이 작품은 또한 JSB에 R01GM103655을 부여 웰치 재단의 F1155 및 NIH에 의해 지원되었다 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금 AI064184 및 AI76322에 의해 MST 연구에 육군 연구 사무실에서 그랜트 61789-MA-MUR에 의해 지원되었다

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서 우리는 박테리아의 전체 세포에서 지질 종의 분리를 자세히 설명하고, 화학적으로이 절연 재료의 특성을 TLC 또는 MS 기반의 분석 방법을 설명했다. 텐덤 질량 분석법은 생물학적 화합물의 드 노보 구조적 특성에 대한 강력한 전략이며, 자연에서 볼 수있는 지질 분자의 갑옷의 한 벌의 화학적 특성 분석을위한 매우 중요한 이점입니다. CID 및 UVPD 지질 분자에 대한 키 지문을 ...

지질 다당류 (LPS)는 거의 모든 그람 음성균의 주요 외부 표면 분자이며 세 분자 도메인으로 구성 원위 O-항원 다당류, 코어 올리고당, 및 막 - 관련 지질의 외측 전단지에 증착 도메인 외막 이중층 1,2. 지질 도메인은 지질이 약한 산 가수 분해 1시 LPS의 클로로포름 가용 부분으로 정의 할 수 있습니다 3 - 데 옥시-D-Manno의 10 월 2 ulosonic (KDO) 잔류 물과 지질 분자 종으로 구성 2. 모델 생물 대장균 (E. 콜라이) 1,2 관찰 주요 지질 종과 일치; 표준 지질 분자는 화학적 헥사 아 실화 및 비스 - 인산화 diglucosamine 백본으로 정의 될 수있다. 그람 음성 박테리아에 걸쳐 보존 나인 구조적으로 표현 된 유전자는 지질의 생산 도메인 (그림 1) 1, 2에 대한 책임이 있습니다. 대부분의 박테리아는 지질 3의 추가 화학적 변형에 참여 계통 보호의 정도에 차이가 유전자의 추가 집합을 보유하고 있습니다. 탈 인산화, 아실 사슬의 제거와 같은 아미노 당 (예 aminoarabinose) 및 / 또는 phosphoethanolamine 화학적 잔기의 첨가는 일반적으로 관찰 활동 (도 1)이다. 지질 변형에 대해 책임 효소의 많은 직접적 가의 양이온 등의 환경 신호에 의해 활성화되고, 또는 그 발현이 성분 응답 레귤레이터 시스템 (3)에 의해 규제된다. 호스트 타고난 면역 시스템에 의해 지질 종의 인식은 수신자 같은 수용체 4/myeloid 분화 인자 2 (TLR4/MD2) 공동 수용체 (4)에 의해 매개된다. MD2와 지질 아실 체인뿐만 아니라 TLR4 및 지질의 1 및 4 &#39;인산기 립의 강한 연관을 촉진 간의 소수성 세력TLR4/MD2 4,5와 아이디. 실화 상태 또는 지질의 음전하 영향 TLR4/MD2 기반 지질을 변경 수정은 인식과 타고난 면역 반응의 하류 자극은 NF-κB와 같은 TNFα와 IL1-β 6,7와 같은 염증 매개 활성제. 지질의 음전하 마스크 수정은 세포 표면 3,8를 음성에게 그램 바인딩에서 살균 양이온 항균 펩타이드를 방지합니다. 많은 지질의 수정은 이러한 인간의 호스트 내부 또는 생태 학적 틈새 시장과 같은 특정 환경 조건에서 세균의 체력을 증가하는 가정합니다. 이러한 이유로 많은 수정 효소는 항균 화합물의 합리적인 개발에 매력적인 대상입니다. 지질 구조체의 화학적 다양성, 유기체 및 / 또는 환경, 이러한 다양한 구조의 생물학적 영향에 대하여 지질의 구조적 특성화 t에서 중요한 노력을하게그는 그람 음성 박테리아의 연구. 전체 박테리아 지질 분자의 분리는 최종 정제 절차 9-11이어서 세균 세포 표면으로부터 LPS의 추출, 지질을 해방하는 가수 분해 단계를 포함한다. 가장 자주 인용 LPS 추출 절차는 첫 번째 웨스트 팔과 쟌 (10)에 의해 도입, 핫 페놀 물 추출 절차입니다. 추출 전체 LPS는 화학적으로 지질의 말단 글루코사민 설탕 (그림 1)의 6&#39;-히드 록에서 KDO을 분리 약한 산 가수 분해를 받게되면. 수많은 함정 높은 위험 시약의 사용 등 핫 페놀 물 절차 존재 공동 추출한 핵산 및 단백질, 며칠을 분해 할 필요가 프로토콜 (10)을 완성해야한다. 첫 번째 Caroff 및 Raetz (12, 13)에 의해 개발 된 우리의 실험실은 또한 지질의 추출 및 분리를 개발했습니다. 핫 페놀 물 절차에 비해, 여기에서 제시된 방법은보다 신속하고 효율적이며 5 ㎖에서 체류 리터 배양 부피의 넓은 범위를 수용한다. 또한, 핫 페놀 물 추출과는 달리, 우리의 방법은 지질 종의 최적의 복구를 제공, LPS의 거친 또는 부드러운 유형을 선택하지 않습니다. 우리의 프로토콜에서, 전체 박테리아 세포의 화학적 용해는 LPS는 원심 분리에 의해 펠릿 화 될 수 클로로포름, 메탄올 및 물을 혼합하여 수행된다. 약한 산 가수 분해 및 용매 추출 (Bligh 고 - 다이어)의 조합은 공유 연결된 다당류에서 지질을 해방하는 데 사용됩니다. Bligh 고 및 다이어의 방법은 제 14의 조직은, 동물 및 식물의 다양한 지질 종의 추출에 적용이 최종 분리 단계 지질 A.에서 가수 분해 된 폴리 사카 라이드를 분리하는 여기 변성시키고, 클로로포름에 용해 지질 선택적 하부 유기적으로 분할 상. 또한, 지질를 정화하는 역상 또는음이온 교환 칼럼 크로마토 그래피 (12)를 사용할 수있다. 전체 세포에서 지질 종의 분리 후, 분석 방법의 수는 NMR, TLC 및 MS-기반 분석과 같은 절연 물질의 화학 구조를 특성화하기 위해 사용될 수있다. NMR은 비파괴 구조 규명이 가능하고, 글리코 시드 결합, 아실 체인 위치의 명백한 할당, aminoarabinose 또는 phosphoethanolamine 15-17와 같은 지질 수정에 대한 첨부 파일 사이트의 할당과 관련된 구조적인 세부 사항을 제공합니다. 지질의 NMR 분석은 우리의 프로토콜 내에서 설명되지 않지만, 그 밖에 15,16 충분히 설명되었다. 신속한 분석을 위해 TLC 방법이 자주 사용하는 기반으로하지만, 정밀 화학 구조에 대한 직접적인 정보를 제공하기 위해 실패합니다. MS 기반 프로토콜은 지질 구조 (18, 19)의 특징을 가장 자주 사용되는 방법이다. 매트릭스 연관된 레이저 탈착 이온화 (MALDI)-MS는 종종 처음 그대로 지질 종을 조사하는 데 사용됩니다. 단독으로 하전 된 이온을 분석 우리의 추출 절차에 따라 제조에서 생성됩니다. 더 미세 구조 분석이 요구되기 때문에, MS / MS 기반의 방법은 MALDI-MS보다 더 많은 정보를 증명한다. 구조적으로 정보를 제품의 이온 18,20,21를 생성하기 위해, (ESI) 전구체 이온이 충돌 유발 분해 (CID) 또는 자외선 광분해 (UVPD)에 의해 더 조각난 단일 또는 다중 충전 지질 이온화 전기 분무에 결합. 전구체 이온으로부터 중성 지질 감소 제품도 종종 구조 정보의 부가 층을 제공하는 ESI-MS 동안 생성된다. 탠덤 질량 분석 (MS / MS)의 지질 구조의 해명을위한 필수 불가결하고 다양한 방법으로 입증되었습니다. MS / MS 동안, 이온은 이온 전구체의 구조를 설명하기 위하여 사용될 수있는 진단 조각화 패턴을 수득하기 위해 활성화된다. 가장 널리 AVAilable MS / MS 방법은 CID입니다. 이 방법은 해리 리드 에너지 증착의 결과로, 불활성 가스를 타겟으로 선택된 전구체 이온의 충돌을 통해 단편 이온을 생성한다. CID는 세균 종 22-33 광범위한 지질 구조체의 할당에서 중요한 도구를 입증했다. CID가 가장 보편적으로 구현 MS / MS 방법이지만, 그것은 제품 이온의 한정된 어레이를 생성한다. 193 nm의 UVPD 대안 및 보완 MS / MS 방법입니다. 이 방법은 이온을 조사하는 레이저를 사용하고, 광자의 흡수 이온 및 후속 해리 통전 초래한다. 이 높은 에너지 MS / MS 기술은 CID보다 제품 이온의보다 다양한 배열을 생산하고, 따라서 더 많은 정보를 조각 패턴을 제공합니다. 특히, UVPD는 글리코 시드, 아민, 아와 CC 연계 채권 18,21,34에서 분열에 따라 지질 종의 미묘한 변화에 대한 정보를 제공한다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

지질 다당류 (LPS)는 외막 이중층의 외부 전단지에 증착 그람 음성 박테리아의 주요 세포 표면 분자이다. LPS는 세 개의 도메인으로 분할 될 수있다 : 원심 O-다당류, 코어 올리고당 및 지질 지질로 이루어진 도메인 분자 종 및 3 - 데 옥시-D-Manno의-옥트 -2 - ulosonic 잔기 (KDO). 지질 도메인은 세균 세포의 생존에 필수적인 유일한 구성 요소입니다. 그 합성에 이어 지질 화학적 항생제 화합물에 대한 내성을 증진하기 위해, 그리고 호스트 선천성 면역 반응의 매개체하여 인식을 회피하기 위해, 그러한의 pH 나 온도 등의 환경 스트레스에 대응하여 수정된다. 다음 프로토콜은 그람 음성 세균으로부터의 지질의 소규모 및 대규모 분리 세부. 절연 물질은 화학적 후 박층 크로마토 그래피 (T​​LC) 또는 질량 분광법 (MS)에 의해 특징된다. 또한에 F의 레이저 탈착 / 이온화 타임 매트릭스 지원빛 (MALDI-TOF) MS는, 우리는 또한 충돌 유발 분해 (CID)에 연결된 전자 분무 이온화 (ESI) 및 새로 채용 자외선 광분해 (UVPD) 방법을 사용하여 지질에게 분자 종을 분석 탠덤 MS의 프로토콜을 설명합니다. 우리의 MS 프로토콜은 고유 또는 새로운 화학 수정을 포함하는 지질 분자의 특성에 가장 중요한, 화학 구조의 명백한 결정을 위해 수 있습니다. 우리는 또한 TLC로 분석 박테리아 세포에서 지질의 방사성 동위 원소 표지, 이후 격리를 설명합니다. MS-기반 프로토콜에 상대적 TLC는보다 경제적이고 신속한 특성화 방법을 제공하지만, 명백하게 알려진 화학 구조의 표준을 사용하지 않고 화학 구조 지질을 할당 할 수 없다. 지난 20 년간 지질의 분리 및 특성은 그람 음성 세균, 항생제 RESIS의 메커니즘의 생리에 대한 우리의 이해를 향상하는 많은 흥미로운 발견되었다tance, 인간의 타고난 면역 반응 및 항균 화합물의 개발에 많은 새로운 목표를 제공하고 있습니다.

E.의 정식 지질 4 &#39;- 위치 - 대장균 및 살모넬라 엔테의 혈청 형 티피 뮤 리움은 헥사 실화 1에 인산염 그룹과 글루코사민의 이당류이다. 리치 미디어 (예 : 루리아 국물)의 성장하는 동안 지질의 부분은 트리스 - 인산화 종 36 (그림 1)를 산출 한 위치에서 피로 인산 그룹이 포함되어 있습니다. KDO (3 - 데 옥시-D-Manno의 - octulosonic 산은)에 ?...

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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31.5K 조회수.  The University of Texas at Austin.  그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다. 

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

화학 생물학에서의 자유 부수 : 화학 행동의 Biomarker 개발에

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

연구

화학

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA 접기에서 바이오 응답 로봇의 폴딩 및 특성화

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

페인트의 화학 물질 운송의 특성을 역 분석 접근

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

기능화의 합성 및 특성 금속 - 유기 프레임 워크

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

준비 및 평가<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal 화학을 사용하여 사전이 타겟팅에 대한 세자리 킬레이트를 Tc를 표지

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.