وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1R21AG031965 - 01A1. عضو الكنيست هو باحث طبي جديد اليسون مؤسسة في الشيخوخة.

الجزء 1 : التحضير للثقافات الشيخوخة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالات متواصلة من الاهتمام من الأسهم المجمدة على لوحات أجار YEPD (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto - ببتون ، أغار 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في 30 ˚ مئوية لمدة 48 ساعة أو حتى تظهر المستعمرات واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار واحد وتحصين المستعمرات في 5 مل من السائل YEPD المتوسطة (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto - ببتون والجلوكوز 2 ٪) في أنابيب الاختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 30 ˚ C مع المحافظة على التحريض المستمر باستخدام إما شاكر أو طبل الدوارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح اصطناعي 5 مل من المتوسط ​​(SC) كاملة (الجدول 1) مع 50 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها. مستعدون عموما ثلاث ثقافات SC لكل سلالة لتقديم ثلاث نسخ المتماثل البيولوجية للحياة تمتد لتحليل كل سلالة يجري فحصها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الثقافات في 30 ˚ C مع التحريض المستمر على طبل الدوارة للتجربة بأكملها (عادة 2 أسابيع أو أكثر). </li></ol> الجزء 2 : أخذ صلاحية سن نقطة بعد يومين من ثقافة في وسائل الإعلام SC ، يجب أن تكون الخلايا في مرحلة ثابتة وأول سن نقطة على استعداد لاتخاذها. وينبغي اتخاذ سن لاحقة نقاط كل 2-3 أيام على الأقل لمدة اسبوعين. لكل نقطة العمر : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Bioscreen 100 جيدا لوحات العسل لتلقيح عن طريق ملء كل بئر مع 145 ميكرولتر من YEPD. تأكد من ترك واحدة على الأقل مملوءة بشكل جيد مع YEPD فقط وجود خلايا لتحليل البيانات في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الثقافات الشيخوخة من الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لفترة وجيزة الثقافة أول من تلقيح في لوحة قرص العسل ، في حين يجري الحرص على عدم تسرب أي من الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 5 ميكرولتر من الثقافة المختلطة وماصة عليه في أول بئر من لوحة قرص العسل. الشعلة فم كل أنبوب اختبار قبل وبعد إزالة قسامة 5 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء لكل ثقافة الشيخوخة وتأكد أن نلاحظ جيدا موقف المقابلة لكل ثقافة. وينبغي أن تستخدم بشكل جيد مواقف متطابقة في كل سن لاحقة نقطة في كافة مراحل التجربة برمتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الثقافات في الحاضنة 30 م ˚ عند الانتهاء من عملية التلقيح. </li></ol> الجزء 3 : تحميل وBioscreen آلة MBR C <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح مقصورة الحاضنة من خلال رفع الغطاء وإزالة الغطاء لعلبة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج لوحة تلقيح حديثا العسل في علبة العينة (استخدام فتحة اليسار اذا كنت تقرأ لوحة واحدة فقط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال غطاء لعلبة العينة وخفض غطاء لمقصورة الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق للتأكد من السائل نقل الحرارة فوق مستوى ملء الدنيا. إذا منخفضة ، وإضافة المزيد من استخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع حرارة السائل نقل المقدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bioscreen باستخدام البرمجيات &quot;EZExperiment&quot; ، تعيين المعلمات التالية للحصول على منحنيات نمو مناسبة للخميرة السكيراء : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد العينات : أدخل عدد من الآبار مع وسائل الإعلام أو 200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصفية : 420 - 580m الطوق ، الاتساع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> درجة الحرارة : 30 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المدة التجربة : 1 يوم ، 0 ساعة ، 0 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القياس الزمني : 30 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهز : تشغيل ، تهز المستمر ، وارتفاع </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;ابدأ&quot; لبدء القراءات. </li></ol> الجزء 4 : تحليل البيانات عادة ، يتم نقل ستة سن نقاط على مدار اسبوعين. تؤخذ نقطة العمر في أيام 2 و 4 و 6 و 9 و 11 و 13. اعتمادا على التصميم التجريبي والسلالات التي يجري اختبارها ، قد يكون من المرغوب فيه اتخاذ سن نقاط أكثر أو أقل أو لفترة أطول من 2 أسابيع. فمن المهم لتحميل لوحة قرص العسل في نفس الترتيب على كل نقطة في سن مثل هذه الثقافة أن كل الشيخوخة يتوافق مع موقف نفس البئر في كل نقطة في سن ، وهذا سيجعل تحليل البيانات أسهل بكثير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ملفات الناتج من الجهاز Bioscreen MBR C. يقوم البرنامج &quot;EZExperiment&quot; إخراج البيانات Bioscreen كملف المفصول متوافق مع Microsoft Excel وكذلك برامج أخرى. ويبين العمود الأول في وقت ما تم أخذ القياس OD أثناء التجربة ، مع الأعمدة اللاحقة يمثل كل جيدا في لوحات العسل Bioscreen (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حذف OD القراءة الأولى من كل عمود. هذه القراءة هي &quot;الضوضاء&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع البيانات عن طريق طرح قيمة OD البئر YEPD مع كل القيم وحدها من التطوير التنظيمي في كل عمود. هذا يزيل الامتصاصية الخلفية بواسطة وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنحنيات ثمرة. ومنحنيات التحول بوصفها وظيفة من العمر (الشكل 2). على سبيل المثال ، عن طريق رسم المنحنيات ثمرة من العمود 1 (1 جيدا لوحة قرص العسل) على مدار الساعة النقاط الست ، هناك تحولا نحو اليمين متميزة من المنحنيات على مر الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الوقت مضاعفة (δ) لبناء جيدا كل على حركية النمو من سن يوم 2 نقطة. المعادلة المستخدمة لحساب الوقت مضاعفة طليالي : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="معادلة" /> حيث التطوير التنظيمي والتطوير التنظيمي 1 2 تمثل قياسات متتالية OD ور 1 و 2 ر يجري في الوقت بين القياسات. حساب مضاعفة مرات فقط بين القيم OD من 0.2 من 0.5. متوسط ​​هذه القيم هي المرة مضاعفة لذلك جيدا. حساب مضاعفة مرات فقط بين القيم OD من 0.2 من 0.5. متوسط ​​هذه القيم هي المرة مضاعفة لذلك جيدا. وينبغي أن معظم السلالات البرية من نوع الخميرة تعطي قيمة مضاعفة الوقت ما بين 85 إلى 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل كل نقطة العمر ، وتحول لحساب الوقت (Δt) في منحنيات نمو بالنسبة للنقطة الأولي العمر (يوم 2). طريقة سهلة للقيام بذلك هي لتحديد الفرق في طول الوقت الذي استغرقته في كل جانب من أجل التوصل إلى OD 0.3 الأولي بين سن نقطة ولكل عصر لاحق نقطة. ويمكن حساب الوقت الذي وصل معين OD التي يعمل فيها 0.3 من معادلة الانحدار الخطي الموافق LN (OD) بوصفها وظيفة من الوقت بين أقواس two OD الوقت نقطة = 0.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسبة الباقين على قيد الحياة عند كل نقطة في سن من أجل توليد منحنى البقاء على قيد الحياة (الشكل 3). تحديد سن الأولي نقطة (يوم 2) أن بقاء 100 ٪. من أجل كل نقطة على التوالي سن حساب بقاء في المئة باستخدام المعادلة التالية : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="المعادلة الثانية" width="245" height="115" /> ق ن حيث نسبة البقاء على قيد الحياة هو ، Δt n هو التحول الوقت ، ون δ هي المرة مضاعفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء منحنيات البقاء على قيد الحياة (الشكل 3B) على النحو المرغوب فيه لكل (الآبار أو التكاثر) بشكل جيد من قبل المتهم بالتآمر في جزء (أو في المئة) من خلايا قابلة للحياة بوصفها وظيفة من العمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب لا يتجزأ بقاء (SI) لكل بئر. كما يتم تعريف SI المنطقة تحت منحنى البقاء ويمكن تقديره من خلال المعادلة التالية : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="المعادلة 3" width="400" height="79" /> ن حيث العصر هو عصر نقطة (مثل 2 و 4 و 6 و 9 و 11 و 13) وق ن هي قيمة البقاء في تلك المرحلة العمرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المعلمات الإحصائية الآبار نسخ من البيانات SI والبقاء. المعلمات الإحصائية ذات الاهتمام المشترك وتشمل تعني ، الوسيط ، والتباين لكل مجموعة من يعيد البيولوجية. ويمكن استخدام اختبار t أو تحليل مماثل للمقارنة البشرى من SI التجريبية لمختلف الجماعات والسيطرة عليها. قد يكون من المستحسن أيضا لتوليد منحنيات البقاء على قيد الحياة ، كما هو موضح في 4.8 من متوسط ​​مكررات البيولوجية. </li></ol> الجزء 5 : نتائج الممثل عند الانتهاء من هذه التجربة ، سيكون لديك رسم منحنى البقاء وإجراء تحليل بيانات كافية لتحديد إمكانية ترتيب زمني الشيخوخة لعدة سلالات مختلفة أو شروط. إذا أجريت بشكل صحيح ، يجب أن منحنيات النمو التي حصل عليها من آلة Bioscreen MBR C تبدو مشابهة لتلك التي تظهر في الشكل (2) ومنحنيات البقاء على قيد الحياة مما ينبغي أن تشبه تلك التي تظهر في الشكل 3. عموما ، سوف البرية من نوع الخلايا المستزرعة في ظل الظروف الموصوفة هنا يكون متوسط ​​العمر الزمني تمتد بناء على أمر من 7 أيام. لوحظ وجود تباين كبير في بقاء في سلالات مختلفة وفقا لبعض الشروط ، مثل النمو في وسائل الإعلام الجلوكوز بنسبة 0.05 ٪ ، يمكن أن متوسط ​​بقاء تتجاوز 30 يوما. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> بيانات الناتج الرقم 1. من &quot;EZExperiment&quot; Bioscreen البرنامج. يعرض العمود A في الوقت الذي اتخذ قراءة الامتصاصية. الأعمدة المتتالية تمثل آبار لوحة قرص العسل تلقيح مع خلايا مأخوذة من ثقافات الشيخوخة. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> الشكل 2. منحنيات ثمرة من تكرار بيولوجية واحدة على مدار تجربة. هناك تحول واضح في منحنيات بمرور الوقت مع الخلايا في ثقافة الشيخوخة تفقد قدرتها على البقاء. طول الفترة الزمنية بين النقطة مرة الأولي (يوم 2) ونقطة زمنية متعاقبة يحدد صلاحية في ذلك سن معينة. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> الشكل 3. أ) منحنى بقاء إنشاؤها باستخدام البيانات ثمرة من الشكل 1. يتم تعيين نقطة اليوم الساعة 2 كنقطة البقاء بنسبة 100 ٪. B) منحنيات البقاء على قيد الحياة الختامية لسلالتين اختباره في التجربة نفسها. هذه المنحنيات بقاء تمثل viabilities متوسط ​​ثلاثة البيولوجية يعيد لكل سلالة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري ضمن البيولوجية يتطابق. المنطقة المظللة تحت المنحنى بقاء يمثل جزءا لا يتجزأ البقاء على قيد الحياة (SI) لسلالة 1. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> الجدول 1. الاصطناعية المستخدمة لمعرفة متوسطة زمني دراسات الشيخوخة (سلالة backgrouBY4743 الثانية) </td></tr><tr><td> مكون </td><td> تركيز (ز / لتر) </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> 20 </td></tr><tr><td> الخميرة قاعدة النيتروجين (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> الأدينين </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - ارجينين </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - حمض الأسبارتيك </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - حمض الجلوتاميك </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> الحامض الأميني L - </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - يسين </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L - يسين </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L - الميثيونين </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - فينيلالاناين </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - سيرين </td><td> 0،375 </td></tr><tr><td> L - ثريونين </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> تريبتوفان L - </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - التيروسين </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L - حمض أميني أساسي </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> اليوراسيل </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> ملاحظة : هذه وصفة لحسابات auxotrophies في سلالة BY4743 مضاعفا. ينبغي التعويض auxotrophies الأحماض الأمينية للبإضافة تركيز 5X النهائية والمتوسطة الكامل الاصطناعية.

<ol>
	<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).</li><li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast.">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).</li><li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).</li></ol>

الحياة زمني عالية الإنتاجية مقايسة تمتد الموصوفة هنا هو وسيلة فعالة لقياس القدرة الشيخوخة أعداد كبيرة من السلالات ذات الدقة العالية والدقة. التقدم الرئيسي لهذا الأسلوب أكثر من الطرق التقليدية لتحديد بقاء على قيد الحياة من خلال إحصاء الوحدات المكونة للمستعمرة (انظر...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacto Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>288620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.</td>
<td>Reagent</td>
<td>MidSci</td>
<td>J630-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum</td>
<td>AM185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>D16-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen C MBR machine</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>5101370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen 100-well Honeycomb plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>9502550</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells

الخميرة في مهدها<em&gt; السكيراء الجعوية</em&gt; وقد ثبت أن كائن نموذجا هاما في مجال البحوث الشيخوخة<sup&gt; 1</sup&gt;. وتنسخي ويمتد زمنيا الحياة هما النماذج المستخدمة لدراسة وضع الشيخوخة في الخميرة. وتعرف الشيخوخة تنسخي حيث بلغ عدد خلايا الخميرة والدة ابنة وحيدة الخلية تنتج قبل الشيخوخة ، ويمكن تعريف الشيخوخة الزمني بواسطة طول الوقت خلايا البقاء في حالة هدوء غير تقسيم شبيهة<sup&gt; 2</sup&gt;. طورنا أسلوب الإنتاجية العالية للقياس الكمي لمدى الحياة زمني. هذا الأسلوب ينطوي شيخوخة الخلايا في المتوسط ​​في إطار تعريف التحريض وعند درجة حرارة ثابتة. في كل نقطة العمر ، تتم إزالة السكان فرعية من الخلايا من الشيخوخة وتحصين الثقافة المتوسطة في النمو الغنية. بعد ذلك يتم الحصول على النمو وارتفاع القرار منحنى لهذه الفئة من السكان دون سن من الخلايا باستخدام آلة Bioscreen MBR C. ثم يتم تطبيق خوارزمية لتحديد الحصة النسبية من خلايا قابلة للحياة في كل من الفئات السكانية الفرعية على أساس حركية النمو في كل نقطة في سن. هذه الطريقة تتطلب وقتا أقل بكثير والموارد بالمقارنة مع غيرها من المقايسات عمر زمني مع الحفاظ على استنساخ والدقة. ينبغي للطبيعة عالية الإنتاجية من هذا الاختبار يسمح للشاشات واسعة النطاق الوراثية والكيميائية لتحديد معدلات طول العمر رواية للمزيد من التجارب في الكائنات الحية أكثر تعقيدا.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells at JoVE.com

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

الشيخوخة في الخميرة الزمني يشير الى فقدان قابلية الخلايا المرتبطة بها مع مرور الوقت في مرحلة ثابتة. نحن هنا وصف أسلوب الإنتاجية العالية لتحديد كميا مدى الحياة الخميرة زمني.

قياس سبان الخميرة الحياة الزمني بواسطة خلايا ثمرة المسنين

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Views.  University of Washington. الشيخوخة في الخميرة الزمني يشير الى فقدان قابلية الخلايا المرتبطة بها مع مرور الوقت في مرحلة ثابتة. نحن هنا وصف أسلوب الإنتاجية العالية لتحديد كميا مدى الحياة الخميرة زمني.

Video: Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

تقنية التصوير السريع للخلايا الخميرة لايف مشلول

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.