يوضح البروتوكول طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل وزراعة الخلايا البطانية عالية النقاء من الفئران التي يمكن أن يكون لها تطبيقات متعددة. هذه التقنية هي طريقة أكثر وضوحا تحافظ على إنتاجية ونقاء الخلايا البطانية. ستوضح الإجراء نينا نجوين ، باحثة مشاركة في مختبري.
للبدء ، دوامة الخرز المغناطيسي لبضع ثوان. ماصة 50 ميكرولتر من الخرز في أنبوبي طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر ل CD31 و CD102. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسل الخرزة واخلطه جيدا.
ضع الأنابيب على فاصل مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة باستور زجاجية. أعد تعليق الخرز في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الخرز. ثم أضف خمسة ميكرولترات أو 2.5 ميكروجرام من الجسم المضاد CD31 أو CD102 لكل 50 ميكرولترا من الخرز.
احتضان معلق حبة مع دوران لطيف على طرف على طرف الدوار طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. اغسل الحبيبات المناعية أربع مرات ثم أعد تعليق الحبيبات المناعية في 50 ميكرولترا من محلول غسيل الخرز. في يوم العزلة ، أضف 25 ملليلتر من HBSS إلى 25 ملليغرام من كولاجيناز النوع الأول واحتضانه بتناوب لطيف.
ثم قم بالتصفية باستخدام مرشح 22 ميكرومتر. بعد القتل الرحيم لجرو فأر يبلغ من العمر خمسة إلى سبعة أيام ، قم برش الذبيحة بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بقطع الحجاب الحاجز بشكل متفوق لأعلى على طول الجدران الجانبية للصدر بالكامل لكشف التجويف الصدري.
حقن خمسة ملليلتر من DMEM البارد في البطين الأيمن للقلب حتى تتحول الرئتان إلى اللون الأبيض. ثم قطع الفصوص البعيدة إلى الشعب الهوائية المقابلة واحدة تلو الأخرى لإزالة الرئتين. اسحب فصوص الرئة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر مملوء مسبقا ب 20 ملليلتر من الوسط القاعدي البارد الثلجي.
حرك الأنبوب برفق باليد لمدة 10 إلى 15 ثانية لغسل أي خلايا دم حمراء زائدة. إزالة الرئتين من وسائل الإعلام مع مصفاة الخلية واللحم المفروم مع مقص معقمة. انقل المنديل المفروم إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلتر مع 25 ملليلتر من محلول كولاجيناز المسخن مسبقا.
حرك برفق على خلاط دوار. قم بتوصيل حقنة سعة 20 ملليلتر بقنية حادة قياس 15 وسحن المعلق بقوة دون رغوة من 10 إلى 15 مرة في تعليق خلوي. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
ثم شطف الأنبوب المخروطي المستخدم في الهضم ومصفاة الخلية مع 15 ملليلتر من الوسط القاعدي. أجهزة الطرد المركزي التعليق الخلوي عند 400 مرة G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من الوسط الكامل.
أضف ثمانية ملليلتر من الوسط الكامل واحتضانه. في اليوم التالي ، اغسل القوارير مرتين مع 10 ملليلتر من HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وأضف 10 ملليلتر من الوسط الكامل. بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 90 إلى 95٪ ، فإنها تكون جاهزة للعزل المناعي الأولي.
اغسل الخلايا البطانية الملتصقة مرتين مع 10 ملليلتر من HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. أضف ملليلتر من محلول انفصال الخلايا الخالي من التربسين واحتضانه لضمان رفع جميع الخلايا من القارورة. أضف ثمانية ملليلتر من الوسط القاعدي.
بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 400 مرة G لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة وأعد تعليقها في ملليلتر من الوسط القاعدي. حبات دوامة مضادة ل CD31 المغلفة لبضع ثوان لإعادة تعليق الخرز. أضف 30 ميكرولترا من الخرز لكل ملليلتر من تعليق الخلية وقم بتأمين الغطاء.
احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على طرف على طرف دوار. ثم ضع الأنابيب على فاصل مغناطيسي لمدة دقيقتين. نضح الطافد وإزالة الأنبوب من المغناطيس.
أعد تعليق حبيبات خلية الخرزة عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من الوسط القاعدي إلى الأنبوب وسحب السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. استبدل الأنبوب الموجود على الفاصل المغناطيسي لمدة دقيقتين. ثم نضح بعناية طاف باستخدام ماصة باستور الزجاج.
بعد الغسيل النهائي ، عندما يصبح العنصر المتطافي واضحا ، أعد تعليق حبيبات خلية الخرزة في ثلاثة ملليلتر من وسط النمو الكامل وانقلها إلى قارورة T75. أضف سبعة ملليلتر من وسط النمو الكامل واحتضانه. في اليوم التالي ، أعد غسل الخلايا باستخدام HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
ثم أضف 10 ملليلتر من الوسط الكامل. بمجرد أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 90 إلى 95٪ ، فإنها تكون جاهزة للعزل المناعي الثانوي. يحدد أول اختيار مناعي الخلايا الإيجابية CD31 ، والتي تنمو في تكوين حصوي.
يزيد اختيار مناعي ثان مع خرز مطلي بمضاد CD102 من نقاء الخلايا البطانية ويتم استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة للتأكد من أن عدد الخلايا إيجابي CD31 و CD102 إيجابي. لدراسة المسارات الالتهابية البطانية ووظيفة الحاجز البطاني ، تم استخدام العلاج باستخدام الفئران Cytomix للحث على إنتاج IL-6 كبير بواسطة الخلايا البطانية بقيمة P أقل من 0.01. علاوة على ذلك ، انخفضت المقاومة عبر البطانية مما يدل على زيادة نفاذية البطانة.
يمكن استخدام الخلايا البطانية المعزولة في تحفيز الخلايا البطانية أو فحوصات وظيفة الحاجز لاكتشاف الأهداف العلاجية القائمة على البطانة لاضطرابات الخلل البطاني.
