我々は、この原稿でグラフィックデザインや写真撮影のためにデヴィッド·R·ロドリゲス、マサチューセッツ州に感謝したいと思います。この作品は、UTHSCSAフローサイトメトリー中核施設とUTHSCSAアドバンスト核酸基盤施設にGCCRI、NIH / NIA（5R21AG033339）とがんセンターサポート助成金（P30CA054174）からの資金によってサポートされていました。

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

本明細書に記載のin vivo変異導入アッセイはもともとKohler らによって生成されたLacIトランスジェニックマウスモデルに基づいている。18このモデルは、lacIリレポーター遺伝子を有するλファージベクターを利用する。ベクトルは、感染性ファージ粒子に比較的単純な回復とその後のパッケージングを可能に隣接する2つのCOSサイトは、Eを?...

ほとんどの組織では、分化した細胞は、限られた寿命を持っている。機能的完全性を維持するために、長寿命の、組織特異的幹細胞は、連続的に順番に、その特定の組織の機能に必要な完全に分化した細胞を生じる前駆細胞を産生する。幹細胞は、自己複製と呼ばれるプロセスを通じて、自分の区画を補充する。このように、幹細胞は、彼らがそのためインチ常駐組織の機能的完全性を維持する責任があり、それは彼らが損傷を受けたDNAを検出し、潜在的に修復するために、堅牢なメカニズムが装備されていることが不可欠です。そうでなければ、彼らは彼らの子孫によって継承できる複数のゲノム（潜在的に有害な）摂動を、取得することができる。幹細胞は、生物の寿命の間に彼らのゲノムをセーフガードする方法を理解することは重要な問題であり、ゲノムの不安定性は、癌および（1,2に概説されている）他のいくつかの加齢に伴う疾患にリンクされている理由を私たちが理解するのに役立つことがあります。 3-6の直接DNA修復の特定のタイプを測定することが可能であることを実証した。なお、後者は低い忠実度および製造従ってリスク増加の修復プロセスであり、造血系において、例えば、二本鎖DNAの切断が相同組換え（HR）又は非相同末端結合（NHEJ）によって修復することができることが見出されたエラーが。両方が、造血幹細胞（HSC）4,5に利用されているが、マウスにおいて、早期前駆細胞がHR 4を利用し 、一方、それは造血幹細胞で主にNHEJであると思われる。同様の観察は、皮膚6中の幹細胞のために作られました。興味深いことに、ヒトHSC人事ではないNHEJにおいて、二本鎖切断3のための選択の修復機構であると思われる。 2種間のこの機能的な違いは本物であるか、単に技術的または実験の差を表しているかどうかは、見守らなければならない。 損傷を受けたDNAを修復する幹細胞のレパートリーは、例えば、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）およびミスマッチ修復（MMR）のような他のDNA修復機構を含む可能性がある。 MMR修正塩基塩基ミスマッチ、挿入/欠失ループながらBERとNERは、一本鎖DNAに、単一または複数の塩基対の病変を修復するための責任であり、DNA損傷のこれらのタイプは、NHEJまたはHRによって修復することができない。この概念をサポートすることは、HSCコンパートメント7-9に、これらの経路の1の変化と異常の間のリンクを示す造血系だけでなく、骨髄異形成症候群10月16日の発症リスクの増加に起因する疾患からのいくつかの研究であるHSCは、その疾患が進行するにつれて17ゲノム不安定性を増大と関連している。まだ今のように、造血幹細胞を直接、BER、NER、およびMMRの測定が報告されていない。 機構的レベルでの組織の完全性を制御する様々なプロセスを解明することに加えて、これらのプロセスのいずれかの収差の影響が遺伝子対正常に、例えば 、試験することができるように、突然変異したDNAの程度を測定することができることが不可欠である幹細胞を操作または若いに対する古い中。しかし、関連アッセイの開発が原因組織特異的幹細胞の不足および「幹細胞性」を維持し、培養条件の欠如のために困難である。さらに、そのようなアッセイは、環境や遺伝子操作に修正可能である必要があります。これらの制限および要件に可能な解決策は、具体的にはDNAの突然変異を検出するために設計されているマウスモデルの使用である。 MUL変異検出のためのTIPLEトランスジェニックマウスモデルが開発されている。例えば、トランスジェニックマウスのLacI 18 のLacI遺伝子はLacオペレーターのサプレッサーをコードする変異レポーターとして機能するLacIリレポーター系をコードする回復可能なλファージベクターを運ぶ。 LacIリ遺伝子の変異の際に、Lacオペレーターが活性化され、β-ガラクトシダーゼが生成される。それが青色に変わっβ-ガラクトシダーゼの発色性基質を切断するのX-gal（5 - ブロモ-4 - クロロ - 電子 - インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）。 のLacIベクトルに隣接するCOSサイトはラムダファージタンパク質およびEのその後の感染により容易に回収することができ大腸菌 。感染したEをインキュベートした後大腸菌は、X-gal基質を含有するアガロースに、プラークをスコア付けすることができる。明確なプラークは非変異体を保有しながら、青斑は、推定される変異型ラック-I有するファージを含んでいる。目の中で青いプラークの周波数（電子明確なもの）は、DNAから抽出された元の細胞集団における突然変異頻度を示す。また、LacIリターゲットをホストするλファージは、容易に、比較的高いスループット分析のためのPCR技術を用いて配列決定することができる。複数の変異型のLacI遺伝子の配列を決定することは今度は特定のDNA修復経路で可能な欠陥または特定の遺伝毒性事象を指すことがあり、突然変異スペクトルに関する重要な情報を明らかにします。 のLacIトランスジェニックシステムは、複数の研究室19全体で標準化されており、試薬は、市販されている。 LacIリシステムの一つの主要な欠点は、大規模な欠失または再配列を検出する能力が限られているので、分裂中期スプレッド上の他の方法、 例えば 、多色FISHは、この欠陥を補完するために使用される必要がある。 LacIリマウスモデルのλファージベクターの中では、はるかに小さい遺伝子、CIIがあります、変異解析のために利用できる。そのサイズおよび変異体を選択することができるという事実は、このlacI遺伝子解析未満の労働集約的かつ安価なアッセイを20にする。しかしながら、lacI遺伝子は、より広範囲に突然変異誘発21に研究されており、発色基質22-25に関する表現型応答を生成するアミノ酸残基の明確な理解が存在するように突然変異遺伝子の感度はよく特徴付けられている。 変異検出のための他のマウスモデルがΦX174またはLacZを導入遺伝子の使用を含む。 T→G：オリジナルAとΦX174トランスジェニックマウスモデル、C復帰突然変異試験26又は塩基対置換のスペクトルの検出を可能に前進突然変異試験27は 、LacIリモデルより安価なシステムを表す。しかし、フォワードアッセイにおける突然変異画面は些細な突然変異の仕様ではありませんΦX174導入遺伝子のスペクトラムは、次のようにのLacIのものと十分に特徴づけされていません。 LacZを導入遺伝子を有するマウスモデルでは、LacZの突然変異レポーターを大腸菌を用いた回収され、ガラクトースおよびガラクトース28を含有する培地に対して感受性である大腸菌宿主細胞。このシステムの欠点は、LacZの対象の回復はまた、E.のライゲーションおよびエレクトロポレーションに続いて、制限エンドヌクレアーゼ消化を含むことであることが困難少数の細胞のためのシステムを適合すること大腸菌ホスト。多数の細胞が必要な場合には（ 例えば百万個以上）、（1、常により多くのマウスで始めることができます）幹細胞/前駆細胞集団を操作するための絶対条件ではありませんが、それはすぐに非現実的で費用対法外になります。また、LacZの比較的大きなサイズの、感受性突然変異レポーターを提供しつつ、DNA配列分析およびdetermために面倒でコストがかかる突然変異スペクトルの追うもの。このモデルの主な利点は、しかしながら、その大きな欠失および挿入を検出する能力、ならびに染色体再編成である。 LacIリ、ΦX174およびLacZトランスジェニックマウスモデル内のすべてのセルがレポーター系を運ぶので、これらのマウスモデルのいずれかは、それらが確実に採取することができるように、幹細胞および前駆細胞を含む、関心対象の任意の細胞型において突然変異誘発を測定するために使用することができる十分な数の。我々はのLacIマウスモデルとのLacI突然変異試験で豊富な経験を持っていたので、我々は造血幹細胞および前駆細胞集団内変異導入解析のための更なるこのシステムを追求することにしました。 造血組織は、リンの極めてまれな集団として同定可能であり、長期再増殖幹細胞を含むその個々の成分の細胞表面表現型の点でよく特徴付けられている- IL7R <suP&gt; - SCA-1 +するcKit + +（LSK）/ Flk2は- CD150 + CD48 -細胞29。 それは、DNA修復を研究になると、細胞はまだHSCのために良いの代表であり、最も原始的な骨髄球前駆細胞（CMP）の人口とは大きく異なる- Mohrin ら 4は LSK/Flk2のわずかに大きい人口があることを明らかにした。また、ときHSCに富むLSK（FLK-2 +およびFLK-2 - ） - IL7R -細胞が林と比較したSCA-1-するcKit + +（LS-K前駆細胞）は、有意差が残っていた純度の低い間NHEJ能力5、細胞に富むLSKの人口および前駆細胞を幹。この細胞数は極めて困難であり、我々は、少なくとも2×10 5個の細胞をこの変異誘発アッセイにおいて、一貫した信頼性のある結果を得るために必要であることを見つけたので、細胞-我々の研究ではHSCに富むLSK（のFlk-2 +およびFlk-2）を使用CD150 + CD48集団またはさえLSK/Flk2 - - （マウス、コストと実用性の点で）人口1はLSK/Flk2をソートする際に取得する。もともとはKohler らによって開発された一方に基づいて、このプロトコルは、 図18は、自発的なDNA突然変異頻度はLSK細胞および分化した骨髄細胞ならびに未分離の骨髄および脾臓細胞の規定された集団において決定することができる方法を詳細に記載している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

近年では、ゲノム不安定性がしっかり多くの発達障害、癌、および加齢に関連していることが明らかになった。幹細胞は生涯を通じて組織の恒常性および修復を確実にする責任があることを考えれば、幹細胞集団は、組織のゲノムの完全性を維持するために重要であると仮定することは妥当である。そのため、重要な関心は、幹細胞ベースの疾患の病因を理解することを目指し、幹細胞およびその子孫ゲノムの完全性に関する内因性および環境要因の影響を評価する際に生じている。 LacIリトランスジェニックマウスは、LacIリ遺伝子が変異レポーターとして機能するLacIリレポーター系をコードする回復可能なλファージベクターを運ぶ。変異したlacI遺伝子の結果は青に回し、切断する発色基質のβ-ガラクトシダーゼの製造である。 LacIリレポーター系は、iを搭載してnの全ての幹/前駆細胞を含む細胞、および容易に回収し、続いてE.を感染させるために使用することができる大腸菌 。感染したEをインキュベートした後正しい基質を含むアガロース上で大腸菌は 、プラークをスコアすることができ、明確なプラークが野生型を保有しながら、青いプラークは、変異型lacI遺伝子を示している。プラーク（クリア間の）青色の周波数は、DNAがより抽出された元の細胞集団における突然変異頻度を示す。変異型lacI遺伝子の配列を決定することは遺伝子の変異の位置および変異の種類が表示されます。 LacIリトランスジェニックマウスモデルは、in vivo変異導入アッセイとして十分に確立されている。また、アッセイのためのマウスおよび試薬は、市販されている。ここでは、このモデルを自発的に幹細胞富化林におけるDNA突然変異体を天然の周波数を測定するように構成することができる方法を詳細に説明する- IL7R -のSca-1 +するcKit + +（LSK）細胞および造血系の他の部分集団。

<html> in vivoでの変異誘発アッセイは、多くのイベント（すべてのPFU）の中で稀な事象（変異のPFU）を測定する。少数の細胞でアッセイを行うことにより、結果が大幅に正偽及び偽陰性の結果に影響されることが可能である。この問題に対処するために、我々は、3つの異なる動物から採取未分画骨髄細胞との連続希釈実験を行った。我々は、1.4×10 6、7.0×10 5を使用して、これら?...

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精製された造血幹/前駆細胞における DNA 変異の同定 |免疫学と感染症 |ビデオ

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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12.9K ビュー.  UT Health Science Center at San Antonio. ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。 

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

高純度の取得トキソプラズマ</em不連続塩化セシウム勾配別>オーシスト

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

免疫・感染学

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...