وأيد هذا البحث من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG، المؤسسة الألمانية للبحوث) تحت رقم المنحة FO 315/4- والبرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقية المنحة رقم HEALTH-F2-2009-241778 إلى CF.

1. البذر من الخلايا البطانية في لوحات جيدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران الخلايا البطانية (cEND) في T75 قارورة الثقافة، وتغيير المتوسطة (DMEM تحتوي على 10٪ FCS، 50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ L-الجلوتامين) مرتين في الأسبوع، حتى يتم التوصل إلى نقطة التقاء. (للاطلاع على جيل وتخليد من الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة، الرجاء مراجعة Burek وآخرون، 2012؛. فورستر وآخرون، 2005 21،19). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني ويعرض للتريبسين الخلايا مع 2 مل دافئ حل التربسين EDTA-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى فرقت طبقة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 8 مل مستنبت في الخلايا. اضغط على قارورة عدة مرات لفصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الخلايا تحت المجهر لضمان حياد تام من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة المتوسطة مع الخلايا منفصلة صعودا وهبوطا. دوامة القارورة لمزج suspensi الخليةعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 20 ميكرولتر لتعليق الخلية، وضعت في عدادة الكريات وحساب عدد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كثافة الخلية والبذور 20،000 خلية / سم 2 في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية في collagen1 precoated 6 جيدا مرنة القاع لوحات ثقافة (57.75 سم 2) في إجمالي حجم 3 مل / جيد. كل بئر تبلغ مساحتها 9.62 سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد حتى متموجة. تغيير ثقافة المتوسط ​​مرتين في الأسبوع. </li></ol> 2. تمايز الخلايا قبل الاصابة الإمتداد التي يسببها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة المتوسط ​​من الخلايا مع تمايز المتوسطة (DMEM تحتوي على 1٪ مصل-جردت مصل العجل الجنين (ssFCS)، 50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li></ol> 3. الاصابات التي يسببها تمتد من الخلايا البطانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على إصابة جهاز تحكم الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين التأخير إلى 50 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط منظم ضغط إلى 15 رطل لكل بوصة مربعة واضغط على الزناد عدة مرات حتى يصبح الضغط الذروة المسجلة مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط منظم ضغط إلى القيمة المطلوبة. استخدام الجدول 1 كدليل لتوليد درجات مختلفة من إصابات التمدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الثقافة مرنة ذات قاع 6 جيدا (57.75 سم 2) في حامل صينية. تأكد من أن يتم تعيين محدد جيدا لحجم جيدا الصحيح (أي بئر كبيرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قابس محول بشدة على البئر. الاستمرار على قابس بقوة في مكانها بيد واحدة بينما من ناحية أخرى يدفع على الزناد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل ذروة الضغط المتولدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على الفور العودة الى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة من الوقت المطلوب أو استخدامها على الفور للنجاح التجارب أو التقييم. </li></ol> 4. تقييم الاصابات الإمتداد بواسطة الفحص صبغ امتصاص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفور الخلايا STRمحفورا (الخطوة 3.7)، إضافة 30 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل للبقاء وصمة عار أن يقوم بدور المنبه السمسة (يرجى الاطلاع على الجدول التكميلي للمواد والمعدات) إلى مستنبت الخلية (ملاحظة: 10 ميكرولتر من محلول الصبغة هو لاستخدامها في كل مل من مستنبت الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إضافة الصبغة إلى الخلايا، وعرض على الفور تحت المجهر مضان. </li></ol> 5. تقييم الاصابات الإمتداد بواسطة إنزيم اللاكتات (LDH) بيان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد وتمتد الخلايا (الخطوة 3.7)، وإزالة 200 ميكرولتر من مستنبت الخلية من البئر. تفعل الشيء نفسه بالنسبة كل نقطة زمنية بعد الاصابه كنت ترغب أن تدرج في التحقيق الخاص من LDH الإفراج (أي على سبيل المثال 30 دقيقة، 1 ساعة، 2 ساعة، الخ.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في مستنبت الخلية في أعلى الإعداد من microcentrifuge لمدة 5 دقائق لإزالة أي حطام خلية. إزالة طاف واستخدام هذا للخطوات اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد حأنهى افي الخطوة 5.1 و لقد أخذ العينات الضرورية التي ترغب في الحصول من النقاط الزمنية المختلفة التي ترغب في التحقيق، ليز الخلايا باستخدام الحل تحلل المدرجة في LDH فحص عدة (انظر الجدول التكميلي للمواد والمعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 100 ميكرولتر من مقايسة المتوسطة المدرجة في مقايسة كيتو كل بئر من لوحة 96 بئرا المنصوص عليها في عدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 100 ميكرولتر من خلية خالية من الخلايا المتوسطة الثقافة في بئرين موازية من لوحة 96-آبار المدرجة في هذه المجموعة مقايسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الامتصاصية في 492 نانومتر. </li></ol>

<ol>
	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+traumatic+brain+injury.">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li><li>Morrison, B., Elkin, B., Doll&#233;, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury.">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li><li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alterations+in+[Ca2+]i+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia:+an+in+vitro+model+for+neural+trauma.">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li><li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma.">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li><li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture:+characterization+of+the+model+using+astrocytes.">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li><li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal,+glial+and+endothelia+cells+(Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase.">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth.">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li><li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity.">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li><li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+voltage-dependent+Mg2++blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons.">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li><li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury.">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li><li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li><li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells:+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta.">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li><li>F&#246;rster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li><li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier.">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li><li>Burek, N. M., Salvador, E., F&#246;rster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li><li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li><li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat:+Part+2:+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins.">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد درس تأثير الإصابة الميكانيكية في المختبر، وأنشئت طرق الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية والخلايا البطانية الأبهر 8، 9، 22. هناك، ومع ذلك، لا يزال حتى الآن لا يعرف في نموذج المختبر من الإصابة تمتد في مثقف الخلايا البطانية الدماغ. نماذج الخلوية من الصدمة توفر مزايا قيمة على النماذج الحيوانية منذ البيئة الميكانيكية للخلايا يمكن تسيطر على وجه التحديد 6. وبالتالي، نموذج في المختبر لصدمة بسبب الاصابة تمتد باستخدام مثقف خلايا المخ البطانية التي تكون بمثابة نموذج من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​مثل ما يعرض بروتوكول لدينا قد تكون مفيدة. هذا البروتوكول يجعل من استخدام الخلايا cEND، وهو نموذج BBB أنشئت في المختبر لدينا. منذ غالبا ما تم توثيقه BBB انهيار في المرضى الذين يعانون المصرف التجاري العراقي TBI وغالبا ما يرتبط اختلال BBB الذي يمكن أن يؤدي إلى تشكيل وذمة 23، 24، وطريقة بريهented هنا على وجه التحديد قد يمكن استخدامها في إجراء الدراسات BBB فيما يتعلق TBI. في هذا النموذج، فمن المهم أن تأخذ الرعاية من مدى يتم تطبيق درجة الإصابة تمتد إلى الخلايا. في بقدر ما يصابون الخلايا في أي حال، وأيا كان مع كمية الضغط يتم تطبيقها، ودرجة الإصابة التي يمكن أن تؤثر الخلايا البطانية تختلف كثيرا كثيرا من أنواع الخلايا الأخرى. الخلايا البطانية الأبهر هي أكثر مقاومة للإصابة تمتد من الخلايا النجمية أو الخلايا الدبقية المختلطة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها إصلاح بسرعة أكبر بعد الإصابة بالمقارنة مع أنواع الخلايا الأخرى. لذلك، للخلايا البطانية الدماغ، الخلايا cEND خاصة، أكبر كمية من الإصابة تمتد اللازمة لإنتاج على درجة عالية من الاصابة. يمكن للمرء تحقيق الدرجة المطلوبة من الإصابة من خلال تطبيق ضغط المقابلة مبين في الجدول 1. لخلايا cEND، ومع ذلك، ويفضل إصابة شديدة بسبب مقاومتهم للتوتر. أظهرت فحوصات أجريت LDHكما أن درجة زيادات تمتد، ويفرز أكثر LDH في طاف. في المقابل، فإن الخلايا التي أعطيت كمية قليلة من الإصابة تمتد أنتجت LDH في مبلغ مماثل للسيطرة على الخلايا. كما ورد في البروتوكول، يجب على المرء الحرص على أن يتم استخدام كمية مناسبة من المتوسط ​​منذ زيادة أو نقصان في كمية متوسطة قد يؤدي إلى اختلافات في الضغط الذروة تطبيقها على الآبار. على سبيل المثال، تحتوي كذلك 5 مل من السوائل يسجل ذروة الضغط في المتوسط ​​من 4.0 رطل بينما بئر فارغة يسجل بمتوسط ​​3.8 رطل عندما يتم تطبيق الضغط 45 رطل لكل بوصة مربعة. لذا، فمن الأفضل لدفع الزناد عدة مرات على مدى التحكم بشكل جيد للتأكد من أن الضغط الذروة التي سيتم إنشاء يتوافق مع المبلغ المطلوب. في تجاربنا استخدمنا الجدوى وصمة عار لتحديد تأثير تمتد إلى نفاذية غشاء الخلية. البصريات من لوحات ثقافة مرنة ذات قاع كنا تمكننا من السادسEW الخلايا الملون مباشرة تحت المجهر. ومع ذلك، عندما يريد أحد لإجراء دراسات immunolabelling مباشرة بعد تمتد الإصابة، قد تنشأ صعوبات. أولا، قد يكون حجم وسمك لوحة تمثل مشكلة مع بعض منصات العرض المجهر. ثانيا، قد البصريات من غشاء مرن من البئر يكون عائقا لمسح المشاهدة. على الرغم من القيود المذكورة آنفا، ومع ذلك، فإن الإجراء الموضح يمكن استخدامها كنموذج للفي المختبر إصابة الميكانيكية للBBB. إصابات في الدماغ (TBI) ينطوي على عنصرين، وهما نقص تروية والصدمة. يمكن أن يحدث نقص التروية واصابة الثانوية بعد TBI في الحالات عندما يكون هناك فقدان الدم الخطيرة الناتجة في انخفاض ضغط الدم أو نتيجة لتورم الدماغ تقييد امدادات الاوكسجين الى الدماغ. وتعتبر على أنها تأخر، والضرر غير آلي تمثل العمليات المرضية متتالية بدأت في لحظة إصابة 25. حدوث نقص الأكسجة علىأي fter حادة إصابات في الدماغ هو 26 مشترك. الحرمان الجلوكوز الأكسجين (OGD) هو الأسلوب المستخدمة حاليا إلى نموذج نقص التروية في المختبر. وبالتالي، إخضاع الخلايا لOGD بمثابة إهانة الثانوية إلى الخلايا بعد امتداد يمكن أن تحاكي وقوع TBI يليه نقص التروية. وبالتالي، لتحسين موقعنا الحالي في نموذج المختبر من TBI ونمط ذلك في أقرب وقت ممكن إلى TBI الفعلية كما يحدث في الجسم الحي، في المستقبل سوف تستخدم أيضا OGD في تركيبة مع إصابة التمدد.

إصابات في الدماغ (TBI) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. تتأثر حوالي 10 مليون شخص سنويا من قبل المصرف التجاري العراقي مما يجعلها صحية كبيرة ومشكلة طبية 1. ونتيجة لهذا، ومختلف في الجسم الحي ونماذج في المختبر من TBI وأنشئت وتطورت لدراسة آلياتها 2،3،4. فهم أفضل من TBI يمكن أن تساعد على تحسين علاج المريض وتقلل من الوفيات المرتبطة بها، اعتلال، والتكلفة. نماذج كثيرة لإصابات الدماغ التي تستخدم على حد سواء في والمجراة في المختبر أساليب الوجود. في النماذج الحية يمكن أن تحاكي الحدث الفعلي من إصابة في الرأس. ومع ذلك، ونظرا لتعقيد الوضع في الجسم الحي، وسهولة الوصول إلى الأنسجة من الاهتمام ويصبح محدودا 2. في فهم الاستجابة الفسيولوجية من الخلايا الفردية نتيجة للإصابة وقعت، فمن المهم أن يتم عزل الخلايا من التأثيرات الشاملة التيقد تمنع أو تغيير استجابتهم الفردية 5. لهذا السبب، ونماذج الخلوية من الصدمة توفر مزايا قيمة على النماذج الحيوانية منذ البيئة الميكانيكية للخلايا يمكن تسيطر على وجه التحديد 6. في أنظمة المختبر التي توظف استخدام حمولة الميكانيكية إلى الخلايا أو الأنسجة لتحديد التعديلات التي تسببها مثل هذه الطريقة من الإصابة وقد وضعت. على سبيل المثال، تم تأسيس طريقة لدراسة تأثير الإصابة الميكانيكية إلى الخلايا النجمية ل، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية والخلايا البطانية الأبهر 7،8،9. في المختبر نموذج الصدمة التي أنشئت لدراسة القوارض والقابلية للتفاعل نجمية الإنسان 10 يعمل جهاز التحكم في ضغط متطابقة إلى ما نستخدمه لنموذجنا. تم تطبيق نفس الأسلوب للحث على الإصابة من خلال تمتد في الدماغ microvessel الخلايا البطانية الماوس (bEnd3) 11 والخلايا العصبية القشرية 12،13 وكذلك، endoth الدماغيخلايا الخنازير الليل من الأطفال حديثي الولادة 14. الجهاز بتشوهات الجزء السفلي من ثقافة جيدا وبالتالي إنتاج الميكانيكية إصابة تمتد 10. أنه يلحق الضرر على الخلايا المستزرعة من تطبيق ضغط الهواء فوق الخلايا. هذا الضغط يمكن أن يصرف الغشاء الذي على الخلايا تنمو، وبالتالي تمتد الخلايا. ويمكن تحقيق درجات مختلفة من التمدد (أي &quot;منخفض&quot; المعتدلة &quot;، أو&quot; خطير &quot;) عن طريق تحديد مدة النبضة الضغط الجوي وكثافة وفقا لذلك. ارتبط هذا الأسلوب من الإصابة التي يسببها تمتد مع الإصابات في الجسم الحي 7. علاوة على ذلك ، وهذه الطريقة من الإصابة يسمح لمراقبة دقيقة من البيئة خارج الخلية ويمكن بسهولة أن تتكرر. على الرغم من أن نهج مماثل قد استخدمت للعديد من أنواع خلايا الدماغ الأخرى بما في ذلك bEnd3، نموذجنا هو مزية من حيث أنه يجعل من استخدام الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الفئران (cEND) التي تم إنشاؤهافي المختبر لدينا. هذا خط الخلية هو نموذج مناسبة تماما من حاجز الدم في الدماغ (BBB). في مزارع الخلايا في المختبر تستخدم كنماذج BBB ينبغي أن تمتلك الخصائص التي تمكنها لتكون بمثابة شاشة النفاذية. أحد المعايير الهامة لفي نموذج الخلية المختبر ليكون مؤشرا من BBB نفاذية هو أنه ينبغي أن تمتلك بنية الخلية من الناحية الفسيولوجية واقعية 15. على الرغم من bEnd3 الخلايا عرض مميز المغزل شكل يشبه الحرشفية في الثقافة 16، أنهم يظهرون سلوكا التخلق غير النظامية في المختبر حيث أنها تشكل تجاويف تشبه الكيس بدلا من تركيبات أنبوبية العادية في الليفين المواد الهلامية 17. وعلاوة على ذلك، عندما تم حقن الخلايا الجنينية في الفئران والأطفال حديثي الولادة، والتي يسببها تزايد بسرعة الأورام المميتة على الفئران الجنينية ولكن ليس في الفئران حديثي الولادة وصغار. وبالتالي اقترح أن العمليات التي تحكم واحد أو أكثر طبيعي البطانية النمو، والهجرة، والتمايز قد تم تعديلها أو eliminatإد في هذا الخط الخلية 18. من ناحية أخرى، تظاهر المورفولوجية والتقييم immunocytochemical من قياسات التدفق البطانية وBBB التعبير علامة، الكهربيولوجي، وparacellular أن لدينا نموذج BBB cEND هو في الواقع نموذج مناسب من BBB 19. يتميز البطانة الدماغ في الجسم الحي من قبل نفاذية ضيق للغاية مع المقاومة الكهربائية عبر البطانية (طير) تتراوح بين 2،000-5،000 Ωcm 2. لدراسات الدماغ خصائص الحاجز الأوعية الدموية الدقيقة لصيدلة، ينبغي النظر التقييد paracellular وضيق من الخلايا. في معظم الدماغ الخلايا البطانية الشعرية (BCEC)، وهذا لا يتم الاحتفاظ باسم خلايا المعرض طير تتراوح 50-100 Ωcm 2 20. وخلد الدماغ البطانية خلية bEnd3 خط يولد القيم طير من لا يزيد عن 60 Ωcm 2 15. في المقابل تمايز الخلايا cEND مع المتوسط ​​تحتوي خفض العرض المصلالقيم طير تتراوح 300-500 Ωcm 2 19،21. حتى الآن، نماذج في المختبر من الإصابة تمتد في مثقف الخلايا البطانية الدماغ النادرة. وبالتالي، نموذج في المختبر لصدمة بسبب الاصابة تمتد باستخدام مثقف الخلايا البطانية الدماغ التي تكون بمثابة نموذج للBBB قد تكون مفيدة. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم نموذج في المختبر يمكن أن تحاكي التأثير الفعلي أن خلايا الدماغ، وتحديدا الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة من BBB، تتلقاه خلال المصرف التجاري العراقي. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو أن كمية من إصابة تطبيقها على خلايا وكذلك بيئة خارج الخلية يمكن السيطرة عليها بسهولة بطريقة دقيقة مما يتيح سهولة استنساخ التجريبية انشاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

ويرجع ذلك إلى ارتفاع معدل الوفيات الحادثة التي نجمت عن إصابات في الدماغ (TBI)، والطرق التي من شأنها أن تمكن واحد لفهم أفضل للآليات الأساسية التي ينطوي عليها ذلك هي مفيدة لتلقي العلاج. هناك على حد سواء في والمجراة في المختبر الأساليب المتاحة لهذا الغرض. في الجسم الحي النماذج يمكن أن تحاكي إصابة في الرأس الفعلي كما يحدث خلال المصرف التجاري العراقي. ومع ذلك، في الجسم الحي تقنيات قد لا يتم استغلالها لدراسات علم وظائف الأعضاء على مستوى الخلية. وبالتالي، في أساليب المختبر هي أكثر فائدة لهذا الغرض نظرا لأنها توفر سهولة الوصول إلى الخلايا والبيئة خارج الخلية للتلاعب. يقدم بروتوكول لدينا نموذج في المختبر من TBI باستخدام الإصابة تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة. فإنه يستخدم الضغوط التي مورست على الخلايا المستزرعة في آبار مرنة القاع. الضغوط التي مورست يمكن بسهولة أن يسيطر ويمكن ان تنتج الاصابة التي تتراوح من منخفضة إلى شديدة. في الفئرانالدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) ولدت في المختبر لدينا هو نموذج مناسبة تماما للحاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​وبالتالي توفير ميزة لغيرها من النظم التي تستخدم تقنية مماثلة. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا لبساطة الأسلوب، يتم تكرار بسهولة التجريبية مجموعة عمليات. وهكذا، وهذا النموذج يمكن استخدامه في دراسة الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في المصرف التجاري العراقي في BBB.

الخلايا المستزرعة على الكولاجين أنا precoated 6 جيدا مرنة لوحات ثقافة القاع (57.75 سم 2) تعرضوا لدرجات مختلفة من الإصابة تمتد باستخدام جهاز نقالة الخلية. بعد إخضاع الخلايا للإصابة، وكانوا فحصها تحت المجهر لآثار الإصابات التي يسببها تمتد إلى مورفولوجيا الخلايا. ولوحظ أن درجة أكبر من امتداد كما تم تطبيقها على الخلايا ويمكن أيضا أن يلاحظ وجود درجة أكبر من تشويه الخلية (الشكل 1). كما هو مبين في الشكل 1A، خلايا السيطرة التي لم تتعرض للإصابة تظهر بشكل منتظم على شكل الخلايا البطانية الوعائية (cEND) دون أي إشارة من تورم الخلية أو تشويه. عندما تم تطبيق الإصابة تمتد (أرقام 1B-D)، ويمكن ملاحظة التشوه تحت المجهر الخفيفة. بعد تمتد الخلايا بشدة مع الضغط الذروة بين 3.5-4.5 رطل، ظهرت الخلايا cEND تراجع بشكل ملحوظ، وتورم ومشوه مع لا<html> المسافات بين الخلايا قادرة. وبالإضافة إلى ذلك، زادت أيضا من امتصاص الجدوى وصمة عار (100 نانومتر تركيز النهائي) كما تمت زيادة درجة الإصابة تمتد (الشكل 2). الجدوى وصمة عار المستخدمة هي impermeant صبغ الخلايا السليمة إلى أن يصبح نفيذ عندما يتم اختراق غشاء البلازما سلامة الخلايا. تم استبعاد الصبغة من معظم الخلايا السيطرة، وبالتالي، كانت ملطخة فقط عدد قليل من الخلايا (الشكل 2A) بالمقارنة مع الخلايا امتدت (أرقام 2B-D). المزيد من الخلايا fluoresced الأخضر مع درجة التعرض للإصابات التمدد. كعلامة البيوكيميائية للإصابة، وإطلاق سراح من نازعة اكتات (LDH) تم فحص انزيم أيضا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. يظهر الشكل رقم 3 أن زيادة الخلية تمتد الإصابة تسبب زيادة الإفراج LDH. 928/50928fig1.jpg &quot;العرض =&quot; 500px &quot;/&gt; الشكل 1. ضوء الفحص المجهري للخلايا طبيعية مقابل الجرحى. (A) عادي غير المتمدد أحادي الطبقة الخلية متكدسة معبأة istightly وممدود. عندما تم امتدت الخلايا عن طريق تطبيق الضغط نبض ذروة 1.8-2.0 رطل (أي امتداد منخفض) تظهر أقل المدمجة، ومساحات يتبين من السهام (B). عندما الخلايا أصيب باعتدال مع 2.5-3.0 ذروة الضغط والنبض، وبعض منهم ظهرت منتفخة ومشوهة (C). الخلايا تصبح تراجع مع امتداد شديدة من 3.5-4.5 رطل، كما يشير إليه السهم (D). التكبير 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> الشكل 2. فلورescence الفحص المجهري للخلايا الطبيعية مقابل إصابة الخلايا تعامل مع بقاء 2HR وصمة عار بعد إصابة A: خلايا غير المتمدد السيطرة دينار بحريني: خلايا امتدت (B - منخفض، C - معتدل، D - شديد).. التكبير 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> الشكل (3). وقد تم قياس اللاكتات نازعة (LDH) الافراج الانزيم في طاف بعد إصابة التمدد. LDH تطلق في مستنبت على فترات زمنية مختلفة تمتد بعد الإصابة التي يسببها. وأعرب عن LDH كنسبة مئوية من إجمالي LDH نشره (LDH في وسائل الإعلام بالإضافة إلى الخلايا). القيم هي ± SEM. ن عن كل نقطة زمنية هي 5، باستثناء ساعة 0 Value يتعرض إلى تمدد شديد حيث n = 3. لم الإفراج LDH من الخلايا التي تعرضت لتمتد منخفضة ومعتدلة لا تختلف كثيرا عن تلك الضوابط غير المتمدد وعن بعضها البعض. الخلايا التي تم امتدت بشدة الإفراج عن مبلغ أكبر بكثير من LDH بالمقارنة مع جميع العينات الأخرى، باستثناء عينة امتدت معتدلة في 1 ساعة. (P &lt;0.05، عامل واحد ANOVA، طريقة هولم-Sidak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . الجدول 1. توجيه لتوليد درجات مختلفة من إصابات التمدد. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> منظم ضغط </th><th> الضغط الذروة </th><th> درجة الإصابة </th></tr><tr><td> 15 PSI </td><td> 1.2-1.5 رطل </td><td> &lt;منخفض </td></tr><tr><td> 20-25 PSI </td><td> 1.8-2.0 رطل </td><td> منخفض </td></tr><tr><td> 30-35 PSI </td><td> 2.5-3.0 رطل </td><td> معتدل </tد&gt; </tr><tr><td> 40-50 PSI </td><td> 3.5-4.5 رطل </td><td> حاد </td></tr><tr><td> 60 PSI </td><td> 4،8-6،0 رطل </td><td> &gt; الشديدة </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

في المختبر يتم تطوير نماذج الصدمة إصابات الدماغ إلى إنتاج في الجسم الحي تشوه الدماغ. واستخدمت الإصابة تمتد الناجم عن الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الأبهر، والخلايا البطانية الدماغ. ومع ذلك، يستخدم نظامنا حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​النموذج الذي يمتلك خصائص تشكل نموذجا المشروعة للBBB إلى إنشاء نموذج في المختبر TBI.

تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه<em&gt; في المختبر</em&gt; صدمة إصابات الدماغ نموذج من حاجز الدم في الدماغ

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K Views.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  في المختبر يتم تطوير نماذج الصدمة إصابات الدماغ إلى إنتاج في الجسم الحي تشوه الدماغ. واستخدمت الإصابة تمتد الناجم عن الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الأبهر، والخلايا البطانية الدماغ. ومع ذلك، يستخدم نظامنا ح?...

Video: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

التصوير بالرنين المغناطيسي موجهة تعطيل حاجز الدم في الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة عبر الجمجمة في نموذج الفئران

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

للسماح المستهدفة نموذج الفئران من تعطيل حاجز الدم في الدماغ التداوي عائي عصبي

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

وضع ما يصل إلى<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الفئران حاجز الدم في الدماغ (BBB): التركيز على BBB عدم النفاذ والنقل مستقبلات بوساطة

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

تسيطر الموديل أثر القشرية لإصابات الدماغ الرضية

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

نموذج رواية خفيفة إصابات الدماغ للالجرذان الأحداث

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

الأوكسجين الجلوكوز الحرمان وعودة التأكسج باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; الإسكيمية-ضخه من الإصابات نموذج لدراسة الدم في الدماغ الحاجز الجنسي لدى الرجال

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between experimental animals. Several contusive SCI models have been developed to produce injuries using different mechanisms. The severity of the SCI is based on the height that a given weight is dropped, the injury force, or the spinal cord displacement. In the current study, we introduce a novel mouse contusive SCI device, the Louisville Injury System Apparatus (LISA) impactor, which can create a displacement-based SCI with high injury velocity and accuracy. This system utilizes laser distance sensors combined with advanced software to produce graded and highly-reproducible injuries. We performed a contusive SCI at the 10th thoracic vertebral (T10) level in mice to demonstrate the step-by-step procedure. The model can also be applied to the cervical and lumbar spinal levels.

We introduce a tissue displacement-based contusive spinal cord injury model that can produce a consistent contusive spinal cord injury in adult mice.

A النزوح القائم على النزوح النخاع الشوكي نموذج إصابة في الفئران

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

A نموذج الفأر من إصابات الدماغ الصدمة خفيفة ومتكررة خفيفة

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...