ברצוננו להודות לאנדריאה Kremsreiter לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי NIH GM096088 והאמון וילאס באוניברסיטת ויסקונסין - מדיסון.

1. שיטות Luminometry השמרים השתמש BYYT זן של שמר אפייה. זה yvc1-tok1 נגזר של BY4741 (מאטה, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). להפוך לתאים עם pEVP1/Aeq Leu לבחירה להביע aequorin פלסמיד והעכברוש-להביע TRPV4 פלסמיד ura לבחירת p416GPDV4, כפי שתואר בBatiza et al. 26 וLoukin et al. 24 שיטות סטנדרטיות שימוש בבניית פלסמיד ושינוי 27 . זן שמרים ופלסמידים זמינים לפי בקשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 2 מיליליטר של שמרי תאי הלילה לשלב שלאחר לוגריתמים שייקרו 30 מעלות צלזיוס בLeu-ura-&quot;DCD&quot; בינוני נשירת 28 (גרסה המדולדלת סולפט של מדיום CMD-Leu-ura 29), בתוספת סורביטול 1M . לחסן 200 μl של תרבויות אלה לתוך 1.8 מיליליטר של מדיום טרי בתוספת 2 מיקרומטר של lucifericoelenterazine n. לגדול בחושך בטמפרטורת חדר למשך שעה 24 אחרת בלי ללחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את osmolarity של התרבות (בדרך כלל ב1,400 mOsM) ופתרונות אחרים (להלן) באמצעות osmometer לחץ אדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20 μl של תרבות הטרי לתוך צינור luminometer 12 מ&quot;מ לluminometer צינור יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להלם hypotonic, להוסיף 200 μl של פתרון, המכיל 25 מ&quot;מ NaEGTA (pH 7.2) או שמות (pH 7.2) ו500-100 mM NaCl, (osmolarity הכולל של 1,200-400 mOsM) בהתאם לרמה של ההלם הרצוי. ברציפות לפקח על הארה לפני ולפחות 120 שניות לאחר downshock האוסמוטי, שנקטע רק על ידי פעולת דילול הקצרה. הירשם פלט luminometer במחשב שולחני כיחידות יחסי הארה (רול). </li></ol> אמנם לא ללימוד TRPV4 המהונדס, השתמשנו גרסה של הפרוטוקול הנ&quot;ל במערכת אוטומטית לבחון את תגובותיהם של מספר גדול של זני שמרים. o מחקרf התגובות להיפו 30 או 31 בגירויי hyperosmotic של deletome השמרים (האוסף של deletants גן יחיד 4,906 שמרים) באמצעות luminometer microplate וניתחו עם תוכנה מקבילה היו מוצלחות. 2. ו -3. שיטות אלקטרופיזיולוגיה ביצית אלקטרופיזיולוגיה משתמשת בשיטות בסיסיות 32. PCR להגביר את המסגרת הפתוחה קריאה של wild-type או TRPV4 מוטציה באמצעות איכות גבוהה פולימראז PfuUtra והשתלב pGH19 33. זה כרוך בהחדרה מדויקת של ORF בין 5 &#39;ו 3&#39; UTRs של גן גלובין β Xenopus ומורד הזרם של אמרגן RNA-פולימראז T7. Linearize המבנה במורד הזרם של UTR &#39;3 ומשמש כתבניות בתגובה במבחנה פולימראז T7-RNA. השתמש בטכניקות מולקולרית ביולוגיות סטנדרטיות 34. השתמש בביציות V-VI שלב מX. laevis. גידול בעלי חיים, ovariecto חלקישלי, הסרת מעטפת defolliculation, וvitelline בצע את הליכים סטנדרטיים 32,33,35. הזרק 2-40 ננוגרם של פתרון קרן לביצית באמצעות microinjector האוטומטי דראמונד Nanoinject השני. הזרק ~ 30 ביציות עבור כל קבוצה של ניסויים. לאחר הזרקת TRPV4-קרן, דגירה הביציות במדיום ND96 עם גנטמיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ורותניום 1 מיקרומטר אדום 14. 2. שתי אלקטרודה מתח קלאמפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך טפטפות הקלטת זכוכית ורוסיליקט מmicropipettes חד פעמי דיוק 100 μl בנפרד עם חולץ פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את שני מתח מדידה ואלקטרודות פיפטה הזרקה שוטפות נמשכים יש צמצם קצה ~ 1 מיקרומטר קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות למילוי עם 2 M KCl וכתוצאה מכך 0.1-0.2 התנגדות mΩ. לעלות אותם על headstages HS2A, אשר יחד עם מהדק מרחץ מקורקע וירטואלי VG-2Ax100, מחוברים לממשק מגבר GeneClamp 500 דרך digitizer Digidata 1440. לרכוש<html> הנתונים באמצעות תוכנת pClamp10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצית להיבדק באמבט 1 מיליליטר בתא פלסטיק מפוברק רכוב על הבמה של מיקרוסקופ לנתח עם ההגדלה 20X. פתרון האמבטיה הוא על ידי גשר אגר 3 M KCl וחוט כסף כלור ממוקם קרוב לביצית ומחובר לבמת קרקע הווירטואלית VG-2A-מקורקע וירטואלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות את החדר לזלוף רציף עם tubings פלסטיק כפתרון כניסה ויציאה. חבר את צינורות היניקה מחוברים למערכת זלוף מפוברקת, שהוא סעפת של שישה פגזים 50 מזרק מיליליטר, כל אחת מלאה בפתרון אחר. שיעורי עדכון כובד של פתרון מסוים הוא נשלט ל~ 2-3 מיליליטר / דקה באמצעות מהדק רמפה &quot;קק&quot; על tubings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שני אלקטרודות עם headstages על micromanipulators. לבצע חדירות האלקטרודה של הביצית על ידי מיקרומניפולציה. </li></ol> 3. הצמד תיקון בחינת ישיר Mechanosensitivity &quot;&gt; השיטות הבסיסיות של מהדק תיקון כולל הכנת פיפטה, היווצרות GΩ-חותם, והיווצרותם של תאים או במצבים נכרת הן אלה בהאמיל et al. 36 ומחולית 32. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא טפטפות זכוכית ורוסיליקט עם פתיחה ~ 1 מיקרומטר קוטר בקצה (מספר הבועה 5-6) עם 98 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו10 מ&quot;מ K +-HEPES, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את פיפטה מהדק תיקון באמצעות צינורות פלסטיק למזרק 5 מ&quot;ל ובאמצעות T-משותף, גם מד לחץ. להשתמש במחשב כדי לטפל בשתי האלקטרודה ותפוקות מד הלחץ. רוכשת את הנתונים ב10 קילוהרץ, ולאחר מכן לנגן דרך מסנן שמונה מוט בסל בקילוהרץ 1 לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן נכרת מאותה הביצית תיקונים שונים שוב ושוב. נוהג זה הופך את הבדיקה של הפעילות המולקולרית של TRPV4 יותר יעילה ואמינה. </li></ol>

<ol>
	<li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+TRP+channels.">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li><li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels.">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li><li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4:+From+structure+to+disease.">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li><li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies.">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li><li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+(VR-OAC),+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor.">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li><li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OTRPC4,+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity.">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li><li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trp12,+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney.">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li><li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein,+VRL-2.">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li><li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia.">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li><li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia,+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia.">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li><li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia.">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li><li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4.">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2.">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force.">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li><li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating:+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways.">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels.">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li><li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+swelling,+heat,+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4.">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li><li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators.">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li><li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse:+Part+2.">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li><li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure.">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+(TRPV4)+cation+channel+mutation.">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li><li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet.">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations.">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids.">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4.">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li><li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse.">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell+wall-compromised+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Ca(2+)+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue.">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li><li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2++influx,+a+yeast+&amp;#34;deletome&amp;#34;+analysis.">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &amp;#34;deletome&amp;#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li><li>Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell-wall-compromized+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 294, (1999).</li><li>Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).</li><li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K++channel+Ykc1.">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells.">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאמור במבוא, השיטות נפוצות ללמוד פונקציות TRPV4 לעתים הסתיימו בסתירות ומחלוקות. שתי קבוצות של שיטות שתוארו כאן מציעות כמה יתרונות והוא יכול להשלים את השיטות הקיימות. למרות שאנו רק לתאר מחקרים על TRPV4, השיטות ניתן להאריך ללמוד תעלות יונים אחרות גם כן. <p class="jove_title" style=";text...

TRPS (פוטנציאלי קולטן חולפים) מהווה שבעה subfamilies ערוצי קטיון המשרתים פונקציות חושיות 1,2. ביונקים, TRPV, תת משפחת vanilloid של TRPS, יש שישה סוגים. TRPV4 (סוג 4) 3,4 מגיב לחום, כימיקלים מסוימים, נפיחות האוסמוטי, או מאמץ גזירה. גן TRPV4 היה מבודד שוב ושוב על ידי מועמד גן ו / או ביטוי שיבוט 5-8. השיטה השנייה ואחרי התגובה של מוצר הגן להיפו אוסמולריות. TRPV4 בא לידי ביטוי כמעט בכל איברים ופונקציות בפיתוח, הפיסיולוגיה, פתולוגיה או של סוגי תאים שונים רבים 3,4. בולט הם&gt; 50 מוטציות TRPV4 אוטוזומלית דומיננטיות אנושי, גורם נוירופתיה היקפית ו / או dysplasias שלד (ליקויים בהתפתחות שלד) 9-11. Dysplasias השלד נע בין סוג brachyomia קל 3 (סוג 3 גמדות), סוג קוזלובסקי דיספלזיה spondylometaphyseal, לseveמחדש dysplasias, חלקם בגרימת מוות בילוד או עוברי. למרות כל הנימוסים של מנגנונים נראים אפשריים, אף מסביר את הגיוון, את המורכבות, השתנות, ומדי פעם חפיפות של מחלות אלו 4. כמו ערוצים אחרים TRP 1, TRPV4 הוא tetramer. בחולדה או TRPV4 אדם, כל מקטע הוא כלל 871 שאריות. האלמנט המרכזי שלה הוא הטרנסממברני שישה סלילים (S1-S6), שסביר להניח שמסודרים בצורה דומה ל-K + ערוצי מתח מגודרת. שם, S1 לS4 מהווה תחום היקפי וS5 S6 ויוצרים תחום הנקבובית חלחול. בין S5 ו S6 של TRPV4 הוא סליל נקבובית קצר אחרי LDLFKLTIGMGDL הרצף, ארבעה מהם להתכנס ככל הנראה כדי ליצור את מסנן קטיון. קטע cytoplasmic N-מסוף 470 השאריות מכיל 6 חזרות ankyrin, היודע להתקשר לחלבונים או ligands הקטן. קטע cytoplasmic 152 שאריות C-המסוף כולל רצף מחייב calmodulin בין אתרים אפשריים אחרים אשר נקלטות otהאלמנטים שלה 3. TRPV4 הוא ערוץ קטיון שלמעשה אינו כולל אניוני 1. בעוד התפקוד הפיזיולוגי שלה הוא transduce גירויים לCa 2 + זרם, הוא גם חדיר לקטיונים אחרים עם רצף חדירות אייזנמן IV, לטובת דו ערכית בCa P: P Na 7 ~ 12V. מוליכות ערוץ יחיד מתקנת ב ~ 90 PS 40 PS כלפי חוץ וכלפי פנים ~ 6,13,14. הביע Heterologously יכול להיות מופעל נוכחית (להלן) על ידי נפיחות היפו אוסמוטי, מאמץ גזירה, או חום 15. כמו כן, מופעל על ידי חומצות שומן רבות בלתי רוויות שומן 16,17 ואסתר phorbal הסינתטי 4αPDD 18. בשלב נוכחי, אגוניסט החזק ביותר הוא GSK1016790A 19 ואנטגוניסט הוא GSK2193874, יעיל ב10 -9 ל10 -8 M 20, שניהם התגלו על ידי תפוקה גבוהה, מסך קטן מולקולרי. שני תחומים מרכזיים של מחקר TRPV4 יישארו מבלבל: (1) גם כTRPV4 נלמד במידה רבה לmechanosensitivity, הבסיס המולקולרי שלה הוא שנוי במחלוקת. מודל אחד מתאר היפו osmolarity איכשהו מפעיל פוספוליפאז A2 (PLA2) כדי לייצר את חומצת שומן רב בלתי רווי (PUFA) חומצה ארכידונית (AA), אשר מומרת epoxyeicosatrienoic חומצה (EET) על ידי epoxygenase, ואת הכריכה של EET מפעילה TRPV4 16, 17. ובכל זאת, TRPV4 עצמו הוכח להגיב ישירות לקרום למתוח 14 (להלן), ומספק הסבר פשוט יותר. (2) פתולוגיות המוטציה TRPV4 הם מבלבלים. בבסיס, צריך לדעת אם המחלות הן תוצאה של האובדן, הירידה, או העלייה של פעילות ערוץ. גם כאן, הספרות היא רחוק מלהיות ברור. בעוד אללים שלד-דיספלזיה מרובות דווחו ליש פעילות גבוהה יותר, (, GOF לזכות-of-פונקציה) 4,21, כמה דווחו לצמצם פעילות (, LOF אובדן של פונקציה) 10,22. לימוד שיטתי של 14 אללים מצא אותםכל המוטציות שGOF (להלן) 23. נראית את הטענה כי חלקם LOFs לסתור את הפנוטיפ של trpV4-/ - עכבר בנוקאאוט, שהם ברי קיימא או פורה, עם פגמים קלים בלבד, למרות אובדן תפקוד TRPV4 מלא. חלק מהמחלוקות אלה יש מוצא מתודולוגי. מעבדות להשתמש בשיטות שונות, או גרסאות של שיטה אחת, ומעסיקות תקני שיפוט שונים. הנפוץ ביותר, TRPV4 מתבטא transiently בתאי יונקים בתרבית (HEK, CHO, הלה) והעלייה פנימי [Ca 2 +] על אגוניסט או גירוי hypotonic רשום עם Ca 2 + צבע פלואורסצנטי רגיש, הפורע-2. הסתמכות היתר על assay fluorometric זה זכתה לביקורת 1. רמת הביטוי באוכלוסיות שונות, ההפצה בו, כמו גם את ריכוז הצבע היעיל, צריכה להיות מבוקרת ומתועדת. יותר אמין הוא בדיקות אלקטרו הישירות. גם זה, כמו commonly התאמן, הוא גם לא בלי בעיות. מכיוון שרמות הביטוי בתאים בתרבית בודדות הן קשות לשליטה, יש לי כל תא זרמים וריאציות גדולות. יתר על כן, מכיוון שהזרמים קטנים, נתונים סטטיסטיים אמינים יצטרכו להסתמך על מדגמים גדולים, לעתים קרובות לא מעשיים. בדיקות תיקון מהדק רק לעתים נדירות כבר בוצעו. כמה הקלטות כאלה מראות אשכולות של פרצי פעילות שהופכים את ההערכה סטטיסטית מאתגרת 16,17. כדי להבין טוב יותר mechanosensitivity המולקולרי, פיתחנו שתי מערכות נוספות כדי לבחון TRPV4. (1) כדי לבודד TRPV4 מהשותפים של היונקים הרגילים שלו, יש לנו הביע TRPV4 עכברוש בשמרי ניצני 24. ביטוי תפקודי של TRPV4 בהקשר אבולוציונית רחוק זה הראה שזה יכול עדיין להגיב לכוח האוסמוטי ללא שותפים הרגילים שלו. מכיוון ששמרים אינו PUFAs כגון AA או EET, ויש לו את הגנום שלו אין גנים PLA2 או epoxygenase, expre זהssion גם מראה כי הם אינם נדרשים לTRPV4 לחוש בכוח. לאחר TRPV4 באאוקריוטים ביולוגי נוחים ביותר המולקולריים גם מאפשר מניפולציות יעילים קדימה או לאחור גנטיות 25. (2) עבור ניתוחי biophysical מעמיקים של TRPV4, הבענו TRPV4 ב ביציות Xenopus. שלא כמו תאים בתרבית, אשר יניבו תת Na Na ל( 10 -10 ל10 -9) זרמים, ביצית מבטאת זרמים בμA של (10 -6 ל10 -4). אות גדולה בהרבה מעל הרעש מאפשרת כימות והשוואה בטוחה יותר טובות יותר. TRPV4, כך באו לידי ביטוי, יכול גם להיבחן כמולקולות בודדות באמצעות מהדק תיקון. ביצית אחת מאפשרת דגימת תיקון חוזר ונשנה, מה שהופך שוב כימות אמין יותר. מחקרים כאלה הראו כי ערוץ TRPV4 עצמו יכול באופן ישיר להיות מופעל על ידי כוח מתיחת קרום 14. ניתוח הראה גם כי 14 אללים שלד-דיספלזיה נציג כל מוטציות הרווח של הפונקציה. יתר על כן, degrEE של דליפה + זה מכונן Ca 2 מקביל לחומרת המחלות שלד 23. בגלל החידוש והתועלת שלהם, הנהלים מפורטים של שתי שיטות אלה הם התאספו כאן כדי לאפשר משוכפלים במחקר עתידי על TRPV4 או ערוצים דומים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td style="width:93px;">Wescor</td>
			<td style="width:119px;">Wescor 5500</td>
			<td style="width:167px;">Logan, UT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sirius Single Tube Luminometer </td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berhold</td>
			<td style="width:119px;">Sirius </td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microplate luminometer</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold </td>
			<td style="width:119px;">Mithras LB940</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luminometry software</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold</td>
			<td style="width:119px;">MikroWin2000</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">Patch clamp and software</td>
			<td style="width:93px;">Axon Instrument</td>
			<td style="width:119px;">HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software </td>
			<td>Union City, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">manometer</td>
			<td style="width:93px;">Bio-Tec</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Winooski, VT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipet puller</td>
			<td style="width:93px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Novata, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:93px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanoinject II</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material:</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">luciferin coelenterazine</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA polymerase reaction</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">mMessage mMachine</td>
			<td>Austin, TX, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ruthenium red </td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micropipets </td>
			<td style="width:93px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">100 microliter micropipets</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-fidelity PfuUtra polymerase </td>
			<td style="width:93px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>La Jolla, CA, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4

TRPV4 (חלוף קולטן פוטנציאלים, משפחת vanilloid, סוג 4) באו לידי הביטוי באופן נרחב ברקמות חוליות ומופעל על ידי מספר גירויים, ובכלל זה על ידי כוחות מכאניים. מוטציות TRPV4 מסוימות לגרום לעצם תורשתי מורכב או פתולוגיות עצביות בבני אדם. transgenes Wild-type או TRPV4 המוטציה באים לידי ביטוי בדרך כלל בתאי יונקים בתרבית ונבדק על ידי הפורע-2 fluorometry ועל ידי אלקטרודות. במונחים של המנגנון mechanosensitivity והבסיסים המולקולריים של המחלות, הספרות הנוכחית היא מבלבלת ושנויה במחלוקת. כדי להשלים את השיטות קיימות, אנו מתארים שתי שיטות נוספות כדי לבחון את המאפיינים המולקולריים של TRPV4. (1) החולדה TRPV4 וtransgene aequorin הופכים שמרי ניצנים. הלם היפו osmtic מאוכלוסיית transformant תשואות אות luminometric בשל שילוב של aequorin עם Ca 2 +, שוחררה דרך ערוץ TRPV4. הנה TRPV4 מבודד מחלבונים היונקים הרגילים שלו השותףומגלה mechanosensitivity משלו. (2) קרנה של TRPV4 מוזרקת לתוך ביציות Xenopus. לאחר תקופה מתאימה של דגירה, הנוכחי TRPV4 מקרוסקופית נבחן עם מהדק מתח שתי אלקטרודות. העלייה הנוכחית עם הסרת osmoticum אינרטי מאמבטית הביצית מעידה על mechanosensitivity. זרמי microAmpere (10 -6 ל10 -4) מביציות הם הרבה יותר גדולים מאשר זרמי subnano לnanoAmpere (10 -10 ל10 -9) מהתאים בתרבית, מניב quantifications והערכות בטוחים יותר ברורים יותר. זרמים מיקרוסקופיים המשקפים את פעילותם של חלבוני ערוץ בודדים יכולים גם להיות רשומים ישירות תחת מהדק תיקון, בתאים או במצב נכרת. אותה הביצית מספקת דגימות תיקון מרובות, מאפשר שכפול נתונים טובים יותר. שאיבה להחיל תיקונים יכולה להפעיל TRPV4 להעריך mechanosensitivity ישירות. שיטות אלו צריכה להיות גם שימושיות בחקר סוגים אחרים של ערוצי TRP.

בניסוי luminometry טיפוסי, מגוון של זעזועי hypotonic למטה 400-1,200 mOsM מושגת על ידי הוספת 200 μl של פתרונות הלם osmolarity הנמוך שונה ל20 μl של התרבות ב1,400 mOsM. פעילות TRPV4 לידי ביטוי כאשר RLU של הניסוי הוא בהשוואה לזה של שני פקדים שליליים: תאי שמרים הפכו עם פלסמיד p416GPDV4 הריק או אחד המכיל את גן TRP...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.

Luminometric ושמרים<em&gt; Xenopus</em&gt; ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

yeast-luminometric-xenopus-oocyte-electrophysiological-examinations

Research

JoVE Journal

Biology

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

10.0K Views.  University of Wisconsin – Madison.  כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד ?...

Video: Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...