Biz bu yazının grafik tasarım ve fotoğraf için David R. Rodriguez, MA teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma UTHSCSA Sitometrisi Çekirdek imkan ve UTHSCSA Gelişmiş Nükleik Asitler Çekirdek Tesisi GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) ve Kanser Merkezi Destek Hibe (P30CA054174) fon tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Burada tarif edilen in vivo mutajenezi, ilk deney Kohler et al. 18 Bu model, lacI genini taşıyan bir raportör λ faj vektörü kullanır tarafından oluşturulan LacI transgenik fare modeline dayanır. Vektör bulaşıcı faj parçacıkları halinde nispeten basit bir iyileşme ve daha sonraki ambalajlama için izin komşu iki cos siteleri, E. enfekte etmek için kullanılır coli. Bir mavi plak faj ile enfekte edilmiş E. tarafından ...

Çok dokusunda, farklılaşmış hücreler sınırlı bir yaşam süresi vardır. Fonksiyonel bütünlüğünü korumak için, uzun ömürlü, dokuya özel kök hücreler sürekli olarak da söz konusu doku işlevi için gerekli olan tam olarak farklılaşmış hücrelere neden progenitör hücreler üretir. Kök hücreler aynı zamanda kendini yenileme olarak adlandırılan bir süreçte kendi bölmesini doldurmak. Böylece, kök hücreler nedenle içeri ikamet dokusunun fonksiyonel bütünlüğünün korunmasından sorumlu olan, bunların hasarlı DNA&#39;yı duygusu ve potansiyel onarmak için sağlam mekanizmalar ile donatılmış olması zorunludur. Değilse, onların soyu ile kalıtsal olabilir çoklu genomik (zararlı) tedirginlikler, edinebilirler. Kök hücreler bir organizmanın ömrü boyunca kendi genomunu güvenli-guard nasıl anlamak önemli bir sorudur ve genomik istikrarsızlık kanser ve (1,2 gözden) diğer bazı yaşa bağlı hastalıklar ile bağlantılı neden anlamamıza yardımcı olabilir. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; kök hücre veya erken projenitör hücre popülasyonlarının düzeyinde bir doku genomik bütünlüğünü kontrol / hücre ölümü, yaşlanma ya da farklılaşma ile kök hücrelerinin kusurlu (veya progenitör) ortadan kaldırılması, ve her iki tarafından ya da etkili bir tamir ile elde edilebilir hasarlı DNA. Son çalışmalar, bu nadir popülasyonlarda 3-6 doğrudan DNA onarımı belirli türde ölçmek mümkün olduğunu göstermiştir. Bu, örneğin, hematopoietik sistem içinde, çift iplikli DNA sonları (NHEJ), ikincisi daha düşük aslına uygunluk onarım işlemi olmak ve böylece yapma riski birleştirme, homolog rekombinasyon (HR) ya da homolog olmayan sonunda tamir edilebilir olduğu bulunmuştur hataları. Hem hematopoetik kök hücre (HSC) 4,5 olarak kullanılmaktadır, ancak, farelerde erken ataları hücrelerin HR 4 kullanmak ise o HKH&#39;lerin ağırlıklı NHEJ görünüyor. Benzer bir gözlem cilt 6 kök hücreleri için yapıldı. İlginç bir şekilde, insan HSC İK değil, NHEJ,çift ​​iplikli sonları 3 için tercih tamir mekanizması gibi görünüyor. İki tür arasındaki bu işlevsel fark gerçek ya da sadece bir teknolojik ya da deneysel farkı temsil olsun görülecektir. Hasarlı DNA tamir Bir kök hücrenin repertuarı, baz eksizyon tamiri (BER), nükleotid eksizyon tamir (NER) ve uyumsuzluğu onarım (MMR) gibi diğer DNA onarım mekanizmaları dahil etmek olasıdır. DNA hasarı bu tür NHEJ veya İK tarafından tamir edilemez; MMR düzeltmeleri baz baz uyumsuzlukları ve ekleme / silme while döngüleri BER ve NER, tek sarmallı DNA tek veya birden fazla baz çifti lezyonların tamiri için sorumludur. Bu kavramı desteklemek HSC bölme 7-9, bu yolların ve anormalliklerin birinde değişiklikler arasında bir bağlantı gösteren hematopoietik sistemi yanı sıra, miyelodisplastik sendrom 10-16 kaynaklanan bir hastalığa yakalanma riski birçok çalışmalarHSC ve hastalık ilerledikçe 17 genomik instabilite artan ile ilişkilidir. Henüz itibariyle, doğrudan HKH&#39;lerin BER, NER ve MMR ölçümleri rapor edilmemiştir. Mekanik bir düzeyde doku bütünlüğünü kontrol çeşitli işlemleri açıklık ek olarak, bu işlemlerin biri sapmalarını sonuçları genetik karşı, normal olarak, örneğin, test edilebilir, böylece mutasyona uğramış DNA seviyesini ölçmek mümkün zorunludur mühendislik kök hücreleri veya genç, karşı eski içinde. Bununla birlikte, ilgili bir tahlilin geliştirilmesi için dokuya özel kök hücrelerin yetersizliği ve &quot;stemness&quot; korur kültür koşulları eksikliği zordur. Ayrıca, bu tür bir deney Çevresel ve genetik manipülasyonlara iyileştirilebilir olmalıdır. Bu sınırlamalar ve gereksinimlerine Muhtemel bir çözüm, özellikle DNA mutasyonları tespit etmek için tasarlanmıştır fare modelleri kullanılmasıdır. Mulmutasyon tespiti için tiplemesine transgenik fare modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, transgenik fareler, LacI 18 LacI gen Lac operatörün bastırıcı kodlayan ve mutasyon muhabir olarak hizmet ettiği LacI raportör sistemi kodlayan bir geri kazanılabilir λ faj vektörü taşır. LacI geninin mutasyon üzerine, Lac operatör etkinleştirilir ve β-galaktosidaz üretilir. β-galaktosidaz böler mavi döner kromojenik alt-tabaka X-gal (5-bromo-4-kloro-e-indolil-β-D-galaktopiranosid). LacI vektörü yan cos siteleri lambda faj protein ve E, daha sonraki enfeksiyonlar ile kolayca giderilmesini sağlar coli. E. inkübe edildikten sonra, enfekte coli X-gal alt tabakayı içeren agaroz, plaklar attı olabilir. Net plaklar olmayan mutantlar liman iken mavi plaklar, Lac-I fajının taşıyan bir farazi mutant içerir. Inci arasında mavi plakların frekansı (e açık olanlar) DNA ekstre edilmiş orijinal hücre popülasyonunda mutant frekansı gösterir. Ayrıca, LacI hedef barındıran λ fajlar, nispeten yüksek verimli analizi için PCR teknikleri kullanılarak dizilenebilir. Birden mutant LacI genleri Dizmek da spesifik DNA onarım yollarındaki olası eksiklikler veya belirli genotoksik olaylara işaret edebilir mutasyon spektrumu hakkında önemli bilgiler ortaya koyacaktır. LacI transgenik sistemi, çok sayıda laboratuarlar 19 standartlaştırıldı ve ayıraçlar piyasada mevcuttur. LacI sistemin bir dezavantajı, büyük silinti ve yeniden düzenlemeleri tespit etmek için sınırlı bir yeteneği vardır, bu nedenle, metafaz yayılır diğer yöntemler, örneğin çok renkli FISH bu eksikliği iltifat için kullanılması gerekmektedir. LacI fare modeli λ faj vektörü içinde, çok daha küçük bir gen, CII orada, Mutasyon analizi için kullanılabilir. Boyutu ve mutantlar seçilebilir olması bu LacI gen analizi daha az emek-yoğun ve daha ucuz deney 20 hale getirir. Bir kromojenik alt tabaka 22-25 bir fenotipik yanıt oluşturmak amino asit kalıntılarının bir anlaşılması olduğu Bununla birlikte, LacI gen daha kapsamlı mutagenez 21 ve mutasyon genin hassasiyeti için çalışılmıştır, iyi karakterize edilmiştir. Mutasyon tespiti için diğer fare modelleri ΦX174 ya da LacZ transgenlerin kullanımı bulunmaktadır. T → G: Orijinal A ΦX174 transgenik fare modeli, C reversiyon mutasyon deneyi 26 veya baz çifti değiştirmelerin bir spektrum algılama, LacI modele göre daha az maliyetli bir sistem temsil verir ileri mutasyon deneyi 27. Bununla birlikte, ön deneyde mutasyon ekran önemsiz ve mutasyon spec değilΦX174 transgen TRUM olarak LacI bu kadar iyi karakterize değildir. LacZ transgenini taşıyan fare modellerinde, LacZ raportör mutasyon E. kullanılarak elde edilir galaktoz ve 28 galaktoz içeren ortama duyarlı olan coli konakçı hücreler. Bu sistemin bir dezavantajı, LacZ hedefin iyileşme de E. ligasyonu ve elektroporasyon takiben sınırlandırma endonükleaz sindirim içerir olmasıdır coli böylece zor hücreleri küçük sayılar için sisteme adapte yapma, ev sahipliği yapıyor. Bu kök / progenitör hücre popülasyonları ile çalışmak için mutlak bir gerekliliktir (bir zaman daha fareler ile başlayabilir) olmamasına rağmen hücreleri çok sayıda (örneğin, milyonlarca ya da daha fazla) gerekiyorsa, hızlı pratik ve maliyet engelleyici olacaktır. Hassas bir mutasyon muhabir sağlarken, aynı zamanda, LacZ nispeten büyük boyutlu, hantal ve DNA sekans analizi ve unsurlar için daha maliyetlidirmutasyon spektrumları ination. Bu modelin önemli bir avantajı ise, geniş eksiltmeler ve ilaveler tespit etme yeteneği, hem de kromozomal yeniden düzenlemeleri olan. LacI, ΦX174 ve LacZ transgenik fare modellerinde tüm hücreler raportör sistemi taşımak için, bu fare modellerinin herhangi biri gibi uzun süre güvenilir bir şekilde hasat edilebilir, kök ve projenitör hücreleri dahil olmak üzere, ilgi konusu her bir hücre tipinde mutagenez ölçmek için kullanılabilir ve yeterli sayıda. Biz LacI fare modeli ve LacI mutasyon deneyi ile geniş bir deneyim oldu çünkü, biz hematopoetik kök ve progenitör toplumlarda mutagenez analizi için bu sistemi daha sürdürmeye karar verdi. Hematopoetik doku Lin derece nadir nüfus olarak tanımlanabilir olan uzun vadeli repopulating kök hücreleri de dahil olmak üzere bireysel bileşenler, hücre yüzeyi fenotip açısından iyi karakterize olduğunu - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + cKit + + (LSK&#39;ya) / Flk2 - CD150 + CD48 - hücreleri 29. . DNA onarım eğitim söz konusu olduğunda hücreler hala HKH&#39;lerin için iyi temsilcileri olan ve en ilkel taahhüt miyeloid progenitör (CMP) nüfus önemli derecede farklı - Mohrin ark 4 LSK/Flk2 biraz daha büyük nüfus olduğunu göstermiştir. Ayrıca, zaman HSC bakımından zenginleştirilmiş LSK (Flk-2 + ve Flk-2 -) - IL7R - hücreler, Lin karşılaştırıldı Sca-1-cKit + + (LS-K progenitor hücreler), önemli bir fark yine yoktu az saf arasında NHEJ yeteneği 5, hücre ile zenginleştirilmiş LSK&#39;ya nüfusu ve progenitör kök hücreler. Bu hücre sayısı son derece zordur, en az 2 x 10 5 hücre Bu mutagenez deneyde, tutarlı ve güvenilir sonuçlar için gerekli olduğu bulunmuştur, çünkü hücreler, - Çalışmamızda LSK (Flk-2 + ve Flk-2) HSC zenginleştirilmiş kullanımıCD150 + CD48 nüfus hatta LSK/Flk2 - -, nüfus (fareler, maliyet ve pratiklik açısından) bir LSK/Flk2 sıralar zaman elde edilmiştir. Başlangıçta Kohler ve ark. 18 tarafından geliştirilen birine dayalı bu protokol, spontan DNA mutant frekans farklılaşmış miyeloid hücrelerin popülasyonları gibi ayrışmamış kemik iliği ve dalak hücreleri LSK&#39;ya hücrelerinde tespit ve tanımlanabilir nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

Son yıllarda, çok sıkı bir şekilde genomik instabilite gelişimsel bozukluklar, kanser, ve yaşlanma ile ilişkili olduğu ortaya çıkmıştır. Kök hücreler yaşam boyu doku homeostazını ve onarım sağlamak için sorumlu olduğu göz önüne alındığında, bu kök hücre popülasyonu dokuların genomik bütünlüğünü korumak için önemli olduğunu varsaymak mantıklıdır. Bu nedenle, önemli faiz kök hücre bazlı hastalıkların etyolojisi anlamak amacıyla, genomik kök hücre dürüstlük ve onların soyu üzerinde endojen ve çevresel faktörlerin etkisinin değerlendirilmesinde ortaya çıkmıştır. LacI transgenik fareler, LacI gen mutasyon muhabir olarak hizmet ettiği LacI raportör sistemi kodlayan bir geri kazanılabilir λ faj vektörü taşır. Mutasyona uğramış bir LacI geninin sonucu bu böler mavi çevirerek, bir kromojenik alt tabaka, β-galaktosidaz üretimidir. LacI raportör sistemi gerçekleştirilir istem / progenitor hücreler de dahil olmak üzere ve kolay bir şekilde geri kazanılmış ve daha sonra E. enfekte etmek için kullanılabilir n tüm hücreler, coli. E. inkübe edildikten sonra, enfekte doğru alt tabakayı içeren agaroz coli, plaklar atılır olabilir; açık plaklar vahşi tip liman iken mavi plaklar, bir mutant LacI genini göstermektedir. Plakların (net arasında) mavisi sıklığı DNA elde edildi, orijinal hücre popülasyonunda mutant frekansı gösterir. Mutant LacI genini diziliş gendeki mutasyonlar konumunu ve mutasyon tipini gösterir. LacI transgenik fare modeli, bir in vivo mutajenezi deneyi gibi iyi bilinmektedir. Ayrıca, tahlil için fareler ve ayıraçlar piyasada mevcuttur. Burada bu model kendiliğinden kök hücre zenginleştirilmiş Lin DNA meydana gelen mutasyona uğramış frekansını ölçmek için adapte edilebilir ayrıntılı olarak açıklanmıştır - IL7R - Sca-1 + + + cKit (LSK) hücreleri ve hematopoietik sistemin diğer altgrupları.

<html> In vivo mutajenez tahlil nadir bir olay birçok olaylar arasında (mutant pfus) (Tüm pfus) ölçer. Küçük hücre sayısı ile tahlil gerçekleştirerek, bu sonuç oldukça olumlu-yanlış ve yanlış-negatif sonuçları etkilenir mümkündür. Bu sorunu çözmek için üç farklı hayvanlar hasat fraksiyonlanmamış kemik iliği hücreleri, bir seri seyreltme deney gerçekleştirdi. Biz, 1.4 x 10 6, 7.0 x 10 5 kullanarak bu hayvanların kemik iliğinde 3.5 x 10 5 mutan...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells at JoVE.com

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

identifying-dna-mutations-purified-hematopoietic-stemprogenitor

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Population Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K Görüntüleme.  UT Health Science Center at San Antonio.  Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir. 