우리는이 원고에서 그래픽 디자인 및 사진 데이비드 R. 리 게스, MA에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 UTHSCSA 유동 세포 계측법 핵심 시설 UTHSCSA 고급 핵산 핵심 시설에 GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA054174)에서 자금에 의해 지원되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

본 명세서에 기재된 생체 내 돌연변이 유발 분석은 원래 콜러 등. 18이 모델의 lacI 리포터 유전자를 운반하는 λ 파지 벡터를 이용하여 생성 LACI 트랜스 제닉 마우스 모델에 기초한다. 벡터 전염성 파지 입자로 상대적으로 단순 복구 이후의 포장을 허용 측면에서는 두 COS 사이트, E.를 감염하는 데 사용 대장균. 블루 플라크는 파지에 감염된 E.에</em...

대부분의 조직에서 분화 된 세포는 제한된 수명이 있습니다. 기능적 무결성을 유지하기 위해, 수명이 긴, 조직 특이 적 줄기 세포는 지속적으로 차례로 특정 조직의 기능에 필요한 완전히 분화 된 세포에 야기 전구 세포를 생성한다. 줄기 세포는자가 재생 (self-renewal)이라는 과정을 통해 자신의 구획을 보충. 따라서, 줄기 세포들은 따라서 안으로있는 조직의 기능 무결성을 유지할 책임이 있으며, 그것은 그들이이 손상된 DNA를 감지하고 잠재적으로 복구하는 강력한 메커니즘을 갖추고 있습니다 것이 필수적입니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 그들의 자손에 의해 상속 할 수있는 여러 게놈 (유해) 섭동을 획득 할 수있다. 줄기 세포는 유기체의 수명 동안 자신의 게놈을 안전 보호하는 방법을 이해하는 것은 중요한 문제이며, 게놈 불안정성은 암 (1,2 검토) 다른 연령과 관련된 질병에 링크 된 이유를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 3-6에서 직접 DNA 수리 및 특정 유형을 측정하는 것이 가능하다는 것을 증명하고있다. 그것은 예를 들어, 조혈 시스템, 이중 가닥의 DNA 나누기 (NHEJ), 후자는 낮은 충실도의 복구 프로세스 인 및 제조, 따라서 위험 증가에 합류 상동 재조합 (HR) 또는 비 동종 말까지 복구 할 수 있다는 것을 발견 오류. 모두가 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 4,5에 활용되고있다, 그러나, 마우스에 초기 조상 세포가 HR 4를 사용하는 반면이 조혈 모세포에서 주로 NHEJ 것 같다. 비슷한 관측 피부 6 줄기 세포를 위해 만들어졌습니다. 흥미롭게도, 인간의 조혈 모세포 HR에서,하지 NHEJ,이중 가닥 나누기 3에 대한 선택의 복구 메커니즘이 될 것으로 보인다. 두 종 사이의 기능적 차이가 실제 또는 단순히 기술이나 실험적인 차이를 나타내는 지 여부는두고 볼 일이다. 손상된 DNA를 복구하는 줄기 세포의 레퍼토리는 기본 절단 수리 (BER), 뉴클레오티드 절단 수리 (NER)과 불일치 수리 (MMR) 등의 DNA 복구 메커니즘을 포함 할 가능성이있다. DNA 손상 이러한 유형의 NHEJ 또는 HR 복구 할 수 없습니다 MMR 수정 기본베이스 불일치 및 삽입 / 삭제 루프 동안 BER과 NER는 단일 가닥 DNA에서 하나 또는 여러 개의 기본 쌍의 병변을 수리 할 책임이 있습니다. 이 개념을 지원하는 것은 HSC 구획 7-9에서 이러한 경로와 이상 중 하나에 변화 사이의 링크를 보여주는 조혈 시스템뿐만 아니라, 골수이 형성 증후군 10-16,에 발생한 질병을 개발의 증가 위험에서 여러 연구하다HSC는 그 질병이 진행됨에 따라 (17)을 게놈 불안정성을 증가와 연관된다. 아직 바와 같이, 직접 조혈 모세포의 BER, NER 및 MMR의 측정은보고되지 않았다. 기계론 수준에서 티슈 무결성을 제어하는 다양한 프로세스를 해명 외에도, 이러한 프로세스 중 하나의 수차의 영향은 유 전적으로 대 정상에서 예를 들면, 테스트 될 수 있도록, 돌연변이 DNA의 정도를 측정 할 수있는 것이 필수적이다 설계 줄기 세포 또는 젊은 대 이전에. 그러나, 중요한 분석의 발전 때문에 조직 특이 적 줄기 세포의 소수와 &quot;stemness&quot;를 유지 배양 조건의 부족으로 인해 곤란하다. 또한, 이러한 분석은 환경 및 유전 적 조작을 수정할 수있는 있어야한다. 이러한 제한 사항 및 요구 사항에 대한 해결 방안이 구체적으로 DNA의 돌연변이를 검출 할 수 있도록 설계되어 마우스 모델을 사용하는 것입니다. MUL돌연변이 검출을위한 tiple 형질 전환 마우스 모델이 개발되었다. 예를 들어, LACI 형질 전환 마우스 (18)는 LACI 유전자가 락 연산자의 억제를 인코딩하고 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. LACI 유전자의 돌연변이에, 락 운영자가 활성화되고, β-갈 락토시다 아제가 생성됩니다. β-갈 락토시다 클리브이 파란색으로 변 발색 기질의 X-GAL (5 - 브로 모 -4 - 클로로 - e-인돌 릴-β-D-갈 락토 피 라노 사이드). LACI 벡터 측면의 COS 사이트는 람다 파지의 단백질과 E. 이후의 감염에 의해 쉽게 복구 할 수 있습니다 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 대장균은 X-GAL 기판을 포함 아가 로스에 패 득점 할 수있다. 분명 플라크가 아닌 돌연변이를 정박하는 동안 블루 플라크, 락-I는 파지를 들고 추정 돌연변이가 포함되어 있습니다. 일 사이에 블루 플라크의 주파수 (전자 명확한 것)는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 더욱이 LACI 타겟을 호스팅 λ 파지가 용이 비교적 높은 처리량 분석 PCR 기법을 사용하여 시퀀싱 될 수있다. 여러 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 차례로 특정 DNA 수리 경로에서 가능한 결함 또는 특정 유전 독성 이벤트를 가리킬 수 변이 스펙트럼에 대한 중요한 정보를 공개합니다. LACI 형질 전환 시스템은 여러 실험실 19 일에 걸쳐 표준화되어 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다. LACI 시스템의 하나의 주요 단점은 대형 삭제 또는 재 배열을 감지하는 능력이 제한적이며, 따라서 중기 확산에 다른 방법, 예를 들어, 멀티 컬러 FISH이 부족을 보완하기 위해 사용되어야합니다. LACI 마우스 모델의 λ 파지 벡터 내에 훨씬 작은 유전자 CII있어돌연변이 분석에 사용할 수 있습니다. 크기와 돌연변이가 선택 될 수 있다는 사실이 LACI 유전자 분석보다 덜 노동 집약적 저렴 세이 20 만든다. 발색 기질 22-25에 대한 표현형 반응을 발생 아미노산 잔기의 명확한 이해가되도록 그러나의 lacI 유전자가 더욱 광범위 돌연변이 (21)와 돌연변이 유전자의 감성 연구되고 잘 특징으로하고있다. 돌연변이 검출을위한 기타 마우스 모델 ΦX174 또는 LacZ를 트랜스 진의 사용을 포함한다. T → G : 원본과 ΦX174 형질 전환 마우스 모델, C의 복귀 돌연변이 시험 26 또는 염기쌍 치환의 스펙트럼의 검출, LACI 모델보다 적은 비용으로 시스템을 나타냅니다 수있는 앞으로 돌연변이 시험 27. 그러나, 앞으로 분석에서 돌연변이 화면이 사소한 돌연변이 사양이 아닙니다ΦX174 전이 유전자의 TRUM은 같은 LACI의 같은 특성이 잘되지 않습니다. LacZ를의 형질 전환 유전자를 운반 마우스 모델에서 LacZ를 돌연변이 기자는 E.을 이용하여 복구 갈락토스와 갈락토스 (28)를 포함하는 매체에 민감한 대장균 숙주 세포. 이 시스템의 단점은 LacZ를 타겟의 회복 또한 E. 결찰 및 일렉트로이어서 제한 효소 분해를 수반한다는 것이다 대장균함으로써 어려운 세포의 수가 적은 시스템에 적응하고, 호스팅합니다. 이 줄기 / 전구 세포 집단 작업을위한 절대적인 요건 (하나는 항상 더 많은 쥐를 시작할 수)은 아니지만 세포의 큰 숫자 (예를 들어 수백만 이상) 필요한 경우, 신속하게 허무하고 엄청난 비용이 될 것입니다. 민감한 돌연변이 리포터를 제공하면서 또한, LacZ를 중에서 비교적 큰 크기, 복잡하고 DNA 서열 분석 및 determ 더 비싸다돌연변이 스펙트럼의 ination. 이 모델의 주요 이점은 있지만, 그것의 큰 삽입 및 결실을 검출 할 수있는 능력뿐만 아니라, 염색체 재 배열이다. LACI, ΦX174 및 LacZ를 트랜스 제닉 마우스 모델에서 모든 셀은 리포터 시스템을 운반하기 때문에, 이러한 마우스 모델 중 어느 한 그들은 확실하게 수납 할 수 있기 때문에, 줄기 및 전구 세포를 포함하여, 그 어떠한 세포 유형에 돌연변이를 측정하기 위해 사용될 수있다 충분한 숫자. 우리가 LACI 마우스 모델과 LACI 돌연변이 분석과 광범위한 경험을 가지고 있기 때문에, 우리는 조혈 줄기 및 전구 인구에서 돌연변이 분석에 대한이 시스템을 추구하기로 결정했다. 조혈 조직은 린의 극히 드문 인구로 식별 장기를 다시 채우기 줄기 세포를 포함하여 개별 구성 요소의 세포 표면 표현형의 측면에서 잘 특징 - IL7R <suP&gt; - 무서-1 + CKIT + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - 세포 29. . 그것은 DNA의 수리를 공부에 관해서 세포가 여전히 조혈 모세포에 좋은 대표하고 가장 원시적 인 헌신 골수 전구 (CMP) 집단에서 유의 한 차이 - Mohrin 등 4 LSK/Flk2의 약간 큰 인구는 것을 보여 주었다. 또한, 경우 HSC - 농후 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2 -) - IL7R - 셀 린 비교 하였다 무서 -1 - CKIT + + (LS-K 전구 세포)에있는 상당한 차이가 여전히 있었다 덜 순수한 사이 NHEJ 능력 5, 세포 농축 LSK 인구 및 전구 세포를 줄기. 이 셀의 수는 매우 어렵습니다, 우리는 적어도 2 × 10 5 세포가이 돌연변이 분석에 일관 신뢰할 수있는 결과에 필요한 것을 발견하기 때문에 세포 - 우리의 연구에서 우리는 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2) HSC 강화 사용CD150 + CD48 인구 또는 LSK/Flk2 - - 인구 (마우스, 비용과 실용성 측면에서) 하나가 LSK/Flk2을 정렬 할 때 얻었다. 원래 콜러 등. (18)에 의해 개발 된 하나에 기초하여이 프로토콜은, 자발적인 DNA 돌연변이 빈도가 차별화 골수 세포의 집단뿐만 아니라 분리되지 않은 골수 및 비장 세포 LSK 세포 판단되고 정의 될 수있는 방법을 상세하게 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LacI transgenic mice&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioReliance Corporation</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">720202</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli</td>
			<td style="width:245px;">Agilent Technologies (Stratagene)</td>
			<td style="width:195px;">200221</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA size standards &#8211; lambda ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-3635</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.025 mM pore size membranes&#160;</td>
			<td>Fisher (Millipore)</td>
			<td>VSWP 025 00</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">245 mm2 bioassay dishes (trays)&#160;</td>
			<td>Fisher (Corning)</td>
			<td>07-200-600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NZY broth (powder)</td>
			<td>Fisher (Teknova)</td>
			<td>N1144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E-3120-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N, N-dimethylformamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC34843-5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal</td>
			<td>Research Products Intl Corp (RPI)</td>
			<td>B71800-10.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3-115-852</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Extender Taq Polimerase kit</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2200500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agencourt AMPure XP cleanup kit</td>
			<td>Beckman/coulter</td>
			<td>A63880</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying dna mutations in purified hematopoietic stem/progenitor cells

최근, 그것은 게놈 불안정성 단단히 많은 발달 장애, 암, 노화 관련되어 있다는 것이 명백되고있다. 줄기 세포가 생활 전반에 걸쳐 조직의 항상성 및 수리를 보장하는 책임이 있음을 감안할 때, 그것은 줄기 세포 인구는 조직의 게놈 무결성을 보존하는 중요한 가설하는 것이 합리적이다. 따라서, 상당한 관심이 줄기 세포 기초 질환의 병인을 이해하는 것을 목표로, 게놈 줄기 세포의 무결성 및 그들의 자손에서 내인성 및 환경 적 요인의 영향을 평가 생겨났다. LACI 형질 전환 마우스는 LACI 유전자가 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. 돌연변이 LACI 유전자의 결과는 클리브 파란색으로 돌려 발색 기질을, β-갈 락토시다 아제의 생산이다. LACI 기자 시스템은 수행의 i줄기 / 전구 세포를 포함하고 쉽게 복구이어서 E. 감염하는 데 사용할 수있는 모든 셀에 N, 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 정확한 기판을 포함 아가로 오스에 대장균, 패 득점 수 있으며, 맑은 플라크가 야생형 항구 파란색으로 플라크는 돌연변이 LACI 유전자를 나타냅니다. 플라크 (클리어 중) 블루의 주파수는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 유전자의 돌연변이의 위치와 돌연변이의 종류를 표시합니다. LACI 유전자 변형 마우스 모델에서 생체 내 돌연변이 분석으로 잘 확립되어있다. 또한, 분석을위한 마우스 및 시약은 시판되고있다. 여기에서 우리는이 모델이 자발적으로 줄기 세포가 풍부한 린의 DNA 돌연변이 발생 빈도를 측정하기 위해 적용 할 수있는 방법을 자세히 설명 - IL7R - 무서-1 + CKIT + + (LSK) 세포 및 조혈 시스템의 다른 부분 모집단.

<html> 생체 내 돌연변이 분석은 드문 경우 많은 이벤트들 (돌연변이 PFUs) (모든 PFUs)를 측정한다. 세포의 소수로 분석을 수행하여, 그 결과가 상당히 긍정적 거짓 및 위음성 결과에 좌우되는 것이 가능하다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 3 가지 동물로부터 수확 된 분획 골수 세포와 일련의 희석 실험을 수행 하였다. 우리는, 1.4 × 106, 7.0 × 105을 사용하여 이들 동물의 골수에?...

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Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells | Immunology and Infection | Video

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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12.9K 조회수.  UT Health Science Center at San Antonio.  여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다. 

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Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...