우리는 우수한 기술 지원을 안드레아 Kremsreiter에게 감사의 말씀을 전합니다. 매디슨 - 우리 실험실에서 작업 NIH GM096088와 위스콘신 대학의 빌라스들에게 지원됩니다.

1. 효모 Luminometry 방법 사카로 마이 세스 세레 비시 애의 변형 BYYT를 사용합니다. 그것은 BY4741 (마타, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4)의 yvc1-tok1 파생입니다. Batiza 등. 26 Loukin 등. (24)에 설명 된대로, 레 선택할 수 애큐 오린 발현하는 플라스미드 pEVP1/Aeq와 우라 선택 쥐 TRPV4 발현하는 플라스미드 p416GPDV4으로 세포를 변형 플라스미드 건설 및 변환 (27)의 사용 표준 방법 . 효모 균주와 플라스미드의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. <ol><li> 하룻밤 1M 소르비톨 보충 레 우라 - &quot;DCD&quot;드롭 아웃 매체 (28) (CMD-레 우라 매체 (29)의 황산 고갈 변형)에서 30 ° C의 셰이커 후 로그 상에 효모 세포의 배양 2 ㎖ . luciferi 2 μM 보충 새로운 배지 1.8 ㎖에 이러한 문화의 200 μl를 접종N의 엘렌 테라. 진탕해야만 실온에서 24 시간 동안 어두운 곳에서 재배한다. </li><li> 문화의 삼투압 (아래) (일반적으로 1,400 mOsM) 및 다른 솔루션 증기 압력 osmometer를 사용하여 측정한다. </li><li> 나누어지는 20 단 하나 관 루미의 12mm 루미 튜브에 신선한 문화의 μL. </li><li> 근력 저하 충격 원하는 충격의 정도에 따라 25 mM의 NaEGTA (산도 7.2) 또는 이름 (산도 7.2)과 500-100 밀리미터의 NaCl (1,200-400 mOsM 총 삼투압)를 포함, 용액 200 μl를 추가합니다. 연속적 전에 발광을 모니터하고, 적어도 120 초 삼투 downshock 후에 만​​ 간단한 희석 조작에 의해 중단. 상대 발광 장치 (RUL)와 같은 데스크톱 컴퓨터에 루미 출력을 등록합니다. </li></ol> 하지 형질 전환 TRPV4의 연구이지만, 우리는 효모 균주의 많은 수의 응답을 검사하는 자동화 된 시스템에서 위의 프로토콜의 변형을 사용했다. 연구 오F 저자 30 마이크로 루미를 사용하여 효모 deletome (4,906 효모 단일 유전자 deletants의 컬렉션)의 삼투압 31 자극과 해당 소프트웨어를 분석 반응은 성공적이었다. 2. 3. 난자 전기 생리학 방법 전기 생리학은 기본적인 방법 32을 사용합니다. PCR은 야생형 또는 돌연변이 TRPV4 하이파이 PfuUtra 중합 효소를 사용하여 pGH19 33에 통합의 오픈 리딩 프레임을 증폭. 이것은는 Xenopus β-글로빈 유전자와 T7 RNA 중합 효소 프로모터 하류의 5 &#39;및 3&#39;의 UTRs 간 ORF의 정확한 삽입을 수반한다. 3 &#39;UTR의 하류 및 체외 T7 RNA 중합 효소 반응에서 주형으로 사용되는 구조를 선형화. 표준 분자 생물학적 기법 (34)를 사용합니다. X.에서 스테이지 V-VI의 난자를 사용 laevis의. 축산 부분 ovariecto내, defolliculation 및 난황 봉투 제거는 표준 절차에게 32,33,35를 따릅니다. 드럼 몬드 Nanoinject II 자동 microinjector를 사용하여 난자 당 cRNA를 솔루션의 2-40 NG를 주입한다. ~ 각 실험 세트 (30) 난 모세포를 주입한다. TRPV4 - cRNA를 주입 한 후, 겐타 마이신 (100 ㎍ / ㎖)으로 ND96 매체에서 난 모세포를 배양하고 1 μM 루테늄 (14) 빨강. 2. 두 개의 전극 전압 클램프 <ol><li> 개별적으로 피펫 풀러 정밀 일회용 100 μL의 마이크로 피펫에서 붕규산 유리 기록 피펫을 잡아 당깁니다. </li><li> 전압 측정 및 전류 주입 피펫 전극을 모두 당기은 ~ 1 μm의 직경의 팁 구멍을 가지고 당겨진다. </li><li> 2 M KCl을 가진 백필 전극 0.1-0.2 밀리 옴 저항의 결과. 함께 VG-2Ax100 가상 접지 목욕 클램프, Digidata 1440 디지타이저를 통해 GeneClamp 500 앰프 인터페이스에 연결되어 HS2A의 headstages, 그들을 설치합니다. 획득<html> pClamp10 소프트웨어를 사용하여 데이터. </li><li> 20 배 배율의 해부 현미경의 무대에 장착 된 제작 된 플라스틱 실에서 1 ㎖ 화장실에서 테스트 할 수있는 난자를 놓습니다. 목욕 솔루션은 가상 접지 3 M의 KCl 한천 다리와 가까운 난자에 배치 VG-2A 가상 접지 단에 연결 염소화 실버 와이어입니다. </li><li> 솔루션의 입구와 출구로 플라스틱 호스 연속 관류 챔버를 구축합니다. 입구 튜브가 여섯 50 ㎖ 주사기 껍질 다른 용액으로 채워져 각각의 매니 폴드이다 제조 된 관류 시스템에 연결되어 연결한다. 특정 솔루션의 중력 공급 속도는 제어에 ~ ~ 3 호스의 &quot;켁&quot;램프 클램프를 사용 ㎖ / 분. </li><li> 미세 조작기에 자신의 headstages에 두 전극을 장착합니다. 미세 조작에 의해 난자의 전극 침투를 수행합니다. </li></ol> 3. 직접 Mechanosensitivity의 패치 클램프 검사 &quot;&gt; 피펫 준비, GΩ 인감 형성하고, 온 - 셀 또는 절제 모드의 형성 등의 패치 클램프의 기본 방법은 해밀의 그 외. (36)는 Conn 32입니다. <ol><li> 98 밀리미터의 KCl, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 K +-HEPES, pH를 7.2로 끝 ~ 1 μm의 직경의 구멍 (거품 번호 5-6)으로 붕규산 유리 피펫을 입력합니다. </li><li> 또한, 압력계, 5 ML의 주사기에 플라스틱 튜브를 통해 T-조인트를 통해 패치 클램프 피펫을 연결합니다. 전극과 압력계 출력 모두를 처리하기 위해 컴퓨터를 사용합니다. 10 kHz에서 데이터를 수집하고 분석을 위해 1 kHz에서 여덟 폴 베셀 필터를 통해 재생할 수 있습니다. </li><li> 다른 패치는 반복적으로 동일한 난자에서 절제 할 수 있습니다. 이 연습은 TRPV4의 분자 활동의 시험이 더 효율적이고 신뢰할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

서론에서 언급 한 바와 같이, 일반적으로 TRPV4 기능을 연구하는 데 사용되는 방법은 때때로 모순과 논쟁의 결과. 여기에 설명 된 방법 중 두 세트의 몇 가지 장점을 제공하며, 기존의 방법을 보완 할 수있다. 우리가 TRPV4 만의 연구를 설명하는 동안, 방법은 다른 이온 채널을 연구하기 위해 확장 될 수있다. 1. 효모 Luminometry 방법 신진 효모 지질 조성물 (3...

TRPS (일시적 수용체 전위) 감각 기능 1,2를 제공 양이온 채널의 일곱 아과을 포함한다. 포유 동물, TRPV에서 TRPS의 바닐 로이드 아과는 6 종류가 있습니다. TRPV4 (유형 4) 가열 3,4에 응답, 특정 화학 물질, 삼투압 부종, 또는 전단 응력. TRPV4 유전자 반복 후보 유전자 및 / 또는 5-8 클로닝 식에 의해 단리 하였다. 후자의 방법은 저자 삼투압에 유전자 산물의 응답을 하였다. TRPV4 많은 상이한 세포 유형 3,4의 개발, 생리학, 병리 또는 거의 모든 기관 및 함수로 표현된다. 눈에 띄는 말초 신경 병증 및 / 또는 골격 이형성증 (골격 발달에 이상) 9-11을 일으키는 원인이되는&gt; 50 인간의 염색체 우성 TRPV4 돌연변이입니다. 골격 이형성증의 범위는 가벼운 brachyomia 유형 3 (유형 3 왜소증), spondylometaphyseal 발육 코즐로 스키 형, 세 베리까지이형성증 다시, 일부는 신생아 또는 배아의 죽음을 초래. 메커니즘의 모든 방식이 가능한 것 같다 있지만, 아무도 다양성, 복잡성, 다양성, 이러한 질병 4 가끔 중복 설명하지 않습니다. 다른 TRP 채널 1과 마찬가지로, TRPV4는 사량입니다. 쥐 또는 인간의 TRPV4, 각각의 서브 유닛은 871 잔기로 구성되어있다. 그 중심 요소는 여섯 횡단 가능성 전압 문 K + 채널과 유사한 방식으로 배치되어 나선 (S1-S6)이다. 거기에, S4에 S1은 주변 영역을 형성하고, S5 및 S6은 투과 기공 도메인을 형성한다. S5와 S6 사이의 TRPV4 아마도 양이온 필터를 형성하도록 수렴 중 네 시퀀스 LDLFKLTIGMGDL,이어서 짧은 기공 나선이다. 470 - 잔류 N-말단 세포질 세그먼트는 단백질이나 작은 리간드를 결합하는 것으로 알려져 6 ankyrin 반복이 포함되어 있습니다. C-말단 152-잔류 세포질 부분은 구약 바인딩 가능한 다른 사이트들 사이에 칼 모듈 린 결합 순서를 포함그녀의 요소 3. TRPV4 본질적 음이온 일을 제외 양이온 채널이다. 생리 학적 기능은 칼슘 2 + 유입 자극을 형질 도입하는 것이지만, 그것은 P 캘리포니아에서 이가 호의를, 또한 아이젠만 IV 투과성 순서와 다른 양이온을 투과 : P 나 7 ~ 12. 단일 채널 컨덕턴스 ~ 90 피코 초 외부와 ~ 40 피코 초 안쪽 6,13,14에 정류한다. 발현 된 (아래) 현재는 저자 삼투 부종, 전단 응력, 또는 온기 (15)에 의해 활성화 될 수 있습니다. 또한 고도 불포화 지방산 (16, 17) 및 합성 phorbal 에스테르 18 4αPDD에 의해 활성화된다. 현재, 모두가 높은 처리량, 작은 분자 화면에 의해 발견, 10-9 10-8 M (20)의 효과가 가장 강력한 효능은 GSK1016790A 19과 길항제 GSK2193874입니다. TRPV4 연구의 두 가지 핵심 영역은 혼란 남아(1) TRPV4 크게는 mechanosensitivity 공부하더라도으로, 분자 기초는 논쟁의 여지가있다. 한 모델은, 저자 삼투압 어떻게 든 epoxygenase에 의해 산 (EET)를 epoxyeicosatrienoic로 변환되는 고도 불포화 지방산 (PUFA) 아라키돈 산 (AA)을 생산하는 포스 포 리파아제 A2 (PLA2)를 활성화하고 EET의 결합이 TRPV4 16를 활성화 설명 17. 그러나, TRPV4 자체가 직접 간단한 설명을 제공하는 멤브레인 스트레칭 14 (아래)에 대응하기 위해 표시되었습니다. (2) TRPV4 돌연변이 병리 어지러 울 수 있습니다. 기초에, 하나는 질병 손실, 감소 또는 채널 활동의 증가에 기인하는지 여부를 알 필요가있다. 여기에서도, 문학은 명확하지입니다. 여러 골격-이형성증의 대립 유전자는 높은 활성을 가지고보고있는 동안, (이득의 기능, GOF) 4,21은 여러 가지가 활동 (기능 상실, LOF) 10,22을 감소하는 것으로보고되었다. 14 대립 유전자의 체계적인 연구에 발견모든 GOF 수 변이 (아래) 23. TRPV4 기능의 전체 손실에도 불구하고 사소한 결함이 가능한 또는 비옥 녹아웃 마우스,,, - 일부는 LOI들입니다 주장은 trpV4 - /의 표현형을 부정하는 것 같습니다. 이러한 논쟁의 일부는 방법 론적 기원을 가지고 있습니다. 연구소는 다른 방법, 또는 방법의 변형을 사용하고, 다른 심사 기준을 사용한다. 가장 일반적으로, TRPV4는 일시적으로 (HEK, CHO, 헬라) 및 작용제 또는 저장성 자극에 따라 내부 [칼슘 2 +]의 증가는 칼슘 2 +에 민감한 형광 염료의 Fura-2에 등록되어 배양 된 포유 동물 세포에서 발현된다. 이 형광 분석에 과다 의존은 1 비판을 받아왔다. 다른 집단에서 발현 수준은 그 내부에 분포뿐만 아니라 효과적인 염료 농도가 제어되고 기록되어야 할 필요가있다. 보다 안정적인는 직접 전기 생리학 검사입니다. 심지어이 같은 commonly는 연습, 문제없이도 없습니다. 개별 배양 세포에서 발현 수준은 제어가 곤란하기 때문에, 전체 - 셀 전류가 큰 변동이있다. 전류가 작기 때문에 또한, 신뢰할 수있는 통계는 종종 실용적이지 큰 샘플 크기에 의존해야합니다. 패치 클램프 검사는 거의 수행되지 않았습니다. 일부 이러한 기록은 16, 17 통계적 평가는 도전하게 활동 버스트의 클러스터를 보여줍니다. 더 나은 분자 mechanosensitivity을 이해하기 위해, 우리는 TRPV4을 검사하는 두 개의 추가 시스템을 개발했습니다. (1) 거리의 보통 포유류의 파트너 TRPV4를 분리하기 위해, 우리는 효모 (24) 신진에 쥐 TRPV4을 표명했다. 이 진화 적으로 먼 상황에서 TRPV4의 기능적 발현은 여전히 평소 파트너없이 침투 힘에 응답 할 수 있음을 보여 주었다. 효모는 AA 또는 EET으로 더 된 PUFA를하지 않으며, 게놈이 간편 체크인을 더 PLA2 또는 epoxygenase 유전자가 없기 때문에(투약) 소지도 TRPV4는 힘을 감지하기 위해 그들이 필요하지 않습니다 것을 보여줍니다. 분자 생물학적으로 가장 의무가 진핵 생물에서 TRPV4를 갖는 것은 또한 효율적인 앞으로 또는 역방향 유전자 조작 25 수 있습니다. (2) TRPV4의 깊이있는 생물 물리학 적 분석을 위해, 우리는 Xenopus의 난자에 TRPV4을 표명했다. nA의 (10 -10 10 -9 A)의 전류로 서브 - 나를 얻을 배양 된 세포와 달리 난자 μA의 (10-6 10-4)의 전류를 표현한다. 소음에 훨씬 더 큰 신호가 더 나은 정량화하고 자신감 비교를 할 수 있습니다. TRPV4, 그래서 표현도 패치 클램프를 사용하여 개별 분자로 검사 할 수 있습니다. 하나의 난자가 다시 정량보다 안정적 만들기, 반복 패치 샘플링을 할 수 있습니다. 이러한 연구는 TRPV4 채널 자체가 직접 막 스트레치 힘 (14)에 의해 활성화 될 수있는 것으로 나타났다. 분석은 14 대표 골격-발육 대립 유전자는 모든 기능 획득 돌연변이 있다는 것을 보여 주었다. 또한, degr이 제정 칼슘 2 + 누설의 EE는 골격 질환 (23)의 심각도를 평행. 때문에 그들의 참신 및 유용성,이 두 가지 방법의 상세한 절차는 TRPV4 또는 유사한 채널에서 미래의 연구에 복제 할 수 있도록 여기에 조립된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td style="width:93px;">Wescor</td>
			<td style="width:119px;">Wescor 5500</td>
			<td style="width:167px;">Logan, UT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sirius Single Tube Luminometer </td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berhold</td>
			<td style="width:119px;">Sirius </td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microplate luminometer</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold </td>
			<td style="width:119px;">Mithras LB940</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luminometry software</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold</td>
			<td style="width:119px;">MikroWin2000</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">Patch clamp and software</td>
			<td style="width:93px;">Axon Instrument</td>
			<td style="width:119px;">HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software </td>
			<td>Union City, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">manometer</td>
			<td style="width:93px;">Bio-Tec</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Winooski, VT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipet puller</td>
			<td style="width:93px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Novata, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:93px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanoinject II</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material:</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">luciferin coelenterazine</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA polymerase reaction</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">mMessage mMachine</td>
			<td>Austin, TX, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ruthenium red </td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micropipets </td>
			<td style="width:93px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">100 microliter micropipets</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-fidelity PfuUtra polymerase </td>
			<td style="width:93px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>La Jolla, CA, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4

TRPV4 (과도 수용체 잠재력, 바닐 로이드 가족, 유형 4) 널리 척추 동물의 조직에서 발현되고, 기계적인 힘에 의해 등 여러 가지 자극에 의​​해 활성화된다. 특정 TRPV4 돌연변이는 인간의 복잡한 유전 뼈 또는 신경 병리의 원인이됩니다. 야생 형 또는 돌연변이 TRPV4 도입 유전자는 일반적으로 배양 된 포유 동물 세포에서 발현과의 Fura-2 형광 측정에 의해 전극에 의해 검사된다. mechanosensitivity 및 질병의 분자 염기의 메커니즘의 측면에서, 현재 문헌들은 혼란과 논란이있다. 기존의 방법을 보완하기 위해, 우리는 TRPV4의 분자 특성을 검사하는 두 가지 추가 방법을 설명합니다. (1) 쥐 TRPV4 및 애큐 오린의 유전자는 신진 효모로 변환된다. 형질 전환 체 인구의 저자 osmtic 충격 TRPV4 채널을 통해 발표로 인해 칼슘 2 +와 애큐 오린의 조합에 luminometric 신호를 얻을 수 있습니다. 여기 TRPV4는 평소 포유류의 파트너 단백질로부터 분리자체 mechanosensitivity을 보여준다. (2) TRPV4의 된 cRNA는 Xenopus의 난자에 주입된다. 배양의 적당한 기간 후에 거시적 TRPV4 전류는 두 전극 전압 클램프로 검사된다. 난자 화장실에서 불활성 농도의 삼투압의 제거시 현재의 상승은 mechanosensitivity 나타낸다. 난자에서 마이크로 암페어 (10-6 10-4) 전류는 명확 quantifications과 자신감 평가를 항복, 배양 된 세포에서 nanoAmpere subnano 대 (10 -10 -9 10) 전류보다 훨씬 크다. 개별 채널 단백질의 활동을 반영 미세한 전류가 직접 온 셀 또는 절제 모드에서, 패치 클램프에 따라 등록 될 수있다. 같은 난자는 더 나은 데이터 복제를 허용, 여러 패치 샘플을 제공합니다. 패치에 적용 흡입구 직접 mechanosensitivity을 평가하기 위해 TRPV4을 활성화 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 TRP 채널의 다른 유형의 연구에 유용 할 것이다.

일반적인 luminometry 실험에서, 400-1,200 mOsM 다운 저장성 충격의 범위는 1,400 mOsM의 문화를 20 ㎕로 다른 낮은 삼투압의 충격 솔루션 200 μl를 추가하여 달성된다. 효모 세포 비어 p416GPDV4 플라스미드 또는 이온 필터에서 돌연변이 (도 1) (24)와 TRPV4 유전자를 포함하는 하나의 형질 전환 : 실험의 RLU는이 음성 대조군에 비해 때 TRPV4 활성은 분명하다. 일반적?...

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Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + - 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 - 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난자를 주입했다.

효모 Luminometric 및<em&gt; Xenopus의</emTRPV4의 분자 Mechanosensitivity의&gt; 난자 전기 생리 시험

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

yeast-luminometric-xenopus-oocyte-electrophysiological-examinations

Research

JoVE Journal

Biology

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

10.0K 조회수.  University of Wisconsin – Madison.  TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + - 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 - 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난?...

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

라이브 고정화 효모 세포의 시각화에 대한 신속한 기술

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

연구

생물학

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus의</em형광 측정으로&gt; 난자 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...