מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG, גרמנית Research Foundation) תחת מספר מענק FO 315/4- ותכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופית (FP7/2007-2013) על פי הסכם גרנט מס בריאות F2-2009-241,778 ל CF.

1. זריעה של תאי האנדותל לתוך צלחות גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפח את תאי אנדותל כלי הדם במוח עכבריים (cEND) בבקבוק התרבות T75, שינוי המדיום (DMEM המכיל 10% FCS, 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) פעמיים בשבוע, עד שיגיע למפגש. (לדור וההנצחה של תאי אנדותל כלי הדם במוח, אנא עיין Burek et al, 2012;. פורסטר ואח&#39;, 2005 21,19.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS). הסר את PBS וtrypsinize את התאים עם פתרון טריפסין-EDTA חם 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד ששכבת התאים מפוזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מיליליטר מדיום התרבות לתוך התאים. הקש בקבוק מספר פעמים לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק מוחלט מבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני פיפטה עם תאים מנותקים למעלה ולמטה. מערבולת את הבקבוק כדי לערבב suspensi התאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 μl של ההשעיה התא, הכניס לתוך hemocytometer ולספור את מספר התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את צפיפות תאי זרע ו20,000 תאים / 2 ס&quot;מ לתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך collagen1 precoated תרבות צלחות 6 גם גמישה בעל תחתית (57.75 ס&quot;מ 2) בהיקף כולל של 3 מ&quot;ל / היטב. לכל אחד יש גם שטח של 9.62 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שמחוברות אחת. לשנות את התרבות בינוני פעמיים בשבוע. </li></ol> 2. התמיינות תאים לפני הפגיעה הנגרמת על מתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את התרבות בינונית של התאים עם מדיום התמיינות (DMEM המכיל 1% סרום-הפשיטו עגל בסרום עוברי (ssFCS), 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li></ol> 3. פגיעה הנגרמת על מתיחה של תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התקן בקר פציעת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את העיכוב עד 50 אלפיות שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לחץ הרגולטור ל -15 PSI ולחץ על ההדק כמה פעמים, עד שלחץ השיא הרשום הופך להיות יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לחץ הרגולטור לערך הרצוי. השתמש בטבלת מס &#39;1 כמדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת התרבות גמישה בעל תחתית 6 היטב (57.75 ס&quot;מ 2) למחזיק המגש. ודא כי הבורר גם מוגדר היטב בגודל הנכון (כלומר גם גדול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תקע מתאם חוזקה מעל הבאר. החזק את התקע בחוזקה למקומו ביד אחת ואילו השני דוחפת את היד על ההדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את שיא הלחץ שנוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לשים את הצלחת בחזרה לתוך 37 ° C חממת האורך הרצוי של זמן או להשתמש באופן מיידי להצלחת ניסויים או הערכה. </li></ol> 4. הערכה של פגיעה למתוח על ידי assay ספיג דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר שהתאים היו strחרוט (שלב 3.7), להוסיף 30 μl של פתרון 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל של כדאיות כתם שפועל כסמן cytotoxicity (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד) למדיום הסלולרי התרבות (הערה: 10 μl של הפתרון לצבוע הוא לשמש עבור כל מ&quot;ל של מדיום תרבות תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם התוספת של הצבע לתאים, להציג באופן מיידי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 5. הערכה של פגיעה על ידי מתיחת קטט דהידרוגנאז (LDH) שחרור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר מתיחת התאים (שלב 3.7), להסיר 200 μl של מדיום תרבית תאים מהבאר. לעשות את אותו הדבר עבור כל נקודת זמן שלאחר פציעה שאתה רוצה לכלול בחקירה של LDH שחרור שלך (כלומר, לדוגמה: 30 דקות, שעה 1, 2 שעות, וכו &#39;.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תרבית תאים בינוניות בהגדרה הגבוהה ביותר של microcentrifuge במשך 5 דקות כדי להסיר כל פסולת תא. הסר את supernatant ולהשתמש בזה לשלבים שאחריו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאתה hשד &#39;סיים שלב 5.1 ולקח את הדגימות הדרושות שאתה רוצה יש לי מהנקודות הזמן השונות שהיית רוצה לחקור, lyse התאים באמצעות פתרון תמוגה הכלול בערכת LDH assay (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 100 μl של מדיום assay נכלל בassay kitto כל גם צלחת 96 בארות המסופקת בערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 100 μl של מדיום תרבית התאים ללא תא לשתי בארות מקבילות של צלחת 96-בארות כלולות בערכת assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה ב 492 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+traumatic+brain+injury.">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li><li>Morrison, B., Elkin, B., Doll&#233;, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury.">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li><li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alterations+in+[Ca2+]i+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia:+an+in+vitro+model+for+neural+trauma.">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li><li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma.">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li><li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture:+characterization+of+the+model+using+astrocytes.">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li><li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal,+glial+and+endothelia+cells+(Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase.">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth.">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li><li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity.">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li><li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+voltage-dependent+Mg2++blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons.">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li><li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury.">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li><li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li><li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells:+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta.">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li><li>F&#246;rster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li><li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier.">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li><li>Burek, N. M., Salvador, E., F&#246;rster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li><li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li><li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat:+Part+2:+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins.">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

את ההשפעות של פגיעה מכאנית במבחנה נחקרו ושיטות הוקמו במשך האסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים 8, 9, 22. יש, עם זאת, נכון להיום עדיין לא ידוע במודל במבחנה של פציעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית. מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק 6. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמש כמודל של מחסום דם המוח (BBB), כגון מה מתנות הפרוטוקול שלנו עשויות להיות שימושית. פרוטוקול זה עושה שימוש בתאי cEND, מודל שהוקם BBB במעבדה שלנו. מאז התמוטטות BBB לעתים קרובות תועדה בחולי TBI וTBI קשור לעתים קרובות לשיבוש BBB אשר עלול לגרום להיווצרות בצקת 23, 24, שיטת prèsented כאן עשויים דווקא לשמש בביצוע מחקרי BBB ביחס לTBI. במודל זה, חשוב לטפל בכמה מעלות מפציעת מתיחה מוחלות על התאים. באותה מידה כמו התאים נפצעו בכל מקרה, ועם כל מה כמות הלחץ מוחל, מידת פגיעה שיכול להשפיע על תאי האנדותל שונה בהרבה מאוד מסוגי תאים אחרים. תאי האנדותל אבי העורקים הם עמידים יותר בפני פגיעה מלמתוח האסטרוציטים או תאי גלייה מעורבים 9. בנוסף, הם לתקן במהירות רבה יותר לאחר פציעה בהשוואה לסוגי התאים האחרים. לכן, לתאי מוח, תאי אנדותל במיוחד cEND, כמות גדולה יותר של פציעת מתיחה יש צורך לייצר רמה גבוהה של פציעה. אפשר להשיג את המידה הרצויה של פגיעה על ידי יישום הלחץ המקביל שצוין בטבלת 1. לתאי cEND, לעומת זאת, פגיעה קשה היא מועדפת בשל התנגדותם למתח. מבחני שנערכו הראו LDHשככל שהמידה של עליות מתיחה, יותר LDH מופרש לתוך הנוזל העליון. לעומת זאת, בתאים שקבלו כמות נמוכה של פציעת מתיחה הופקו LDH בסכום דומה כדי לשלוט בתאים. כפי שצוין בפרוטוקול, יש לדאוג שהכמות המתאימה של מדיום משמשת מאז עלייה או ירידה בכמות בינונית עלולה לגרום להבדלים בלחץ השיא להחיל את הבארות. לדוגמה, המכיל 5 מ&quot;ל גם של נוזל רושם שיא בלחץ הממוצע של 4.0 PSI ואילו גם ריק רושם ממוצע של 3.8 PSI כאשר לחץ psi 45 מוחל. לכן, הדרך הטובה ביותר הוא לדחוף את ההדק מספר פעמים על שליטה גם על מנת להבטיח כי לחץ השיא שיופק מתאים לכמות הרצויה. בניסויים שלנו השתמשנו כדאיות כתם כדי לקבוע את האפקט של מתיחה לחדירות של קרום התא. אופטיקה של צלחות התרבות גמישות התחתיות ששמשנו אותנו מאפשרת לנו VIEW התאים המוכתמים ישירות מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, כשרוצים לבצע מחקרי immunolabelling ישירות לאחר המתיחה פציעה, עלולים להתעורר קשיים. ראשית, בגודל ובעובי של הצלחת עלול להוות בעיה עם כמה פלטפורמות צפייה מיקרוסקופ. שנית, אופטיקה של הקרום גמיש של גם עשויה להיות מכשול כדי לנקות צפייה. למרות המגבלות הנ&quot;ל, לעומת זאת, הליך המתואר יכול לשמש כמודל לפגיעה מכאנית במבחנה של BBB. פגיעה מוחית טראומטית (TBI) כוללת שני רכיבים, כלומר, איסכמיה וטראומה. איסכמיה יכולה להתרחש כפגיעה משנית בעקבות TBI במקרים שבם יש אובדן דם חמור וכתוצאה מכך לחץ דם נמוך או כתוצאה מנפיחות במוח המגביל את אספקת חמצן למוח. זה נחשב נזק מושהה, nonmechanical מייצג תהליכים פתולוגיים ברציפות ביוזמת ברגע של פציעה 25. המופע של היפוקסיהפגיעה מוחית טראומטית חמורה חרו נפוצה 26. קיפוח גלוקוז חמצן (OGD) הוא השיטה כרגע בשימוש לאיסכמיה מודל במבחנה. לפיכך, חשיפת תאים לOGD כעלבון משנית לתאים לאחר מתיחה יכולה לחקות את השכיחות של TBI אחרי איסכמיה. לפיכך, כדי לשפר את המודל הנוכחי שלנו במבחנה של TBI ודפוס זה קרוב ככל האפשר לTBI בפועל כפי שהוא מתרחש in vivo, בעתיד אנחנו גם יעסיקו OGD בשילוב עם פציעת מתיחה.

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא אחד הגורמים המובילים למוות בעולם. כ -10 מיליון בני אדם מושפעים מדי שנה על ידי שהופך אותו TBI בריאותי משמעותי והבעיה רפואית 1. בשל כך, שונים in vivo ו במודלים חוץ גופית של TBI כבר הוקם ופותח על מנת ללמוד מנגנוניה 2,3,4. הבנה טובה יותר של TBI יכולה לעזור לשפר את הטיפול בחולה ולהפחית את התמותה המשויכת, תחלואה, ועלות. מודלים רבים לפגיעה מוחית אשר מנצלים גם in vivo ו במבחנת שיטות קיימים. במודלי vivo יכול לחקות את האירוע הממשי של פגיעת הראש. עם זאת, בשל מורכבותו של מצב vivo, נגישות לרקמות של עניין הופך להיות מוגבל 2. בהבנה את התגובה הפיזיולוגית של תאים בודדים, כתוצאה מפגיעה שנגרמה, חשוב שהתאים מבודדים מההשפעות המערכתיות אשרעלול לעכב או לשנות את תגובת 5 פרט. מסיבה זו, מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק 6. במערכות מבחנה שמעסיקות את השימוש של עומס מכאני לתאים או רקמות כדי לקבוע שינויים הנגרמים על ידי שיטה כזו של פגיעה פותחו. לדוגמה, שיטה ללימוד ההשפעה של פגיעה מכאנית לתאים כבר נקבעה להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים 7,8,9. במודל טראומת מבחנה שהוקם לחקר מכרסמים ותגובתיות astrocyte אנושי 10 הועסקה מכשיר שליטה בלחץ זהה למה שאנו משתמשים למודל שלנו. אותה השיטה יושמה כדי לגרום ניזק ע&quot;י מתיחה בתאי עכבר מוח microvessel אנדותל (bEnd3) 11 ו נוירונים בקליפת המוח 12,13 וכן, endoth מוחיןתאי elial מחזירונים יילוד 14. מכשיר deforms התחתון של התרבות היטב וכך לייצר מתיחת פגיעה מכאנית 10. היא גורמת פגיעה על תאים בתרבית על ידי היישום של לחץ אוויר מעל לתאים. לחץ זה יכול להסיט את הקרום שעליו התאים גדלים, ובכך מותח את התאים. דרגות שונות של מתיחה (כלומר &quot;נמוך,&quot; מתון &quot;, או&quot; חמור &quot;) יכולות להיות מושגת על ידי קביעת משך דופק לחץ האוויר ועצמת בהתאם. שיטה זו של פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר בקורלציה עם פגיעה טראומטית בvivo 7. יתר על כן , שיטה זו של פציעה מאפשרת שליטה המדויקת של הסביבה תאית והוא יכול בקלות להיות מועתק. למרות שגישה דומה הייתה בשימוש כבר הרבה סוגי תאים אחרים במוח כולל bEnd3, המודל שלנו הוא של יתרון בכך שהוא עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבריים (cEND) שנוצרובמעבדה שלנו. קו זה תא הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB). בתרביות תאים במבחנה המשמשות כמודלים BBB צריך להחזיק מאפיינים שיאפשר להם לשמש כמסך חדירות. קריטריון חשוב אחד במודל תאים במבחנה להיות מנבא של חדירות BBB הוא שזה צריך להחזיק ארכיטקטורת תא פיזיולוגית מציאותית 15. למרות bEnd3 תאים ייחודיים להציג ציר דמוי קשקש מורפולוגיה בתרבות 16, הם מפגינים התנהגות המוךפו&quot;גנטי סדירה במבחנה שבו הם יוצרים חללים דמויי ציסטה ולא את המבנים צינורי הרגילים בפיברין ג&#39;לי 17. יתר על כן, כאשר התאים הוזרקו לעכברים עובריים ואת הרך הנולד, הם מושרה במהירות צמיחה גידולים קטלניים לעכברים עובריים, אך לא בעכברי בני יומם וצעירים. הוא הציע ובכך שאחד או יותר מתהליכים המסדירים את צמיחה נורמלית, הגירה, ובידול האנדותל שונו או eliminatאד בקו תא זה 18. מצד השני, הערכה מורפולוגית, immunocytochemical של מדידות שטף האנדותל וביטוי סמן BBB, bioelectric, ולהוכיח כי paracellular BBB המודל cEND שלנו היא אכן מודל מתאים של BBB 19. האנדותל מוח in vivo מאופיין בחדירות הדוקות ביותר עם ​​התנגדות חשמלית טרנס אנדותל (TEER) נעה בין 2,000-5,000 Ωcm 2. ללימודים של נכסי מכשול microvasculature מוח לתרופות, יש לשקול מגבילי paracellular ואטימות של התאים. ברוב תאי אנדותל נימי במוח (BCEC), זה לא נשמר כTEER תערוכת התאים הנע 50-100 Ωcm 2 20. BEnd3 שורת תאי אנדותל המוח הונצח מייצר ערכי TEER של לא יותר מ -60 Ωcm 2 15. בניגוד התמיינות של תאי cEND עם מדיום המכיל סרום מופחת תצוגהערכים הנעים TEER 300-500 Ωcm 2 19,21. עד כה, במודלים חוץ גופית של פגיעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית הם נדירים. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמשים כמודל של BBB עשוי להיות שימושית. בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל במבחנה שיכול לחקות את ההשפעה בפועל שתאי מוח, תאי אנדותל כלי הדם במוח במיוחד של BBB, מקבלים במהלך TBI. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהסכום של פגיעה מוחל על התאים, כמו גם ניתן לשלוט בקלות בסביבה תאית באופן מדויק המאפשר שחזור קל של ניסיוני ההגדרה.

<table><tbody><tr><td>Cell Injury Controller II</td><td>Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td><td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td><td>BF - 3001C</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>Storage: &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MEM Vitamin</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>Storage: &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Non-essential amino acids (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>Storage at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>Storage: &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td><td>Life Technologies</td><td>12676-011</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>PAA Laboratories</td><td>L11-004</td><td>Storage: &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Image-iT DEAD Green</td><td>Life Technologies</td><td>I10291</td><td>Storage: &amp;le; -15 &amp;deg;C, protected from light</td></tr><tr><td>Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td>Storage: &amp;le; -15 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

עקב אירוע התמותה הגבוהה הביא על ידי פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שיטות שתאפשר אחד כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מעורבים בזה הם שימושיים לטיפול. ישנן גם in vivo ו במבחנת שיטות זמינות למטרה זו. במודלי vivo יכולים לחקות פגיעת ראש בפועל כפי שהוא מתרחש במהלך TBI. עם זאת, בטכניקות vivo לא יכול להיות מנוצל ללימודים ברמת הפיסיולוגיה התא. לפיכך, בשיטות מבחנה הם יתרון נוסף למטרה זו מכיוון שהם מספקים גישה קלה יותר לתאים והסביבה תאית למניפולציה. הפרוטוקול שלנו מציג במודל חוץ גופית של פציעת מתיחה באמצעות TBI בתאי אנדותל כלי הדם במוח. הוא מנצל את לחץ המופעל על התאים בתרבית בבארות גמישות תחתיות. הלחץ המופעל יכול בקלות להיות בשליטה ויכול לייצר פגיעה שנעה בין נמוך לחמורים. העכבריתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) שנוצרו במעבדה שלנו הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB) ​​ובכך מתן יתרון למערכות אחרות המעסיקות בטכניקה דומה. בנוסף, בשל הפשטות של השיטה, משוכפלים להגדיר קופצים ניסיוני בקלות. לכן, מודל זה יכול לשמש בחקר המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בTBI בBBB.

תאים בתרבית על קולגן אני precoated תרבות צלחות תחתיות 6 גם גמישות (57.75 ס&quot;מ 2) נחשפו לדרגות שונות של פציעת מתיחה באמצעות המכשיר הסלולרי של האלונקה. לאחר חשיפת התאים לפגיעה, הם נבדקו תחת המיקרוסקופ לתופעות של פגיעה הנגרמת מתיחה למורפולוגיה של תאים. זה היה ציין כי מידה כמו גדולה יותר של קטע הייתה מוחלת על התאים במידה רבה יותר של עיוות תא גם יכולה להיבחן (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 1 א, תאי בקרה שלא היו נתונים לפגיעה מופיעים תאי אנדותל כלי דם במוח כצורה באופן קבוע (cEND) ללא כל אינדיקציה לנפיחות תא או עיוות. כאשר פציעת מתיחה יושמה (איורים 1 ב-D), עיוות יכולה להיבחן תחת מיקרוסקופ האור. לאחר מתיחת התאים קשה עם לחץ שיא בין 3.5-4.5 PSI, תאי cEND הופיעו חזר בו במידה ניכרת, נפוח ומעוות עם לא<html> מרחבים אינטר מסוגלים. בנוסף, ספיגה של כדאיות כתם (ריכוז 100 ננומטר סופי) עלתה גם היא כמידת פגיעת מתיחה הוגדלה (איור 2). הכדאיות בשימוש הוא כתם צבע impermeant לתאים בריאים שהופך permeant כאשר שלמות קרום הפלזמה של תאים נפגעת. הצבע לא נכלל רוב תאי הבקרה, ולכן, רק מעטים מהתאים היו מוכתמים (איור 2 א), בהשוואה לתאים מתוחים (איורים 2 ב-D). יותר תאים fluoresced ירוקים עם מידה מוגברת של פגיעה במתיחה. כסמן ביוכימי של פגיעה, שחרורו של קטט דהידרוגנאז (LDH) אנזים נבחן גם על פי הוראות יצרן. איור 3 מראה כי פציעת מתיחת תא הגדלת נגרמה שחרור הגדלת LDH. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; איור 1. בחינת אור מיקרוסקופית של תאים נורמלים לעומת פצועים. () monolayer תא מחוברות unstretched רגילה ארזה istightly והמוארכת. כאשר תאים נמתחו על ידי יישום לחץ דופק שיא של 1.8-2.0 PSI (מתיחה נמוכה, כלומר) הם מופיעים פחות קומפקטי, מרחבים מסומנים על ידי חצים (ב &#39;). כאשר התאים שנפצעו באורח בינוני עם דופק שיא לחץ 2.5-3.0, חלקם הופיעו נפוח ומעוות (C). התאים הופכים חזרו עם מתיחה חמורה של 3.5-4.5 psi, כפי שצוין על ידי חץ (ד &#39;). ההגדלה 100x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. פלואורידבדיקה מיקרוסקופית של escence תאים נורמלים לעומת תאים פגועים טופלו 2hr כתם כדאיות לאחר פציעה: תאי בקרת unstretched BD: תאים מתוחים (B - נמוך, C - מתון, D - חמור).... ההגדלה 100x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. שחרור חומצת החלב דהידרוגנז LDH () אנזים לsupernatant לאחר פציעת מתיחה. LDH משתחררים למדיום התרבות נמדד במרווחי זמן שונים לאחר פגיעה הנגרמת מתיחה. LDH בא לידי ביטוי כאחוז מסך releasable LDH LDH (בתקשורת בתוספת תאים). ערכים הם ± SEM. N עבור כל נקודת זמן הוא 5, פרט ל0 HR Value נתון למתיחה חמורה כאשר n = 3. שחרור LDH מהתאים שהיו נתונים למתיחה נמוכה ובינונית לא היה שונה באופן משמעותי מזו של פקדי unstretched ואחד מהשני. תאים שנמתחו קשות שחררו כמות גדולה יותר באופן משמעותי של LDH בהשוואה לכל דוגמאות אחרות, למעט המדגם נמתח במתינות בשעה 1. (P &lt;0.05, גורם אחד ניתוח שונה, שיטה הולם-Sidak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> טבלת מס &#39;1. מדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> לחץ רגולטור </th><th> לחץ שיא </th><th> מידת הפגיעה </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1.2-1.5 PSI </td><td> &lt;נמוך </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1.8-2.0 PSI </td><td> נמוך </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2.5-3.0 PSI </td><td> למתן </tד&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3.5-4.5 PSI </td><td> חמור </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4.8-6.0 PSI </td><td> &gt; חמור </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) ​​דגם בעל תכונות שמהוות מודל לגיטימי של BBB להקים במודל TBI מבחנה.

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K Views.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) ​​דגם בעל תכונ...

Video: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengineering

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Neuroscience

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is characterized by an interruption in blood supply to the brain leading to cell death and cognitive dysfunction. During and after ischemic stroke, blood-brain barrier (BBB) dysfunction facilitates injury progression and contributes to poor patient recovery. Current BBB models primarily include endothelial monocultures and double co-cultures with either astrocytes or pericytes.
Such models lack the ability to fully imitate a dynamic brain microenvironment, which is essential for cell-to-cell communication. Additionally, commonly used BBB models often contain immortalized human endothelial cells or animal-derived (rodent, porcine, or bovine) cell cultures that pose translational limitations. This paper describes a novel well-insert-based BBB model containing only primary human cells (brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and brain vascular pericytes) enabling the investigation of ischemic brain injury in vitro. 
The effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on barrier integrity were assessed by passive permeability, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements,and direct visualization of hypoxic cells. The presented protocol offers a distinct advantage inmimicking the intercellular environment of the BBB in vivo, serving as a more realistic in vitro BBB model for developing new therapeutic strategies in the setting of ischemic brain injury.

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Here, we describe the method for establishing a triple cell culture model of the blood-brain barrier based on primary human brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. This multicellular model is suitable for studies of neurovascular unit dysfunction during ischemic stroke in vitro or for the screening of drug candidates.

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Biochemistry

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunology and Infection

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

מודל מחסום דם-מוח תלת-ממדי המופק מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

מחבר זרקור: גישה מותאמת אישית לחקר מחלת אלצהיימר באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות