Esta pesquisa foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa), sob número de concessão FO 315/4- e sob acordo Grant No. SAÚDE-F2-2009-241778 para CF.

1. Semeadura de células endoteliais em lamelas <ol><li> Cultivar células endoteliais microvasculares cerebrais de murideo (cEnd) num balão de cultura T75, mudando o meio (DMEM contendo 10% de FCS, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina), duas vezes por semana, até que seja atingido confluência. (Para a geração e imortalização de cérebro células endoteliais microvasculares, consulte Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.). </li><li> Lavar as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover o PBS e as células com trypsinize ml de solução quente de tripsina-EDTA a 2. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 5 min ou até que a camada de células é disperso. </li><li> Adicionar 8 mL de meio de cultura para as células. Toque o balão várias vezes para separar as células. </li><li> Ver as células ao microscópio para assegurar separação completa da garrafa. </li><li> Meio de pipeta com células isoladas cima e para baixo. Agitar o frasco para misturar o suspensi celulardiante. </li><li> Tomar 20 ul da suspensão celular, colocado em um hemocitómetro e contar o número de células. </li><li> Determinar a densidade da célula e sementes 20000 células / cm 2 para o poço. </li><li> Transferência da suspensão de células em collagen1 pré-revestido de 6 poços de fundo flexível placas de cultura de 57,75 centímetros (2) em um volume total de 3 ml / cavidade. Cada um dos poços tem uma área de 9,62 centímetros 2. </li><li> Crescer as células a 37 ° C durante uma semana até à confluência. Mudar o meio de cultura duas vezes por semana. </li></ol> 2. Diferenciação Celular Antes de lesão por estiramento induzido <ol><li> Alterar o meio de cultura das células com meio de diferenciação (DMEM contendo 1% de soro fetal de vitelo sem soro despojado (ssFCS), 50 U / ml de penicilina / estreptomicina). </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 24 horas. </li></ol> 3. Lesão por estiramento induzida das células endoteliais <ol><li> Ligue o dispositivo controlador de lesão celular. </li><li> Definir o atraso de 50 ms. </li><li> Defina o regulador de pressão para 15 psi e apertar o gatilho algumas vezes até que o pico de pressão registrada torna-se estável. </li><li> Ajuste o regulador de pressão para o valor desejado. Use Tabela 1 como um guia para a geração de diferentes graus de lesão por estiramento. </li><li> Colocar a placa de fundo flexível cultura de 6 poços (57,75 centímetros 2) no suporte do tabuleiro. Certifique-se de que o seletor é bem definido para o tamanho bem correta (ou seja, bem grande). </li><li> Coloque o plugue com firmeza sobre o poço. Segure o plugue firmemente no lugar com uma mão enquanto a outra mão empurra o gatilho. </li><li> Anote o pico de pressão gerada. </li><li> Colocar imediatamente a placa de volta na incubadora de 37 ° C para o período de tempo desejado ou utilizar imediatamente para experiências ou avaliação seguinte. </li></ol> 4. Avaliação da lesão por estiramento por Dye Ensaio Captação <ol><li> Imediatamente após as células foram strgravada (passo 3.7), adicionar 30 ul de um mg / ml de solução da viabilidade mancha 1, que actua como um marcador de citotoxicidade (ver tabela suplementar de materiais e equipamento) para o meio de cultura celular (Nota: 10 ul da solução de corante é para ser usado para cada mL de meio de cultura celular). </li><li> Após adição do corante para as células, ver imediatamente sob um microscópio de fluorescência. </li></ol> 5. Avaliação da lesão por estiramento de lactato desidrogenase (LDH) de Lançamento <ol><li> Imediatamente após o alongamento das células (passo 3.7), remover 200 mL de meio de cultura de células a partir do poço. Faça o mesmo para cada ponto de tempo pós-lesão que você gostaria de incluir em sua investigação de LDH lançamento (ou seja, por exemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, etc.) </li><li> Centrifuga-se o meio de cultura celular na definição mais elevada de uma microcentrífuga durante 5 minutos para remover quaisquer restos celulares. Remover o sobrenadante e usa isso para as etapas subsequentes. </li><li> Uma vez que você hav terminou passo 5.1 e tomaram as amostras necessárias que você gostaria de ter a partir de diversos pontos de tempo que você gostaria de investigar, lisar as células usando a solução de lise incluído no ensaio kit LDH (por favor, consulte a tabela suplementar de materiais e equipamentos). </li><li> Coloque 100 ml de meio de ensaio incluiu no ensaio kitto cada poço de uma placa de 96 poços fornecidas no kit. </li><li> Coloque 100 ml de meio de cultura celular isento de células em duas cavidades paralelas de uma placa de 96 poços incluídos no kit de ensaio. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Ler a absorvância a 492 nm. </li></ol>

<ol>
	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+traumatic+brain+injury.">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li><li>Morrison, B., Elkin, B., Doll&#233;, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury.">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li><li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alterations+in+[Ca2+]i+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia:+an+in+vitro+model+for+neural+trauma.">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li><li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma.">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li><li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture:+characterization+of+the+model+using+astrocytes.">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li><li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal,+glial+and+endothelia+cells+(Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase.">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth.">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li><li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity.">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li><li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+voltage-dependent+Mg2++blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons.">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li><li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury.">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li><li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li><li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells:+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta.">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li><li>F&#246;rster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li><li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier.">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li><li>Burek, N. M., Salvador, E., F&#246;rster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li><li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li><li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat:+Part+2:+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins.">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os efeitos da lesão mecânica in vitro têm sido estudados e métodos têm sido estabelecido para neurónios, astrócitos, células da glia e células endoteliais da aorta de 8, 9 e 22. Existe, no entanto, até à data ainda não conhecido modelo in vitro de lesão por estiramento em células endoteliais cerebrais em cultura. Modelos celulares de trauma proporcionar consideráveis ​​vantagens em relação aos modelos animais desde o ambiente mecânica das células pode ser controlado com precisão 6. Assim, um modelo in vitro para o trauma devido a lesão estiramento usando células cerebrais endoteliais cultivadas que actuam como modelo da barreira hematoencefálica (BHE), tais como o nosso protocolo presentes podem revelar-se úteis. Este protocolo faz uso de células cEnd, um modelo de certificação estabelecido no nosso laboratório. Uma vez que é frequentemente ruptura da BHE documentada em doentes de TB e TBI está muitas vezes ligada à perturbação da BHE, que pode resultar a formação de edema 23, 24, o método de prestura orientada especificamente aqui pode ser usado na realização de estudos de BBB em relação ao TCE. Neste modelo, é importante tomar cuidado quanto grau de lesão por estiramento é aplicado às células. Na medida em que as células estão lesionados, em qualquer caso, e com qualquer quantidade de pressão é aplicada, o grau de lesão que pode ter impacto na células endoteliais diferem muito consideravelmente a partir de outros tipos de células. As células endoteliais da aorta são mais resistentes à lesão por estiramento do que os astrócitos e células gliais mistas 9. Além disso, eles reparação mais rapidamente após a lesão em comparação com os outros tipos de células. Portanto, para que as células endoteliais do cérebro, particularmente células cEnd, maior quantidade de lesão por estiramento é necessário para produzir um elevado grau de lesão. Pode-se atingir o desejado grau de lesão pela aplicação da pressão correspondente indicado na Tabela 1. Para células cEnd, no entanto, a lesão grave é o preferido devido à sua resistência ao esforço. Os ensaios realizados mostraram LDHenquanto que aumenta o grau de estiramento, mais LDH é secretado para o sobrenadante. Em contraste, as células que foram dadas uma baixa quantidade de lesão por estiramento LDH produzida em uma quantidade semelhante a células de controlo. Como mencionado no protocolo, deve-se tomar cuidado para que a quantidade apropriada de meio é utilizado uma vez que um aumento ou uma diminuição na quantidade de meio pode resultar de diferenças na pressão de pico aplicada aos poços. Por exemplo, um poço que continha 5 ml de líquido regista uma pressão pico na média de 4,0 psi durante um poço vazio regista uma média de 3.8 psi 45 psi de pressão quando é aplicada. Portanto, é melhor para empurrar o gatilho várias vezes ao longo de um poço de controlo para garantir que a pressão de pico que vai ser gerado corresponde ao valor desejado. Nas nossas experiências foi utilizada uma mancha de viabilidade para determinar o efeito de esticar a permeabilidade da membrana celular. A ótica das placas de cultura flexível de fundo que usamos nos permite view as células manchadas diretamente sob o microscópio. No entanto, quando se quer realizar estudos imunomarcação diretamente após estiramento lesão, podem surgir dificuldades. Primeiro, o tamanho e espessura da placa, pode constituir um problema com algumas plataformas de visualização do microscópio. Em segundo lugar, a ótica da membrana flexível do bem pode ser um obstáculo para limpar visualização. Apesar das limitações acima referidas, no entanto, o processo descrito pode ser utilizado como um modelo de lesão mecânica em vitro da BHE. Traumatismo crânio-encefálico (TCE) envolve duas componentes, nomeadamente, isquemia e trauma. A isquemia pode ocorrer como lesão secundária seguindo TBI em casos quando há perda de sangue grave, resultando em diminuição da pressão arterial, ou como resultado do inchaço do cérebro restringindo o suprimento de oxigênio para o cérebro. Considera-se como um dano retardada, não-mecânico representando processos patológicos consecutivas iniciadas no momento do ferimento 25. A ocorrência de uma hipoxiaepois de grave lesão cerebral traumática é comum 26. Oxigénio privação de glicose (OGD) é o método actualmente usado para modelo de isquemia in vitro. Assim, as células a sujeitar POG como um insulto secundário às células após estiramento pode imitar a incidência de TCE seguido por isquemia. Assim, para melhorar a nossa actual modelo in vitro de TCE e padrão la tanto quanto possível, de forma efectiva, uma vez que o TCE ocorre in vivo, no futuro, também vai empregar POG em combinação com lesão por estiramento.

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Cerca de 10 milhões de pessoas são afectadas anualmente pelo TCE tornando-se um importante problema de saúde e um médico. Devido a isto, vários in vivo e in vitro modelos de TCE foram estabelecidas e desenvolvidas para estudar os mecanismos 2,3,4. Uma melhor compreensão do TCE pode ajudar a melhorar o tratamento do doente e reduzir a mortalidade associada, morbidade e custo. Muitos modelos de lesões cerebrais que utilizam tanto in vivo e in vitro existir. Nos modelos in vivo, pode simular o evento real de traumatismo craniano. No entanto, devido à complexidade da situação in vivo, a acessibilidade do tecido de interesse torna-se limitada 2. No entendimento da resposta fisiológica de células individuais, como resultado da lesão infligida, é importante que as células são isoladas a partir dos quais os efeitos sistémicospodem inibir ou alterar a sua resposta individual 5. Por esta razão, os modelos celulares de trauma proporcionar consideráveis ​​vantagens em relação aos modelos animais desde o ambiente mecânica das células pode ser controlado com precisão 6. Nos sistemas in vitro, que empregam o uso de carga mecânica de células ou tecidos para determinar alterações induzidas por tal método de lesão têm sido desenvolvidos. Por exemplo, foi estabelecido um método para estudar o efeito de danos mecânicos às células para neurónios, astrócitos, células da glia e células endoteliais da aorta de 7,8,9. A no modelo de trauma in vitro estabelecido para o estudo da reactividade dos astrócitos roedor e humano 10 empregue um dispositivo de controlo de pressão idêntica ao que usamos para o nosso modelo. O mesmo método foi aplicado para induzir a lesão através de trecho em cérebro de rato microvasos células endoteliais (bEnd3) 11 e neurônios corticais 12,13, bem como, endoth cerebralcélulas Elial de leitões recém-nascidos O dispositivo 14. deforma a parte inferior do poço de cultura, assim, produzir lesão por estiramento mecânico 10. É inflige danos sobre as células em cultura mediante a aplicação de pressão de ar acima das células. Esta pressão pode desviar a membrana sobre a qual as células estão em crescimento, desse modo esticando as células. Vários graus de estiramento (isto é, &quot;baixos&quot; moderado &quot;ou&quot; grave &quot;) pode ser alcançada ajustando a duração do impulso de pressão de ar e consequentemente a intensidade. Este método de lesão induzida por estiramento tem sido correlacionada com a lesão traumática in vivo 7. Além disso , este método de lesão permite o controle preciso do meio extracelular e pode facilmente ser reproduzida. Embora uma abordagem semelhante tem sido utilizada para muitos outros tipos de células do cérebro, incluindo bEnd3, o nosso modelo é uma vantagem na medida em que faz uso das células endoteliais cerebrais microvasculares murino (cEnd) geradoem nosso laboratório. Esta linha celular é um modelo bem adequada da barreira hematoencefálica (BHE). Nas culturas de células in vitro utilizados como modelos de BBB deve possuir características que lhes permitam servir como tela de permeabilidade. Um critério importante para um modelo de células in vitro para ser um preditor de permeabilidade a certificação é que ela deve possuir arquitetura de células fisiologicamente realista 15. Mesmo que bEnd3 células apresentam distintivo fusiforme morfologia escamosas na cultura 16, eles apresentam comportamento irregular morfogenético in vitro no qual eles formam cavidades quisto-como, em vez de estruturas tubulares regulares em gel de fibrina 17. Além disso, quando as células foram injetadas em camundongos embrionárias e recém-nascidos, eles induziram tumores crescendo rapidamente letais para camundongos embrionárias, mas não em camundongos recém-nascidos e jovens. Deste modo, sugere-se que um ou mais processos que regulam o normal crescimento endotelial, migração, e diferenciação foram alterados ou eliminandoed nesta linha de células 18. Por outro lado, morfológico, a avaliação imunocitoquímica das medidas de fluxo endoteliais e expressão do marcador certificação, bioeléctrico, paracelular e demonstram que o nosso modelo de certificação cEnd é efectivamente um modelo adequado da BHE 19. Endotélio cerebral in vivo, é caracterizada por uma permeabilidade extremamente apertado com resistência eléctrica trans-endotelial (TEER) variando entre 2.000-5.000 Ωcm 2. Para os estudos de propriedades de barreira cérebro microvasculatura para produtos farmacêuticos, restritividade paracellular e aperto das células deve ser considerada. Na maioria das células endoteliais dos capilares cerebrais (BCEC), este não é preservado como células exibem TEER variando 50-100 Ωcm 2 20. O imortalizado cérebro endotelial linha bEnd3 célula gera valores teer não superiores a 60 Ωcm 2 15. Em contraste a diferenciação de células cEnd com meio contendo soro reduzido visorOs valores TEER variando 300-500 Ωcm 2 19,21. Até à data, em modelos in vitro da lesão por estiramento em células endoteliais cultivadas do cérebro são escassos. Assim, um modelo in vitro para o trauma devido a lesão estiramento usando células endoteliais cultivadas cerebrais que actuam como modelo de certificação pode vir a ser útil. Neste protocolo, apresentamos um modelo in vitro, que pode simular o impacto real que as células do cérebro, células endoteliais microvasculares especificamente cerebrais do BBB, recebe durante o TCE. A principal vantagem deste modelo é que a quantidade de lesão aplicada às células, bem como o meio ambiente extracelular podem ser facilmente controlados de uma maneira precisa, permitindo fácil reprodutibilidade da montagem experimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

Devido ao incidente elevada mortalidade provocada por traumatismo crânio-encefálico (TCE), os métodos que nos permitem compreender melhor os mecanismos subjacentes envolvidos nele são úteis para o tratamento. Existem tanto in vivo e in vitro disponíveis para esta finalidade. Modelos in vivo podem imitar traumatismo craniano real, uma vez que ocorre durante o TCE. No entanto, in vivo, não pode ser explorado para os estudos com o nível da fisiologia celular. Assim, os métodos in vitro são mais vantajosa para este efeito, uma vez que proporcionam um acesso mais fácil às células e no ambiente extracelular por manipulação. Nosso protocolo apresenta um modelo in vitro do TCE utilizando lesão por estiramento em células endoteliais microvasculares cerebrais. Ele utiliza a pressão aplicada às células cultivadas em poços de fundo flexível. A pressão aplicada pode ser facilmente controlada e pode produzir lesão que varia de baixo a grave. A murinaAs células endoteliais microvasculares cerebrais (cEnd) geradas no nosso laboratório é um modelo adequado para a barreira de sangue do cérebro (BBB), proporcionando assim uma vantagem para outros sistemas que empregam uma técnica similar. Além disso, devido à simplicidade do método, da aparelhagem de medição são facilmente duplicados. Assim, este modelo pode ser usado para estudar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na TBI na certificação.

As células cultivadas em placas pré-revestidas de colagénio I de cultura de fundo de 6 poços flexíveis (57,75 centímetros 2) foram submetidos a vários graus de lesão por estiramento usando o dispositivo esticador da célula. Após sujeitar as células à lesão, foram examinadas ao microscópio para os efeitos da lesão induzida por estiramento a morfologia celular. Observou-se que quanto maior grau de estiramento foi aplicada às células de um maior grau de distorção de células também poderiam ser observadas (Figura 1). Como mostrado na Figura 1A, as células de controlo que não foram sujeitos a lesões aparecem células endoteliais vasculares cerebrais como forma de regular (cEnd), sem qualquer indicação de inchaço celular ou distorção. Quando a lesão do estiramento foi aplicado (Figuras 1B-D), a deformação pode ser observada sob o microscópio de luz. Após o alongamento das células severamente com um pico de pressão entre 3,5-4,5 psi, as células cEnd apareceu nitidamente retraído, inchado e deformado com não<html> capazes espaços intercelulares. Além disso, a absorção da mancha de viabilidade (concentração final 100 nM) aumentou também o grau de lesão por estiramento foi aumentada (Figura 2). A mancha de viabilidade utilizada é uma impermeante corante para as células saudáveis ​​que se torna permeável à quando a integridade da membrana plasmática das células está comprometida. O corante foi excluído da maioria das células de controlo, por conseguinte, apenas algumas das células foram coradas (Figura 2A), em comparação com células alongadas (Figuras 2B-D). Mais células fluorescência verde com um maior grau de lesão por estiramento. Como um marcador bioquímico da lesão, a libertação de lactato desidrogenase (LDH), enzima também foi examinada de acordo com as instruções do fabricante. Figura 3 mostra que um aumento da lesão celular causada estiramento aumentando libertação de LDH. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figura 1. Luz exame de microscopia de células normais vs ferido. (A) Normal monocamada de células confluentes unstretched istightly embalado e alongado. Quando as células foram esticados pela aplicação de um impulso de pressão de pico de 1,8-2,0 kPa (ou seja, de baixo alongamento) que aparecem menos compacta, espaços indicado pelas setas (B). Quando as células foram moderadamente ferido com um impulso de pressão de pico 2,5-3,0, alguns deles surgiram inchado e deformado (C). As células tornam-se retraídos com estiramento severo de 3,5-4,5 psi, como indicado pela seta (D). Aumento de 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Fluorescence exame microscópico das células normais vs feridos células tratadas com viabilidade 2h mancha após a lesão A: células não estiradas controle BD: células alongadas (B - baixo, C - moderado, D - grave).... Aumento de 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Desidrogenase (LDH), libertação de enzima Lactato para o sobrenadante após a lesão por estiramento. LDH libertada para o meio de cultura foi medida a vários intervalos de tempo após a lesão induzida pelo estiramento. LDH foi expressa como uma porcentagem do total de LDH releasable (LDH em media mais células). Os valores são ± SEM. O n para cada ponto de tempo é 5, com exceção do 0 hr valor submetido a estiramento severo onde n = 3. Libertação de LDH a partir de células que foram submetidas ao estiramento baixa e moderada não diferiu significativamente da dos controlos não estiradas e um do outro. As células que foram severamente esticados lançou uma quantidade significativamente maior de LDH, em comparação com todas as outras amostras, exceto para a amostra moderadamente esticado em uma hora. (P &lt;0,05, ANOVA Um fator, método de Holm-Sidak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . Tabela 1. Guia para gerar vários níveis de lesão por estiramento. <table border="1"><tbody><tr><th> Regulador de Pressão </th><th> Pressão de pico </th><th> Grau de lesão </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1,2-1,5 psi </td><td> &lt;Baixa </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Baixo </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2,5-3,0 psi </td><td> Moderada </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3.5-4.5 psi </td><td> Grave </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8-6,0 psi </td><td> &gt; Grave </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro estão sendo desenvolvidos modelos de lesões cerebrais traumáticas para reproduzir in vivo deformação cerebral. Estiramento lesão induzida tem sido utilizada para neurónios, astrócitos, células da glia, da aorta e células endoteliais cerebrais. No entanto, nosso sistema utiliza a barreira hemato-encefálica (BBB), modelo que possui propriedades que constituem um modelo legítimo do BBB para estabelecer um modelo TBI vitro.

Estique em células cerebrais endoteliais microvasculares (cEnd) como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de lesão cerebral traumática do cérebro Barreira Hemato

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K visualizações.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  In vitro estão sendo desenvolvidos modelos de lesões cerebrais traumáticas para reproduzir in vivo deformação cerebral. Estiramento lesão induzida tem sido utilizada para neurónios, astrócitos, células da glia, da aorta e células endoteliais cerebrais. No entanto, nosso sistema utiliza a barreira hemato-encefálica (BBB), modelo que possui propriedades que constituem um modelo legítimo do BBB para estabelecer um modelo TBI vitro....

Vídeo: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Medicina

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlado Modelo Impact Cortical para lesão cerebral traumática

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Um novo modelo de Mild Traumatic Brain Injury para ratos jovens

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Oxigênio-Glucose Privação e reoxigenação como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Isquemia e reperfusão Lesão modelo para estudar Disfunção Barreira Hematoencefálica

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

Um modelo de mouse de lesões cerebrais traumáticas leves simples e repetitivas

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...