Die Autoren danken Matthias Peter und seine Gruppe am Institut für Biochemie an der ETH in Zürich, wo diese Verfahren entwickelt worden. Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds unterstützt.

1. Mikroskopie-Messungen <ol><li> Impfen 5 ml synthetisches Medium mit Hefe. </li><li> Zellen wachsen bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Messen Sie die OD 600 der Übernachtkultur am nächsten Morgen. </li><li> Verdünnen Nacht-Kultur in 5 ml synthetisches Medium bis DA 600 0,05. </li><li> Wachsen die verdünnte Kultur bei 30 ° C für mindestens 4 Stunden. </li><li> Bereiten Sie 3-fach konzentriert (0,6 M) NaCl-Lösung in synthetischem Medium. </li><li> Vorbereitung einer 1 mg / ml Lösung von Concanavalin A (ConA) in PBS. </li><li> Filtrat ~ 200 ul ConA-Lösung in die gut Rutsche. </li><li> Lassen Sie stehen für 30 min. </li><li> ConA-Lösung entfernen. </li><li> In 150 ul H 2 O zum Brunnen. </li><li> Entfernen H 2 O </li><li> OD 600-Messung der Zellkultur. </li><li> Planen 300 ul Zellkultur bei einer OD 600 = 0,02 in einem 1,5 ml Mikroröhrchen. </li><li> Beschallen der Zellen in einem Wasserbad für 45 Sekunden. </li><li> Vortex kurz die microtube. </li><li> Beschallen der Zellen in einem Wasserbad für 45 Sekunden. </li><li> Vortex kurz den Mikroröhrchen. </li><li> Geben Sie 200 ul der Zellkultur zum Brunnen. </li><li> Warten Sie 30 min die Zellen auf dem Boden der gut absetzen zu lassen. </li><li> Legen Sie die Folie auch auf dem Mikroskop. </li><li> Wählen Sie die Beleuchtungseinstellungen für die Leuchtstoff Kanal aufgezeichnet werden. </li><li> Wählen Sie die Beleuchtungseinstellungen für zwei Hellfeld-Bilder (ein etwas unscharf: 3 um unterhalb der Fokusebene, für eine angemessene Segmentierung der Zellen zu ermöglichen). </li><li> Wählen Sie die Zeitintervalle für die Zeitraffer-Messung </li><li> Wählen Sie die Felder der Ansicht zu Bild. </li><li> Starten Sie die Aufnahme von ein paar Frames. </li><li> Pause den Erwerb, die 100 ul von 0,6 M NaCl Medium hinzufügen. </li><li> Resume-Bildgebung. </li></ol> 2. Durchflusszytometrie Messungen <ol><li> Impfen 5 ml synthetisches Medium mit Hefe. </li><li> Wachsen bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Messendie OD 600 der Übernacht-Kultur am nächsten Morgen. </li><li> Verdünnen Nacht-Kultur in 5 ml synthetisches Medium bis DA 600 0.1. </li><li> Wachsen bei 30 ° C für mindestens 4 Stunden bis zu einer OD 600 von 0,2-0,4 zu erreichen. </li><li> Vorbereitung Cycloheximid-Lösung 1 mg / ml in H 2 O. </li><li> Bereiten Sie 3-fach konzentriert (0,6 M) NaCl-Lösung in synthetischem Medium. </li><li> Vorbereitung einer 1,5 ml-Mikroröhrchen mit 100 &amp;mgr; l 0,6 M NaCl Medium für jeden Zeitpunkt gemessen werden. </li><li> Zum Zeitpunkt 0, 200 &amp;mgr; l Zellkultur jedem Mikroröhrchen. </li><li> Inkubation mit bei 30 ° C schüttelnd </li><li> Zum Zeitpunkt T, fügen Sie 30 ul Cycloheximid zu einem Mikroröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.11 für alle gewünschten Zeitpunkten. </li><li> Alle Röhrchen Inkubation für mindestens 45 min und bis zu 3 h bei 30 ° C unter Schütteln. </li><li> Bereiten FACS-Röhrchen mit 400 ul PBS. </li><li> Beschallen die Zellen im Wasserbad für 1 min. </li><li> Vortex kurz die Mikroröhrchen. </li><li> Sohnfindliche die Zellen im Wasserbad für 1 min. </li><li> Vortex kurz die Mikroröhrchen. </li><li> 100 ul Zellkultur von jedem Mikroröhrchen in das entsprechende FACS-Röhrchen. </li><li> Wählen Sie die 488 nm Anregungslaser und 530/30 nm Bandpassfilter für die Erkennung. </li><li> Test-nicht-exprimierenden und Proben voll zum Ausdruck, um zu überprüfen, ob sie in der Detektor-Empfindlichkeitsbereich fallen. </li><li> Messen 10.000 Zellen für jede erworbene Probe. </li></ol>

<ol>
	<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes.">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li><li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes.">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast.">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions.">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li><li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression.">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li><li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase.">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells.">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry.">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).</li><li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images.">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Mikroskopie Die Behandlung der mit ConA und ist ein wesentlicher Schritt, um eine richtige Abbildung der Zellen sicherzustellen. Da ConA eine geringe Löslichkeit in PBS (5 mg / ml), kann die Filtration der Entfernung von großen Aggregaten, die in der ungefilterten Lösung vorliegen und stören die Bildgebung. Zellen befestigen relativ stark auf die behandelte Oberfläche und die Zugabe der Lösung zu induzieren nicht die Lokalisierung der Zellen stören, was eine kontinuierliche Verfolgung vo...

Signalisierung über transduktionskaskaden oft gipfelt in der Expression von Proteinen. Die Charakterisierung des Expressionsprofils ist ein Schlüsselelement für das Verständnis der Funktion der biologischen Wege. Die Identifizierung des Spektrums hochreguliert Proteine ​​und die Dynamik ihrer Aktivierung kann durch verschiedene Techniken wie Mikroarrays, Northern-Blots und Western Blots 1-3 erreicht werden. , Im Durchschnitt jedoch diese Techniken die Antwort einer ganzen Population von Zellen. Um die Feinregulierung der Expression von Proteinen zu verstehen, ist es wünschenswert, Messungen auf Einzelzellebene zu sammeln. Idealerweise sollten diese Messungen auch quantitative Daten zugänglich mathematische Modelle des Basiswegs zu entwickeln. Mikroskopie und Durchflusszytometrie sind zwei Techniken, die ideal geeignet sind, wie quantitative Einzelzellmessungen liefern. Die endogenen Markierung von Proteinen mit einem fluoreszierenden Protein kann bE verwendet werden, um ihre Expression Level 4 zu quantifizieren. Da die Zugabe einer großen fluoreszierenden Gruppe am Terminus des Proteins kann es machen nicht-funktionellen, ist es jedoch oft wünschenswert, spezifische Expression Reporter basierend auf einem Promotor, der die Expression eines Fluoreszenz Konstrukt zu erzeugen. Dieses Reporter-Protein exogen zu dem zellularen System und daher nicht die Signalisierungsereignisse, die in der Zelle stattfinden, beeinflussen. Sowohl Mikroskopie und Durchflusszytometrie wurden weitgehend im Signalisierungsfeld Hefe verwendet. Als Beispiele; Colman-Lerner und Mitarbeiter korreliert sind, in einzelnen Zellen die Expression von spezifischen Paarung und konstitutiv exprimiert Reportern durch Mikroskopie, um den Lärm in Hefe Paarung Signalübertragungskaskade 5 quantifizieren, Acar und Kollegen verwendeten Durchflusszytometrie, um die regulatorische Netzwerk studieren Steuern der Expression der GAL-Gene 6. In einer früheren Studie 7 haben wir eine Kombina verwendetauf dieser zwei Techniken, um die Expressionsleistung aus der Hoch Osmolarität Glycerin (HOG) Weg in Hefezellen zu studieren. Diese Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Weg wird durch Hyper osmotischen Stress ausgelöst. Es führt zu der Aktivierung der MAPK Hog1, die in den Kern der Zelle transloziert, ein Transkriptionsprogramm, was zur Expression von etwa 300 Gene zu induzieren. Um diesen Prozess zu untersuchen, haben wir einen Ausdruck Reporter bezogen auf das STL1 Promotor (ein Gen, das unter den Hog1 Aktivität 8 induziert), die Expression von einem Vierfach-Venus fluoreszierendes Protein (p-STL1 qV) entwickelt hatten. Durchflusszytometrie Messungen entdeckt die Anwesenheit von zwei Populationen von Zellen bei mittleren Belastungsniveau (0,1 M NaCl) nur mit einem Bruchteil der Bevölkerung die fluoreszierenden Reporter exprimieren. Wir verwendeten Mikroskopie dieses Verhalten weiter zu untersuchen und entdeckt, dass dieses Geräusch in der Proteinexpression wurde durch intrinsische Faktoren 9 geregelt. Wir could beobachten weiter, dass Zellen, die mit einem ähnlichen Niveau von Hog1 Aktivität könnte auffallend unterschiedliche Expressionsergebnisse anzuzeigen. Die Kombination dieser beiden Techniken konnten wir zeigen, wie die langsamen Umbau der Stressantwortgene beeinflusst die Expression Ergebnis auf Einzelzellebene 7. In diesem Papier verwenden wir die Expression des p-STL1 qV Reporter durch hyper-osmotischen Schock als ein Beispiel für die Quantifizierung der Proteinexpression induziert durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Der gleiche Stamm bis 0,2 M NaCl beansprucht wurde mit beiden Methoden untersucht. Dies wird es uns ermöglichen, einige der wichtigsten Unterschiede in diesen beiden Techniken ergänzen sich zu markieren.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Yeast Nitrogen Base</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>CYN6202</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>CSM amino-acid mix</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>DCS0011</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Concanavalin A</td>
			 <td>GE Healthcare</td>
			 <td>17-0450-01</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Cycloheximide</td>
			 <td>Fluka Aldrich Sigma</td>
			 <td>C7698</td>
			 <td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>ySP9</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>pSP34</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope</td>
			 <td>Nikon</td>
			 <td>Ti-Eclipse</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope control software</td>
			 <td>Micro-manager</td>
			 <td>Ver 1.4.11</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Incubation chamber</td>
			 <td>LIS</td>
			 <td>The Box</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Fluorescence light source</td>
			 <td>Lumencor</td>
			 <td>SpectraX</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Camera</td>
			 <td>Hamamatsu</td>
			 <td>Flash 4.0</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Flow cytometer</td>
			 <td>BD</td>
			 <td>FACS calibur</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Sonicator bath</td>
			 <td>Telesonic</td>
			 <td>TUC-150</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>8-well-slide </td>
			 <td>Thermo Lab-tek</td>
			 <td>155409</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>96-well-plate</td>
			 <td>Matrical bioscience</td>
			 <td>MGB096-1-2-LG</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>FACS tube</td>
			 <td>BD Falcon</td>
			 <td>352054</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells

Die Quantifizierung der Genexpression auf Einzelzellebene deckt neuen Regulationsmechanismen bei Messungen auf Bevölkerungsebene durchgeführt verdeckt. Zwei Methoden, die auf Mikroskopie und Durchflusszytometrie werden dargestellt, um zu demonstrieren, wie solche Daten erfasst werden. Die Expression eines fluoreszierenden Reporter bei Aktivierung der hohe Osmolarität Glycerin MAPK in Hefe induziert wird als Beispiel verwendet. Die spezifischen Vorteile der einzelnen Verfahren werden hervorgehoben. Durchflusscytometrie misst eine Vielzahl von Zellen (10.000) und liefert ein direktes Maß für die Dynamik der Protein-Expression unabhängig von der langsamen Reifung Kinetik des fluoreszierenden Proteins. Abbildung von lebenden Zellen durch Mikroskopie ist im Gegensatz zu der Messung der gereiften Form der Reporter in weniger Zellen beschränkt. Jedoch können die Datensätze durch diese Technik erzeugt extrem reich durch die Kombinationen von mehreren Reportern und um die räumliche und zeitliche Informationen seinaus Einzelzellen erhalten. Die Kombination dieser beiden Messmethoden können neue Erkenntnisse über die Regulation der Proteinexpression durch Signalwege zu liefern.

Mikroskopie Hefe-Zellen, die das Reportergen Expression STL1 p-qV (ySP9 7) zu dem Boden des Bohrlochs-Schlitten angebracht ist und unter das Mikroskop gelegt. Die Zellen wurden während des Verlaufs der Bildgebungssitzung durch Zugabe von Stress Medium direkt in das Bohrloch gefördert. Dies ermöglicht es uns, ein paar Bilder von den Zellen vor Induktion Weg erwerben und folgen Sie ihr Schicksal nach der Stimulation. Im vorliegenden Fall wurden die Zellen für ca. 2 h mit e...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Aufrufe.  University of Lausanne.  Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen. 