, צעד hydrolytic לשחרר את השומנים בדם, ואחרי הליך טיהור סופי 9-11. מצוטט לעתים קרובות ביותר הליך מיצוי LPS הוא הליך המיצוי במים החם-פנול, הוצג לראשונה על ידי סטפל וג&#39;אן 10. לאחר כל LPS חילוץ נתונה הידרוליזה מתונה חומצה, אשר כימי מפרידה Kdo מ6&#39;-הידרוקסיל של סוכר גלוקוזאמין הדיסטלי של שומנים בדם (איור 1). החסרונות רבים קיימים להליך המים חם פנול כוללים השימוש במגיב מפגע גבוה, הצורך להשפיל חומצות המופקים במשותף גרעין וחלבונים, וכמה ימים נדרשים כדי להשלים את הפרוטוקול 10. המעבדה שלנו פיתחה עוד יותר את החילוץ ובידוד של שומנים בדם כפי שפותח לראשונה על ידי Caroff וRaetz 12,13. בהשוואה לנהלי מים חם פנול, השיטה המוצגת כאן היא מהירה ויעילה יותר ולהכיל מגוון רחב של נפחי תרבות מ5 מיליליטר לליטר מרובה. יתר על כן, בניגוד לעקירות מים חם פנול, השיטה שלנו לא בוחר למחוספס או חלקת סוגי LPS, מתן התאוששות אופטימלית של מיני שומנים בדם. בפרוטוקול שלנו, תמוגה הכימית של תאי חיידקיים שלמים מתבצעת באמצעות תערובת של כלורופורם, מתנול ומים, שבו ניתן pelleted LPS על ידי צנטריפוגה. שילוב של הידרוליזה מתונה חומצה ועקירות ממס (בליי-Dyer) משמשים לשחרור שומנים מפוליסכריד המצורף קוולנטית. השיטה של ליי ודאייר הוחלה לראשונה המיצוי של מיני שומנים ממגוון רחב של בעלי חיים וצמחי רקמות 14, הותאמו כאן להפריד פוליסכריד שעבר הידרוליזה מא שומנים בדם בשלב הפרדה סופי, שומנים מסיסים כלורופורם לחלק באופן סלקטיבי לאורגניים נמוך שלב. כדי לטהר עוד יותר שומנים בדם, הפוך שלב אוכרומטוגרפיה בעמודת מטבע אניוני יכולה לשמש 12. לאחר הבידוד של מיני שומנים מכל תאים, במספר שיטות אנליטיות יכול לשמש כדי לאפיין את המבנה הכימי של חומר המבודד כגון תמ&quot;ג, TLC, וניתוח המבוסס על MS. NMR מאפשר להבהרה מבנית שאינו הרסנית, ומספק פירוט מבני הקשורים לקשרי glycosidic, הקצאה חד משמעית של עמדות שרשרת acyl, והמחאת האתרים מצורפים לשינויים שומנים בדם כמו aminoarabinose או phosphoethanolamine 15-17. ניתוח NMR של שומנים לא נדון בפרוטוקול שלנו, אבל כבר תאר כראוי במקומות אחרים 15,16. לניתוח מהיר TLC מבוסס שיטות משמשות לעתים קרובות, אך אינו מספק מידע ישיר לגבי מבנה כימי בסדר. פרוטוקולים מבוססים MS הם השיטה המועסק בתדירות הגבוהה ביותר על מנת לאפיין מבני שומנים 18,19. יינון לייזר desorption מטריקס משויך (MALDI)-MS משמש לעתים קרובות בתחילה סקר מיני שומנים בדם בשלמותה. יונים טעונים ביחידים נוצרים מאנליטי נערך בהתאם לנהלי החילוץ שלנו. כפי שנדרש ניתוח מבני עדין יותר, המבוססות על שיטות MS / MS להוכיח אינפורמטיבי יותר מאשר MALDI-MS. מצמידים את electrospray יינון שומנים ביחידים או להכפיל טעונים יונים מבשר הם מקוטעים עוד יותר על ידי ניתוק התנגשות מושרה (CID) או photodissociation אולטרה סגול (UVPD) (ESI), כדי ליצור יוני מוצר מבני אינפורמטיבי 18,20,21. מוצרי אובדן ניטראליים משומנים בדם יונים מבשר גם בתדירות גבוהה שנוצרו במהלך ESI-MS מספקים שכבה נוספת של מידע מבני. ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) הוכיחה להיות שיטה הכרחית ותכליתית להבהרה של מבני שומנים בדם. במהלך MS / MS, יונים מופעלים להניב דפוס פיצול אבחון שניתן להשתמש בם על מנת להבהיר את המבנה של יון המבשר. אווה נרחבת ביותרשיטת MS / MS ilable היא CID. שיטה זו מייצרת יונים שבר באמצעות התנגשויות של היונים המבשר הנבחרים עם גז אינרטי יעד, וכתוצאה מכך בתצהיר אנרגיה שמוביל לניתוק. CID הוכיח כלי קריטי בהקצאה של מבנה שומנים בדם למגוון רחב של מיני חיידקים 22-33. למרות CID הוא שיטת MS / MS מיושם ביותר האוניברסלית, זה יוצר מערך מוגבל של יוני מוצר. 193 UVPD ננומטר הוא אלטרנטיבה ושיטת MS / MS משלים. בשיטה זו נעשה שימוש בליזר כדי להקרין יונים, והקליטה של ​​פוטונים התוצאה energization של היונים וניתוק שלאחר מכן. טכניקת MS / MS זה אנרגיה גבוהה יותר מייצרת מערך מגוון יותר של יוני מוצר מאשר CID ובכך מספקת דפוסי פיצול יותר אינפורמטיבי. בפרט, UVPD מעניק מידע על שינויים עדינים במינים שומנים המבוססים על שסעים בglycosidic, אמין, acyl ואיגרות חוב צמודות CC 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) הוא המולקולה הגדולה פני תא של חיידקי גרם שלילי, שהופקדה על העלון החיצוני של bilayer הקרום החיצוני. ניתן לחלק LPS לשלושה תחומים: O-פוליסכריד דיסטלי, oligosaccharide ליבה, והשומנים בדם תחום בהיקף של שומנים מינים מולקולריים ושאריות 3-deoxy-D-manno באוק &#39;2-ulosonic חומצה (Kdo). תחום שומנים בדם הוא רק המרכיב חיוני להישרדות תא חיידק. בעקבות הסינתזה שלה, שומנים בדם הוא שינוי כימי בתגובה ללחצים סביבתיים כגון pH או טמפרטורה, כדי לקדם את ההתנגדות לתרכובות אנטיביוטיות, וכדי להתחמק מזיהוי על ידי מתווכים של תגובת החיסון המולדת המארחת. הפרוטוקול המפרט את הבידוד קטן וגדולה בקנה מידה של שומנים בדם מחיידקי גרם שלילי. חומר מבודד מכן מאופיין כימי על ידי כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) או ספקטרומטר מסה (MS). בנוסף למטריקס בסיוע לייזר desorption / יינון פעמי של fאור (MALDI-TOF) טרשת נפוצה, אנו גם מתארים את פרוטוקולי MS מקביל לניתוח שומנים מינים מולקולריים באמצעות יינון electrospray (ESI) מצמידים את ניתוק התנגשות מושרה (CID) וphotodissociation סגול מועסקים חדשים שיטות (UVPD). פרוטוקולי MS שלנו מאפשרים לקביעה חד משמעית של מבנה כימי, בעל חשיבות עליונה לאפיון של מולקולות שומנים המכילות שינויים כימיים ייחודיים או חדשניים. אנו גם מתארים את תיוג radioisotopic, והבידוד שלאחר מכן, של שומנים מתאי חיידקים לניתוח על ידי TLC. יחסית לפרוטוקולים מבוססי MS, TLC מספק שיטת אפיון יותר חסכונית ומהירה, אבל לא ניתן להשתמש בו כדי להקצות באופן חד משמעי שומנים מבנים כימיים ללא השימוש בסטנדרטים של מבנה כימי ידוע. במהלך שני העשורים האחרונים בידוד ואפיון של שומנים בדם הובילו לתגליות מרגשים רבות ששפרו את ההבנה של הפיסיולוגיה של חיידקי גרם שלילי, מנגנונים של התנגדות לאנטיביוטיקה שלנוtance, התגובה החיסונית המולדת האנושית, וספק הרבה מטרות חדשות בפיתוח של תרכובות אנטי בקטריאליים.

שומנים הקנוני של א &#39; Typhimurium serovar enterica coli וסלמונלה הוא דו סוכר-acylated שש של גלוקוזאמין עם קבוצות פוספט ב1 - ו 4 &#39;-עמדות. במהלך צמיחה במדיה עשירה (לדוגמא, מרק לוריא) חלק מהשומנים מכיל קבוצת pyrophosphate ב1-עמדת מניב מיני טריס-פוספורילציה 36 (איור 1).</str...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחות.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

31.5K Views.  The University of Texas at Austin.  בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחו...

Video: Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

גישה הפוכה ניתוח לאפיון כימי תחבורה בצבעים

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Microfluidic יבש-ספינינג ואפיון של סיבי Fibroin משי מחדש

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

סינתזה והערכה של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוססי רותניום

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.