نود أن نشكر ديفيد رودريغيز، MA لتصميم الرسوم البيانية والتصوير في هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من GCCRI، المعاهد الوطنية للصحة / NIA (5R21AG033339) ودعم مركز السرطان غرانت (P30CA054174) إلى مرفق UTHSCSA التدفق الخلوي الأساسية ومرفق UTHSCSA المتقدم الأحماض النووية الأساسية.

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

ويستند في الجسم الحي الطفرات مقايسة الموصوفة هنا على اسي نموذج الفأر وراثيا ولدت في الأصل من قبل كولر وآخرون 18 وهذا النموذج يستخدم ناقلات λ فج يحمل الجين مراسل اسي. اثنين كوس مواقع المرافقة ناقلات تسمح للانتعاش بسيط نسبيا والتعبئة والت?...

<html> في معظم أنسجة وخلايا متباينة لديها محدودة مدى الحياة. للحفاظ على سلامة وظيفية، والخلايا الجذعية الأنسجة محددة الأجل الطويل تنتج باستمرار الخلايا الاصلية التي تعطي بدورها إلى ظهور خلايا متباينة تماما المطلوب للوظيفة أن الأنسجة معينة. الخلايا الجذعية أيضا تجديد المقصورة الخاصة بهم من خلال عملية تسمى التجديد الذاتي. وبالتالي، والخلايا الجذعية هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة وظيفية من الأنسجة التي يقيمون فيها ولذلك، لا بد من أن أنها مجهزة آليات قوية لاستشعار ويحتمل أن إصلاح تلف الحمض النووي. إذا لم يكن كذلك، قد يكتسب متعددة الجيني (يمكن أن تكون ضارة) الاضطرابات، والتي يمكن أن تكون موروثة من قبل ذريتها. فهم كيفية الخلايا الجذعية آمن حراسة الجينوم أثناء العمر الافتراضي للكائن الحي هو السؤال المهم، وربما تساعدنا على فهم لماذا يرتبط عدم الاستقرار الجيني مع السرطان وبعض الأمراض المرتبطة بالعمر أخرى (إعادة النظر في 1،2). الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; السيطرة على سلامة الجينوم من الأنسجة على مستوى الخلايا الجذعية أو السكان الخلية السلف في وقت مبكر يمكن أن يتحقق إما عن طريق القضاء على عيب الجذعية (أو السلف) الخلايا عبر موت الخلية، الشيخوخة أو التمايز، و / أو عن طريق إصلاح كفاءة الحمض النووي للتلف. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أنه من الممكن لقياس أنواع معينة من إصلاح الحمض النووي مباشرة في هؤلاء السكان نادرة 3-6. تم العثور على أنه، على سبيل المثال في نظام المكونة للدم، فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة يمكن إصلاحه من قبل إعادة التركيب مثلي (HR) أو نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ)، ويجري هذا الأخير عملية إصلاح الدنيا الإخلاص، وبالتالي زيادة خطر اتخاذ أخطاء. وتستخدم في كل من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) 4،5، ولكن في الفئران يبدو أنها في الغالب NHEJ في HSCs في حين أن الخلايا الأسلاف في وقت مبكر الاستفادة من الموارد البشرية 4. وقدم ملاحظة مماثلة للخلايا الجذعية في الجلد 6. ومن المثير للاهتمام، في الإنسان HSCs الموارد البشرية، لا NHEJ،ويبدو أن آلية إصلاح خيار لفواصل حبلا مزدوجة 3. إذا كان هذا الفرق الوظيفي بين النوعين هو حقيقي أو يمثل الفرق تكنولوجية أو مجرد التجريبية يبقى أن نرى. مرجع خلية الجذعية لإصلاح تلف الحمض النووي من المرجح أن تشمل آليات إصلاح الحمض النووي الأخرى، مثل إصلاح قاعدة الختان (ديسمبر)، النوكليوتيدات إصلاح الختان (NER) وإصلاح عدم تطابق (MMR). البر وNER هي المسؤولة عن إصلاح الآفات الزوج قاعدة واحدة أو متعددة في الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل، في حين عدم التطابق إصلاحات MMR قاعدة قاعدة والحلقات الإدراج / حذف؛ هذه الأنواع من الحمض النووي من التلف لا يمكن إصلاحه من قبل NHEJ أو الموارد البشرية. دعم هذه الفكرة العديد من الدراسات من نظام المكونة للدم مما يدل على وجود صلة بين التعديلات في واحدة من هذه الممرات وتشوهات في المقصورة HSC 7-9، فضلا عن زيادة خطر تطور متلازمة خلل التنسج النقوي 10-16، وهو المرض الذي ينشأ فيويرتبط شهادة الثانوية العامة وذلك مع زيادة عدم الاستقرار الجيني كما تقدم المرض 17. اعتبارا من بعد، لم يتم الإبلاغ عن قياسات البر، نير وMMR مباشرة في HSCs. بالإضافة إلى توضيح العمليات المختلفة التي تتحكم في سلامة الأنسجة على مستوى الآلية، لا بد أن تكون قادرة على قياس مدى تحور الحمض النووي، بحيث يمكن اختبار عواقب الانحرافات في واحدة من هذه العمليات، على سبيل المثال في الحالات العادية مقابل راثيا الخلايا الجذعية هندسيا أو القديمة مقابل الشباب. ومع ذلك، وضع مقايسة ذات الصلة من الصعب بسبب ندرة الخلايا الجذعية الأنسجة محددة وعدم وجود ظروف الثقافة التي تحافظ على &quot;stemness&quot;. علاوة على ذلك، ينبغي أن يكون مثل هذا الفحص قابلة للتعديل إلى التلاعب البيئية والوراثية. أحد الحلول الممكنة لهذه القيود والمتطلبات هو استخدام نماذج الماوس التي صممت خصيصا للكشف عن الطفرات الحمض النووي. مولوقد وضعت نماذج الماوس المعدلة وراثيا tiple للكشف عن الطفرات. على سبيل المثال، اسي الفئران المعدلة وراثيا 18 تحمل استرداده λ ناقلات فج ترميز نظام مراسل اسي، الذي الجين يشفر اسي القامع للمشغل لاك وبمثابة مراسل الطفرة. على تحور الجين اسي، يتم تنشيط المشغل لاك ويتم إنتاج β-غالاكتوزيداز. يشق β-غالاكتوزيداز ومولد اللون الركيزة X-غال (5-برومو-4-كلورو الإلكترونية indolyl-β-D-galactopyranoside)، الذي يحوله الأزرق. مواقع كوس المرافقة ناقلات اسي يسمح الانتعاش سهلة من خلال امدا البروتينات فج والعدوى اللاحقة من E. القولونية. بعد احتضان E. المصابة القولونية على الاغاروز التي تحتوي على الركيزة X-غال، يمكن وسجل لويحات. ويحات زرقاء تحتوي على متحولة المفترضة لاك-I تحمل فج، في حين لويحات واضحة تؤوي غير المسوخ. تردد لويحات زرقاء (من بين اله منها واضح) يدل على التردد متحولة في عدد السكان الخلية الأصلية تم استخراج الحمض النووي من. وعلاوة على ذلك، فإن فج λ استضافة هدف اسي يمكن أن تكون متسلسلة بسهولة باستخدام تقنيات PCR للتحليل إنتاجية عالية نسبيا. وسوف تتابع متعددة الجينات الطافرة اسي تكشف عن معلومات مهمة حول الطيف الطفرة، والتي بدورها قد تشير إلى أوجه القصور المحتملة في مسارات محددة إصلاح الحمض النووي أو الأحداث سمية جينية محددة. تم توحيد نظام المعدلة وراثيا اسي عبر مختبرات متعددة 19 وتتوفر الكواشف تجاريا. واحد العيب الرئيسي لنظام اسي هي قدرة محدودة للكشف عن عمليات الحذف كبيرة أو إعادة ترتيب، وبالتالي، وأساليب أخرى، على سبيل المثال متعددة الألوان FISH على هوامش الطورية حاجة لاستخدامها لتكمل هذا النقص. داخل ناقلات λ فج من طراز اسي الماوس، هناك الجين أصغر بكثير، CII، وهي متاحة للتحليل الطفرة. حجمها، وحقيقة أن المسوخ يمكن اختيار يجعل هذا أقل كثيفة العمالة وأرخص مقايسة 20 من تحليل الجينات اسي. ومع ذلك، يتم دراسة هذا الجين اسي أكثر على نطاق واسع ل21 الطفرات وحساسية الجينات إلى حدوث طفرات اتسم جيدا حتى لا يكون هناك فهم واضح من مخلفات الأحماض الأمينية التي تولد استجابة المظهري على ركيزة مولد اللون 22-25. وتشمل نماذج الماوس الأخرى للكشف عن طفرة استخدام ΦX174 أو الجينات المحورة LacZ. نموذج الفأر وراثيا ΦX174، مع A الأصلي: T → G: C طفرة الارتداد مقايسة 26 أو الطفرة مقايسة 27 قدما التي تسمح الكشف عن مجموعة متنوعة من بدائل الزوج القاعدة، يمثل النظام أقل تكلفة من طراز اسي. ومع ذلك، فإن شاشة طفرية في مقايسة إلى الأمام ليست تافهة والمواصفات الطفرةليس كما يتميز جيدا trum من التحوير ΦX174 كما ان من اسي. في نماذج الماوس تحمل الجينات المحورة LacZ، يتم استرداد مراسل طفرية LacZ الاستفادة E. الخلايا المضيفة القولونية التي تعتبر حساسة لالجالاكتوز والمتوسطة التي تحتوي على اللبن 28. ومن عيوب هذا النظام هو أن انتعاش الهدف LacZ ينطوي أيضا على تقييد نوكلياز داخلية الهضم تليها ربط و electroporation من E. تستضيف القولونية، مما يجعل من الصعب على التكيف مع النظام لأعداد صغيرة من الخلايا. على الرغم من أنه ليس شرطا مطلقا للعمل مع السكان الخلايا الجذعية / السلف (واحد يمكن أن تبدأ دائما مع مزيد من الفئران)، إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من الخلايا (مثل الملايين أو أكثر) وسوف يصبح غير عملي بسرعة وباهظة التكلفة. أيضا، حجم كبير نسبيا من LacZ، مع توفير مراسل طفرية حساسة، هي مرهقة ومكلفة أكثر للتحليل تسلسل الحمض النووي وdetermination من طفرة الأطياف. والميزة الرئيسية لهذا النموذج ومع ذلك، هو قدرتها على الكشف عن الحذف والإدراج كبيرة، فضلا عن إعادة ترتيب الكروموسومات. حيث أن جميع الخلايا في نماذج الماوس المعدلة وراثيا اسي، ΦX174 وLacZ تحمل نظام المراسل، أي من هذه النماذج الماوس يمكن استخدامها لقياس الطفرات في أي نوع من الخلايا في المصالح، بما في ذلك الخلايا الجذعية والسلف، طالما أنها يمكن أن تحصد موثوق وبأعداد كافية. لأن كان لدينا خبرة واسعة مع نموذج الفأر اسي واسي فحص الطفرة، قررنا متابعة هذا النظام لتحليل مزيد من الطفرات في الجذعية المكونة للدم والسكان السلف. الأنسجة المكونة للدم يتميز جيدا من حيث النمط الظاهري سطح الخلية مكوناته الفردية، بما في ذلك إعادة إسكانها الخلايا الجذعية طويلة الأجل، والتي يمكن تحديدها على النحو السكان نادرة للغاية من لين - IL7R <suع&gt; - هيئة السلع التموينية-1 + + + cKit (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - الخلايا 29. . Mohrin 4 آخرون أظهرت أن عدد السكان أكبر قليلا من LSK/Flk2 - خلايا لا تزال جيدة لممثلي HSCs وتختلف اختلافا كبيرا من الأكثر بدائية السلف النخاعي ملتزمة (CMP) السكان عندما يتعلق الأمر بدراسة إصلاح الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، عندما LSK HSC المخصب (FLK-2 + وFLK-2 -) وتمت مقارنة الخلايا إلى لين - IL7R - هيئة السلع التموينية-1-cKit + + (الخلايا الاصلية LS-K)، وكان لا يزال هناك اختلاف كبير في NHEJ قدرة 5 بين أقل نقية، وقف التخصيب خلية السكان LSK والخلايا الاصلية. في دراستنا نستخدم HSC التخصيب LSK (FLK-2 + وFLK-2 -) خلايا لأننا وجدنا أن لا يقل عن 2 × 10 5 خلايا مطلوبة ل، نتائج متسقة يمكن الاعتماد عليها في هذا الطفرات فحص، وهذا هو عدد الخلايا في غاية الصعوبةللحصول على واحدة عند فرز LSK/Flk2 - السكان CD150 + CD48 أو حتى LSK/Flk2 - السكان (من حيث الفئران والتكاليف والتطبيق العملي). هذا البروتوكول، على أساس واحد ضعت أصلا من قبل كولر وآخرون 18 يصف بالتفصيل كيف يمكن تحديد عفوية تردد متحولة الحمض النووي في الخلايا LSK والسكان من خلايا الدم النخاعي متباينة وكذلك خلايا نخاع العظم والطحال unseparated محددة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

في السنوات الأخيرة، أصبح واضحا أن عدم الاستقرار الجيني يرتبط بإحكام لكثير من اضطرابات النمو، والسرطانات، والشيخوخة. نظرا إلى أن الخلايا الجذعية هي المسؤولة عن ضمان التوازن وإصلاح الأنسجة في جميع مراحل الحياة، فمن المعقول أن نفترض أن السكان الخلايا الجذعية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة الجينوم من الأنسجة. لذا، قد نشأ اهتمام كبير في تقييم تأثير العوامل الذاتية والبيئية على سلامة الجينوم في الخلايا الجذعية وذريتها، التي تهدف إلى فهم مسببات أمراض الخلايا الجذعية القائمة. اسي الفئران المعدلة وراثيا تحمل استرداده λ ناقلات فج ترميز نظام مراسل اسي، الذي يخدم هذا الجين كما اسي مراسل الطفرة. نتيجة لاسي الجين المتحور هو إنتاج β-غالاكتوزيداز أن يشق ركيزة مولد اللون، ويحولها الأزرق. نظام مراسل اسي هو أنني نفذتن جميع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية / السلف ويمكن بسهولة أن تعافى واستخدامها لاحقا تصيب E. القولونية. بعد احتضان E. المصابة القولونية على الاغاروز التي تحتوي على الركيزة الصحيحة، يمكن لويحات وسجل؛ ويحات زرقاء تشير إلى وجود اسي الجين الطافر، في حين لويحات واضحة تؤوي من النوع البري. تواتر الأزرق (بين واضح) لويحات يدل على التردد متحولة في عدد السكان الخلية الأصلية تم استخراج الحمض النووي من. سوف تسلسل الجين الطافر اسي تظهر في موقع من الطفرات في جين ونوع من الطفرات. وراسخة في نموذج الفأر وراثيا اسي باعتبارها في الجسم الحي الطفرات الفحص. وعلاوة على ذلك، تتوفر تجاريا الفئران والكواشف لفحص. نحن هنا تصف بالتفصيل كيف يمكن تكييف هذا النموذج لقياس التردد التي تحدث بشكل عفوي المسوخ الحمض النووي في الخلايا الجذعية التخصيب لين - IL7R - هيئة السلع التموينية-1 + + + cKit (LSK) الخلايا والمجموعات السكانية الفرعية الأخرى التابعة لمنظومة المكونة للدم.

<html> في الجسم الحي الطفرات فحص يقيس حدث نادر (PFUs متحولة) من بين العديد من الأحداث (كل PFUs). عن طريق إجراء فحص مع عدد صغير من الخلايا، فمن الممكن أن حصيلة يتأثر إلى حد كبير من خلال النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة. لمعالجة هذه المسألة أجرينا تجربة التخفيف ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

تحديد طفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية/السلفية المكونة للدم المنقاة | علم المناعة والعدوى | فيديو

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

نحن هنا تصف في الجسم الحي الطفرات فحص لأعداد صغيرة من الخلايا المكونة للدم تنقيته باستخدام اسي نموذج الفأر وراثيا. الجين اسي يمكن عزل لتحديد التردد، والموقع، ونوع من المسوخ الحمض النووي نشأت عفويا أو بعد التعرض لgenotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

identifying-dna-mutations-purified-hematopoietic-stemprogenitor

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Population Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K Views.  UT Health Science Center at San Antonio.  نحن هنا تصف في الجسم الحي الطفرات فحص لأعداد صغيرة من الخلايا المكونة للدم تنقيته باستخدام اسي نموذج الفأر وراثيا. الجين اسي يمكن عزل لتحديد التردد، والموقع، ونوع من المسوخ الحمض النووي نشأت عفويا أو بعد التعرض لgenotoxins. 

Video: Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

تحديد الجينات المستحثة بواسطة Dysregulated الفيروسة ساركومة المرتبطة كابوزي (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

تشكيل خلية مستعمرة (CFC) للخلايا المكونة للدم الفحص الإنسان

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

حقن النظامية من الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الفئران مع EAE المزمن

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...