المؤلفين أشكر ماتياس بطرس وجماعته في معهد الكيمياء الحيوية في ETH في زيوريخ حيث تم تطوير هذه الأساليب. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

1. المجهر القياسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 5 مل من المتوسط ​​الاصطناعية مع الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة الاصطناعية لOD ​​600 0.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة المخفف عند 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3 أضعاف تتركز (0.6 M) كلوريد الصوديوم الحل في المتوسطة الاصطناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 1 ملغ / مل من كونكانافالين A (كونا) في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رشاحة ~ 200 ميكرولتر من الحل CONA في الشريحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل CONA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر H 2 O إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 300 ميكرولتر من خلية ثقافة في OD 600 = 0.02 في 1.5 مل microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الخلايا في حمام مائي لمدة 45 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لفترة وجيزة ميلcrotube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الخلايا في حمام مائي لمدة 45 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لفترة وجيزة microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 30 دقيقة للسماح للخلايا تستقر في قاع البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على المجهر جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد إعدادات الإضاءة الفلورسنت للقناة ليتم تسجيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد إعدادات الإضاءة لصورتين حقل مشرق (واحد قليلا من التركيز: 3 ميكرون أدناه البؤري للسماح لتجزئة السليم للخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد فترات زمنية لقياس الوقت الفاصل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحقول من أجل الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء اقتناء عدد قليل من الإطارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقفة اقتناء لإضافة 100 ميكرولتر من 0.6 M كلوريد الصوديوم المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف التصوير. </li></ol> 2. تدفق الخلوي القياسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 5 مل من المتوسط ​​الاصطناعية مع الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينمو بمعدل 30 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التدبيروOD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة الاصطناعية لOD ​​600 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة للتوصل الى OD 600 من 0.2-0.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل سيكلوهيكسيميد 1 ملغ / مل في H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3 أضعاف تتركز (0.6 M) كلوريد الصوديوم الحل في المتوسطة الاصطناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد واحد microtube 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من 0.6 M كلوريد الصوديوم المتوسطة لكل نقطة زمنية المراد قياسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت 0، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى كل microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت T، إضافة 30 ميكرولتر سيكلوهيكسيميد إلى microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.11 لجميع النقاط الوقت المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع microtubes لمدة 45 دقيقة على الأقل وحتى 3 ساعة على 30 درجة مئوية مع الهز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية مع 400 ميكرولتر PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الخلايا في حمام الماء لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لفترة وجيزة microtubes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابنicate الخلايا في حمام الماء لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لفترة وجيزة microtubes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من خلية ثقافة كل microtube إلى المقابلة أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد 488 نانومتر ليزر الإثارة و530/30 نانومتر تصفية ممر الموجة للكشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار عدم التعبير عن ومعربا عن كامل عينة للتحقق مما إذا كانت تقع في نطاق حساسية كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 10،000 الخلايا لكل عينة المكتسبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes.">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li><li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes.">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast.">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions.">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li><li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression.">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li><li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase.">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells.">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry.">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).</li><li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images.">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

المجهر علاج بشكل جيد مع CONA هو خطوة أساسية لضمان التصوير السليم للخلايا. لأن CONA ديه قدرة منخفضة على الذوبان في برنامج تلفزيوني (5 ملغ / مل)، يسمح للعملية الترشيح إزالة الركام الكبيرة التي تكون موجودة في الحل غير المرشحة وتتداخل مع الت...

إشارة عبر أجهزة الطرد المركزي تنبيغ غالبا ما يتوج في التعبير عن البروتينات. توصيف هذا الملف التعبير هي عنصر أساسي في فهم وظيفة المسارات البيولوجية. لا يمكن أن يتحقق تحديد الطيف من التنظيم حتى البروتينات وديناميات التنشيط من خلال تقنيات مختلفة مثل المصفوفات الدقيقة، البقع أو البقع شمال غرب 1-3. ومع ذلك، يبلغ متوسط ​​هذه التقنيات الاستجابة شعب بأكمله من الخلايا. لفهم التنظيم غرامة من التعبير عن البروتينات، فمن المستحسن لجمع القياسات على مستوى خلية واحدة. من الناحية المثالية، ينبغي أن توفر هذه القياسات أيضا البيانات الكمية قابلة للتطوير النماذج الرياضية للمسار الأساسي. المجهري والتدفق الخلوي هي اثنين من التقنيات، والتي هي مناسبة بشكل مثالي لتقديم مثل هذه القياسات وحيدة الخلية الكمي. وضع علامات الذاتية من البروتينات مع بروتين فلوري يمكن به تستخدم لقياس مستوى التعبير عنها 4. ومع ذلك، منذ إضافة شاردة الفلورسنت كبيرة في محطة من البروتين يمكن أن تجعل ذلك غير وظيفية، غالبا ما يكون أكثر من المرغوب فيه لتوليد صحفيين التعبير محددة تستند على المروج القيادة التعبير عن بناء الفلورسنت. هذا البروتين هو مراسل الخارجية لنظام الهاتف الخلوي، وبالتالي لا تؤثر على الأحداث يشير إلى أن تجري في الخلية. كلا المجهري والتدفق الخلوي قد استخدمت على نطاق واسع في مجال الإشارات الخميرة. كأمثلة؛ كولمان، ليرنر وزملاء العمل المترابطة، في زنازين انفرادية، والتعبير عن التزاوج للصحفيين محددة وأعرب جوهري بواسطة المجهر لقياس الضوضاء في الخميرة التزاوج نقل الإشارة سلسلة 5، أكار وزملاؤه تستخدم التدفق الخلوي لدراسة الشبكة التنظيمية السيطرة على التعبير عن الجينات GAL 6. في دراسة سابقة 7، ونحن قد استخدمت تواليفعلى هذه التقنيات اثنين لدراسة الإخراج التعبير عن الأسمولية الجلسرين عالية (HOG) مسار في مهدها الخميرة. يتم تشغيل هذا mitogen تنشيط بروتين كيناز ([مبك]) الطريق بسبب الإجهاد المفرط الاسموزي. أنه يؤدي إلى تفعيل Hog1 MAPK التي translocates إلى نواة الخلية للحث على برنامج النسخي مما أدى إلى التعبير عن الجينات تقريبا 300. لدراسة هذه العملية، ونحن دبرت مراسل التعبير استنادا إلى المروج STL1 (الجينات المستحثة تحديدا ردا على النشاط Hog1 8) القيادة تعبير عن البروتين الفلوري الرباعي فينوس (ع STL1-QV). التدفق الخلوي القياسات كشفت وجود اثنين من السكان من الخلايا في مستوى التوتر المتوسط ​​(0.1 M كلوريد الصوديوم) مع جزء فقط من السكان معربا عن مراسل الفلورسنت. استخدمنا المجهري لمزيد من التحقيق في هذا السلوك، واكتشفت أن هذا الضجيج في تعبير البروتين وتحكمها العوامل الجوهرية 9. نحن فصول التوجيه الجامعيمزيد دينار نلاحظ أن الخلايا مع مستوى مماثل من النشاط Hog1 يمكن عرض نتائج التعبير افت للنظر مختلفة. مزيج من هذه التقنيات اثنين سمح لنا لشرح كيفية إعادة عرض بطء الاستجابة للضغط النفسي الجينات أثرت على نتيجة التعبير على مستوى خلية واحدة 7. في هذه الورقة، ونحن نستخدم تعبير ع مراسل STL1-QV الناجم عن صدمة شديدة الاسموزي كمثال على القياس الكمي للبروتين التعبير بواسطة المجهر والتدفق الخلوي. ودرس نفس السلالة تتعرض ل0.2 M كلوريد الصوديوم الإجهاد مع كل التقنيات. وهذا يسمح لنا لتسليط الضوء على بعض الاختلافات الرئيسية في هذين التقنيات التكميلية للغاية.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Yeast Nitrogen Base</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>CYN6202</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>CSM amino-acid mix</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>DCS0011</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Concanavalin A</td>
			 <td>GE Healthcare</td>
			 <td>17-0450-01</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Cycloheximide</td>
			 <td>Fluka Aldrich Sigma</td>
			 <td>C7698</td>
			 <td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>ySP9</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>pSP34</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope</td>
			 <td>Nikon</td>
			 <td>Ti-Eclipse</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope control software</td>
			 <td>Micro-manager</td>
			 <td>Ver 1.4.11</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Incubation chamber</td>
			 <td>LIS</td>
			 <td>The Box</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Fluorescence light source</td>
			 <td>Lumencor</td>
			 <td>SpectraX</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Camera</td>
			 <td>Hamamatsu</td>
			 <td>Flash 4.0</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Flow cytometer</td>
			 <td>BD</td>
			 <td>FACS calibur</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Sonicator bath</td>
			 <td>Telesonic</td>
			 <td>TUC-150</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>8-well-slide </td>
			 <td>Thermo Lab-tek</td>
			 <td>155409</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>96-well-plate</td>
			 <td>Matrical bioscience</td>
			 <td>MGB096-1-2-LG</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>FACS tube</td>
			 <td>BD Falcon</td>
			 <td>352054</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells

الكمي في التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة تكشف آليات تنظيمية الرواية تحجب في قياسات أجريت على مستوى السكان. يتم عرض طريقتين على أساس المجهري والتدفق الخلوي لشرح كيفية يمكن الحصول على هذه البيانات. ويستخدم تعبير مراسل الفلورسنت التي يسببها على تفعيل الأسمولية عالية الجلسرين MAPK المسار في الخميرة كمثال على ذلك. ويسلط الضوء على المزايا المحددة لكل طريقة. التدفق الخلوي يقيس عدد كبير من الخلايا (10،000) ويوفر مقياسا مباشرا لديناميات البروتين التعبير مستقلة عن حركية النضج البطيء للبروتين فلوري. التصوير من الخلايا الحية بواسطة المجهر هو على النقيض من ذلك تقتصر على قياس شكل نضجت لمراسل في خلايا أقل. ومع ذلك، يمكن للمجموعات البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذه التقنية أن تكون غنية للغاية وذلك بفضل لمجموعات من الصحفيين ومتعددة للمعلومات المكانية والزمانيةتم الحصول عليها من الخلايا الفردية. يمكن الجمع بين هذه الطرق قياس اثنين تقديم رؤى جديدة بشأن تنظيم بروتين تعبير عن طريق مسارات الإشارات.

المجهر كانت تعلق خلايا الخميرة تحمل مراسل التعبير ع STL1-QV (ySP9 7) إلى الجزء السفلي من الشريحة جيدا ووضعها تحت المجهر. وقد حفز الخلايا بإضافة التوتر المتوسط ​​مباشرة في البئر أثناء الدورة التصوير. وهذا يسمح لنا للحصول على ع?...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

يتم عرض طريقتين التكميلية على أساس التدفق الخلوي والمجهري الذي تمكن من القياس الكمي، على مستوى خلية واحدة، لديناميات التعبير الجيني الناجم عن تفعيل مسار MAPK في الخميرة.

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  University of Lausanne.  يتم عرض طريقتين التكميلية على أساس التدفق الخلوي والمجهري الذي تمكن من القياس الكمي، على مستوى خلية واحدة، لديناميات التعبير الجيني الناجم عن تفعيل مسار MAPK في الخميرة. 

Video: Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...