This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

تمت الموافقة على الدراسات الفئران من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة نورث كارولينا تشابل هيل، وكان كل رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC. 1. إعداد الوليد والكبار التوتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جميع الكواشف والمعدات قبل القتل الرحيم الفئران المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات الجراحية قبل التعقيم أو طرق أخرى مناسبة. يجب إجراء جميع العمليات الجراحية تحت غطاء تدفق الصفحي للحفاظ على ظروف معقمة وتجنب التلوث. تجميع الأدوات اللازمة لاستخراج التوتة من الفئران المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق 60 ملم مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) ووضع على الجليد داخل غطاء محرك السيارة. وسوف تستخدم هذه لتخزين لفترة وجيزة التوتة رفعه من الفئران المانحة قبل الزرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفقا لمبادئ توجيهية أخلاقية، الموت ببطء الفئران حديثي الولادة المانحة بقطع الرأس والمانحين الكبار الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصemoval من الغدة الصعترية: وضع الماوس في موقف الظهرية راقد على منشفة ورقية معقمة ماصة ورذاذ مع الايثانول 70٪ قبل اتخاذ شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح تجويف البطن والصدر من خلال جعل شق خط الوسط من خلال الجلد. أضعاف الجلد فوق الصدر والأطراف الأمامية للكشف عن تجويف الصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين من الشقوق الجانبية من خلال الحجاب الحاجز والقفص الصدري لفضح المنصف العلوي والأمامي التجويف الصدري. يجب أن تكون الغدة الصعترية مرئية كما فصين البيضاء مباشرة فوق والمتاخمة للقلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندف بصرف النظر الأنسجة الضامة المحيطة الغدة الصعترية مع ملقط غرامة، والتأكد من عدم تعطيل كبسولة. في حين تحجم القفص الصدري مع ملقط، واستخدام الزوج الثاني من ملقط لاستخراج اثنين من فصوص الغدة الصعترية عن طريق وضع ملقط المنحني تحت الجهاز وسحب عموديا. ويمكن القيام بذلك باستخدام نطاق تشريح لاستخراج التوتة من الفئران حديثي الولادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الغدة الصعترية في 60 مم ديش تحتوي على العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) على الجليد وفصوص الغدة الصعترية منفصلة من خلال قطع البرزخ الضام. إزالة أي حطام من فصوص الغدة الصعترية التأكد من عدم تلف كبسولة، وقطع الغدة الصعترية إلى العدد المناسب من أقسام للزرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تلاعب في التوتة تم الحصول عليها من الفئران حديثي الولادة. ملاحظة: يستخدم لمدة أقصاها اثنين من الفئران المتلقي (1 الفص في المتلقي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع التوتة تم الحصول عليها من فئران بالغة في مدة أقصاها 4-6 الفئران المتلقي. باستخدام زوج من الملقط، فهم بعناية شخص بالغ واحد فص الغدة الصعترية، كما هو مبين في الشكل رقم 1، وقطع الغدة الصعترية إلى ثلاثة أقسام متساوية باستخدام مقص جراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،3-1،4 لكل الماوس المانحة. من أجل أن يحدد الوقت الذي تتعرض التوتة، وإعداد الغدة الصعترية 1 المانحة في وقت واحد. </li></ol> 2. الغدة الصعترية زرع تحت كبسولة الكلى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع المعدات المعقمة قبل المدرجة في الجدول 1. العقيم السليموينبغي الاستفادة من تقنية أثناء الإجراء لمنع تعريض الزرع المتلقين لأدوات أو الكواشف الملوثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الزرع، تزن كل وعلامة الماوس المتلقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجهر تشريح ودائرة التخدير في غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الحلاقة الكهربائية، حلق الجانب الأيسر من الفأرة المستفيدة وضمان عدم وجود الشعر يبقى في جميع أنحاء المنطقة التي استخدمت لصنع شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على المرذاذ isofluorane وتخدير الماوس باستخدام جرعة بين 1-2٪. تأكد التخدير المناسب قبل البدء في إجراء العمليات الجراحية عن طريق التحقق من عدم وجود رد الفعل التالية قرصة أخمص قدميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تخدير الماوس بشكل صحيح، وتطبيق مرهم البيطرية للعيون من الماوس لمنع جفاف وإعداد الماوس لزرع على النحو التالي: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس تحت المجهر تشريح في وضعية الاضطجاع الجانبي الأيمن بحيث الجانب حلق يكون مواجها لها. Startiنانوغرام في وسط منطقة العمليات الجراحية، موزعة بشكل دائري باستخدام ماصة نقل القابل للتصرف 70٪ من الإيثانول، تليها بوفيدون اليود (betadine). تكرار العلاج الايثانول / betadine 3 مرات قبل اتخاذ شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص تشريح جعل 1-2 سم الجناح شق مباشرة فوق الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط المتوسطة فهم النسيج الضام المتاخمة للالكلى ورفع بلطف الكلى بحيث انها تقع على قمة الجهاز العضلي. للحفاظ على الكلى المكشوفة وفي مكان على الجهاز العضلي، إدراج ذراع واحدة من الملقط المتوسطة تحت الكلى، مع إيلاء اهتمام خاص عدم تعطيل إليوم الكلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل منع جفاف الأنسجة، ري الكلى العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) خلال كل خطوة حتى التلاعب في الكلى والكلى كبسولة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة قرصة ورفع الكبسولة بالقرب من حافة الكلى الأكثر القاصي إلى الغدد الكظرية لفصلها عن الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقياس 18الإبرة إلى إجراء شق كبير بما فيه الكفاية لادخال قطعة استعداد لالغدة الصعترية المانحة (الشكل 2A). تأكد للحفاظ على شق المحفظة صغيرة قدر الإمكان لمنع الخلع من الكسب غير المشروع مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الحفاظ على كبسولة ابتعد من الكلى، واستخدام الزوج الثاني من ملقط غرامة لإدراج الكسب غير المشروع تحت الكبسولة ودفع الغدة الصعترية بقدر إلى الأمام من شق المحفظة ممكن (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ملقط من تحت الكلى، والعودة برفق الكلى مرة أخرى إلى مكان من خلال شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجهاز العضلي من قبل خياطة الجدار البريتوني وتطبيق betadine مرة واحدة مغلقة. بعد خياطة كاملة، وتطبيق مقاطع الجرح لإغلاق الأدمة وتطبيق betadine إلى المنطقة المحيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الماوس إلى القفص الذي تم تسخينه باستخدام مصباح الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد كل فأر بعد العملية حتى يستعيد وعيه الكامل والتنقل وعدم وضع الفئران ثاور لم يشف بعد التخدير في قفص مع غيرها من الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الفئران مع أدوية علاج الألم بعد العمليات الجراحية حسب الحاجة. توفير الفئران مع المسكنات بعد الجراحة مثل اسيتامينوفين في مياه الشرب بتركيز 1.6 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،3-2،9 لكل الماوس المستفيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان عودة الفئران إلى النشاط العادي في حدود 1 ساعة بعد الجراحة. مراقبة الوزن بعد الجراحة، المهارات الحركية، وكذلك الشرب والتغذية نشاط كل الماوس لتحديد المضاعفات التي تنشأ نتيجة لإجراء عملية زرع. ملاحظة: فقدان الوزن بعد العملية، بالمقارنة مع الوزن قبل العملية، وكذلك التنقل تغييرها أو عدم تناول الطعام أو الشراب قد يشير مضاعفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة T إعادة الخلايا في الدم المحيطي النزيف الفئران عن طريق الذيل نيك يليه فصل الخلايا اللمفية باستخدام Lympholyte وسائل الاعلام فصل الخلايا وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. إنجاز T خلية characterizaنشوئها قبل تلطيخ الخلايا الليمفاوية الأجسام المضادة مترافق fluorescently محددة للعلامات الخلايا التائية CD3، CD4، وCD8، فضلا عن الممي ميت يعيش مثل succinimidyl استر تنشيط fluorescently 8. التحليل كما هو مبين في الشكل (3) ويمكن تحقيق ذلك عن طريق النابضة على singlets، والخلايا الحية، وخلايا إيجابية CD3. </li></ol>

<ol>
	<li>Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+tolerance+by+clonal+elimination+in+the+thymus.">T cell tolerance by clonal elimination in the thymus.</a> Cell. 49 (2), 273-280 (1987).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).</li><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire:+what+thymocytes+see+(and+don&#8217;t+see).">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don&#8217;t see).</a> Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li><li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+immunologic+self-tolerance.">Acquisition of immunologic self-tolerance.</a> Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+central+tolerance+in+NOD+mice.">A defect in central tolerance in NOD mice.</a> Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+central+tolerance+with+reaggregate+thymus+organ+cultures.">Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures.</a> Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+development+of+autoreactive+T+cells+in+NOD+mice+is+regulated+in+an+age-dependent+manner.">Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner.</a> J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).</li><li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.+Immunophenotyping.">Chapter 6. Immunophenotyping.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Rice, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+transplantation+for+complete+DiGeorge+syndrome:+medical+and+surgical+considerations.">Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations.</a> J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).</li><li>Markert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+thymus+tissue+in+complete+DiGeorge+Syndrome.">Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).</li><li>Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation.">Thymus transplantation.</a> Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).</li><li>Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+peripheral+T-cell+depletion+in+transplantation+tolerance.">The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).</li><li>Albuquerque, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+FOXN1-Deficiency+is+associated+with+ab+double-negative+and+FoxP3++T-cell+expansions+that+are+distinctly+modulated+upon+thymic+transplantation.">Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation.</a> PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).</li><li>Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation+restores+the+repertoires+of+forkhead+box+protein+3+(FoxP3)++and+FoxP3-+T+cells+in+complete+DiGeorge+anomaly.">Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly.</a> Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).</li><li>Savino, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymus+is+a+common+target+organ+in+infectious+diseases.">The thymus is a common target organ in infectious diseases.</a> PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests to disclose.

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge syndrome, characterized by thymic hypoplasia or thymic aplasia9-10. Thymus transplantation, like most organ transplantation, is not free of complications, which are mostly due to transplant tolerance-related complications12 and development of autoimmune pathologies11. These issues, coupled with the need to better understand and characterize mechanisms involved in thymocyte tolerance induction led to the development of this method. The protocol described herein experimentally models thymic transplantation and demonstrates that efficient T cell reconstitution is obtained in recipients.
There are several key points to note in the protocol. It is necessary to be adept at surgery and aseptic technique prior to performing the transplantation surgery. Adherence to this will help minimize trauma, the time the mouse is anesthetized, and recovery time so that 100% post-surgery survival rate can be readily obtained. When preparing the donor thymus, it is imperative that the organ is kept on wet ice to minimize cell death. In addition the thymic lobes need to be cut to appropriate sized fragments to permit implantation without tearing the kidney capsule. Similarly, care is required to prevent any injury to the kidney upon making the incision of the renal capsule. Placement of the thymic graft underneath the kidney capsule is another important step in the process. Injury to the kidney or tearing of the renal capsule can be avoided with gentle handling, using appropriate fine-tipped surgical tools, and sufficient practice. One possibility to note is that successful T cell engraftment may also be achieved by implanting thymic lobes at sites other than under the kidney capsule, for instance at a subcutaneous site. The kidney however provides an ideal environment to receive thymic grafts due to a high level of vascularization, which promotes both graft survival as well as efficient T cell trafficking following thymic selection.
A distinct advantage of the above thymus transplant protocol is the technical ease in determining T cell engraftment. Using flow cytometry, success of the procedure is qualitatively and quantitatively assessed by measuring the frequency of T cells in peripheral blood. In addition to observing mature T cells in the blood, T cell engraftment is detected in various lymphoid organs. The latter permits further study of the expansion, activation, and differentiation of peripheral T cells in various host genetic environments under physiological conditions. One caveat that investigators may consider when interpreting results is that following thymic engraftment into an immunodeficient recipient, newly selected T cells will undergo lymphopenic expansion in the periphery. Although this rapid expansion will not alter thymic selection events, it may lead to preferential expansion of distinct T cell subsets in peripheral tissues. 
This protocol is widely applicable for studying mechanisms regulating T cell development and homeostasis in a variety of pathologies. For example, this approach can be used to study FoxP3 regulatory T cell generation and development7,13-14, as well as T cell renewal and export from the thymus in in vivo models of persistent viral, fungal, or bacterial infection15. In summary, this article describes a method of thymus transplantation that entails minimal manipulation of donor tissue, and a high success rate once the technique has been mastered.

الغدة الصعترية هي الجهاز الذي الأحداث الهامة في تطوير الخلايا T تحدث 1. thymocytes المقيمين، على إعادة ترتيب الخلايا التائية مستقبلات (TCR) α و β الجينات، الخضوع لسلسلة من التفاعلات مع الخلايا lymphostromal ومقدمة للمستضد (APC) في المناطق القشرية والنخاعية من الغدة الصعترية 2. وتتوسط التوتة اختيار إيجابية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية (TEC) لإنتاج thymocytes التي تعترف الببتيدات المستضدات في سياق المضيفة الرئيسية معقد التوافق النسيجي (MHC) الصف الأول والثاني جزيئات 2-3. اللاحقة اختيار السلبية الغدة الصعترية تستلزم تطهير thymocytes autoreactive، يقودها التفاعل مع TEC النخاع أو الخلايا الجذعية (DC) أن الببتيدات الحالية المستمدة من البروتينات الذاتي ملزمة MHC من الدرجة الأولى والثانية الجزيئات 3. النتيجة النهائية لهذه العمليات هو إنشاء مجموعة من خلايا CD4 + ناضجة وCD8 + T قادرة على الرد على طيف واسعمن المستضدات الأجنبية، وفى نفس الوقت الحد الأدنى من التفاعل للبروتينات الذاتي 4. ويتأثر كفاءة أحداث اختيار الغدة الصعترية من قبل مجموعة من العوامل، بما في ذلك نضج الغدة الصعترية، وتواتر النخاع وTEC القشرية، وتكوين فرعية من الغدة الصعترية DC، ومصدر السلائف الغدة الصعترية 3. والجدير بالذكر، أن اختيار الغدة الصعترية الشاذة يؤدي في المناعة الذاتية 5 أو العوز المناعي الأمراض التي تنشأ من ضعف اختيار سلبية أو إيجابية، على التوالي. الأحداث الجزيئية التي تنظم اختيار الغدة الصعترية، ومع ذلك، غير مفهومة. في المختبر النهج مثل reaggregate الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (RTOC) 6، وقد ثبت أن تكون مفيدة لتحليل الأحداث الأساسية المرتبطة اختيار الغدة الصعترية، لكنه يفشل في ألخص تماما ديناميكية مستمرة في أحداث الجسم الحي. ونتيجة لذلك، تم إنشاء هذا النهج القائم على زرع الغدة الصعترية إلى أفضل الأحداث الدراسة اختيار خلية توتية في الجسم الحي 7 </sتصل&gt;. يصف هذا البروتوكول زرع التوتة من الفئران المانحة حديثي الولادة وتعليم الكبار في الفئران المتلقي SCID العوز المناعي. تسمح هذه التقنية على دراسة الآليات التي تنظم اختيار الغدة الصعترية الإيجابية والسلبية، وكذلك انتاج الغدة الصعترية من مختلف مجموعات فرعية الخلايا T أثناء تطور الجنين. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدم هذا النهج لإثبات أن كفاءة اختيار الغدة الصعترية يقتصر في وقت مبكر بعد الولادة لدى الفئران مما يؤدي إلى زيادة نمو الخلايا T autoreactive، وانخفاض الخلايا التائية ذخيرة محددة لمستضدات الخارجية 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2705HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Solution</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>67618-150-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures (1.0 metric)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J493G</td>
			<td>18&#34; (45cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTOCLIP Wound Clips (9mm)</td>
			<td>Clay Adams&#174; Brand</td>
			<td>427631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td>Sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD3 Ab</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0031-85</td>
			<td>Clone: 1452C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD4 Ab</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Clone: RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD8 Ab</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0081-82</td>
			<td>Clone: 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lancet</td>
			<td>Medipoint</td>
			<td>Goldenrod 4mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P30253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round botton polypropylene plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2mL polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40uM Nylon Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Optical Ointment</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CL5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td>60mm x 15mm, Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.

ولا تزال الآليات التي تنظم فعالية اختيار الغدة الصعترية سيئة التحديد. الطريقة المعروضة هنا يسمح في التحليلات المجراة من تطوير واختيار خلايا T معينة للدفاع عن النفس والمستضدات الأجنبية. النهج ينطوي زرع الطعوم الغدة الصعترية المستمدة من مختلف الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين المستفيدين في SCID العوز المناعي. خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن وأعيد المستلمين تماما مع خلايا T المستمدة من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية مزروع. بذر thymocytes فقط الغدة الصعترية في وقت العزلة الخضوع اختيار وتتطور إلى خلايا T الناضجة. على هذا النحو، يمكن تقييم التغيرات في طبيعة وخصوصية الخلايا T المغروسة بوصفها وظيفة من الأحداث الغدة الصعترية التي تعتمد على العمر. على الرغم من الخبرة الفنية اللازمة لزرع الغدة الصعترية ناجحة، وهذه الطريقة توفر استراتيجية فريدة من نوعها للدراسة في الجسم الحي مجموعة واسعة من الأمراض التي ترجع إلى نتيجة أو وظيفة و / أو homeostas الغدة الصعترية الشاذةهو.

نجاح هذا الإجراء يعتمد على الحد الأدنى من الصدمة الجراحية فضلا عن دقة تحديد المواقع من الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى. يجب أن تقطع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية لضمان الحجم أقسام الغدة الصعترية لزرع احقا بشكل مناسب كما هو مبين في الشكل 1. وبعد التخطيطي في الشكل 1، التوتة من الفئران حديثي الولادة أو الكبار يمكن استخدامها لنجاح زرع تحت المحفظة مع نتائج engraftment الخلايا T متناسقة وقابلة للتكرار. كما ذكر، وتحديد المواقع المناسبة من الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى مهم في الحفاظ على البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، وظيفة، والأوعية الدموية من الكسب غير المشروع. كما رأينا في الشكل 2، يجب وضع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية فوق الكلى، والأقرب إلى الغدد الكظرية (الأمامي من الكلى)، على الطرف الآخر من شق المحفظة (الخلفي من الكلى). عملية زرع الغدة الصعترية ناجحة، عندما يقترن مع بيئة مناسبة للدم، ويمكن صemain إنتاجية تزيد عن 30 أسبوعا 7. بعد الزرع، ويتم تقييم engraftment من قبل تدفق cytometric يحلل خلايا T تم الحصول عليها من الدم المحيطي الشكل 3 والجدول 2 تدليل على مستوى نموذجي من الخلايا التائية engraftment لوحظ في الأجهزة والدم المحيطي في المتلقي زرع 6 أسابيع بعد الزرع. باستخدام هذه التقنية، لدينا مجموعة قد أظهرت سابقا حركية CD4 + CD8 + T وإعادة الخلايا في الدم المحيطي مع مرور الوقت في متلقى من التوتة حديثي الولادة وتعليم الكبار. لفترة وجيزة، وتعميم خلايا T ويمكن ملاحظة في محيط خلال أسبوع واحد بعد الجراحة وتستمر أعداد الخلايا CD4 + CD8 + T وزيادة حتى يتم إعادة تشكيل الطرفية مقصورة الخلايا T بالكامل في 5-6 أسابيع بعد زرع 7. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52709/52709fig1.jpg" /> <strong&gt; الشكل 1: إعداد فصوص الغدة الصعترية وأقسام من الأطفال حديثي الولادة المانحة والكبار الفئران المانحة يتم استئصال التوتة من العمر يوم 1 (NB) و 4 اسبوع (الكبار). وتعرض الخطوط المتقطعة كدليل لإعداد الحد الأقصى لعدد مقاطع من أحد أجهزة المانحة للزرع لاحق. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52709/52709fig2.jpg" /> الشكل 2: موقف شق المحفظة ووضع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية يتم إدراج المقطع بحجم مناسب أعدت من الغدة الصعترية المانحة في الفضاء تحت المحفظة التي تم إنشاؤها بواسطة شق صغير في الكبسولة الكلى في نهاية الخلفي من الكلى (A). الأمامي إلى الكلى، والأقرب إلى الغدد الكظرية (ليس في الصورة) وعلى الطرف المقابل من شق المحفظة، هو الموقف الأمثل للالكسب غير المشروع التي يتم إدراجها تحت الكبسولة كما هو مبين في (B). <img alر = &quot;الشكل 3&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52709 / 52709fig3.jpg&quot; /&gt; الشكل 3. تحديد engraftment ناجحة عن طريق T إعادة خلية في الطرفية أجهزة الدم واللمفاوية. تدفق البيانات cytometric هي احظ ممثل الخلايا التائية إعادة 6 أسابيع بعد الزرع في المتلقي SCID من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية NB. ولوحظت مستويات مماثلة من الخلايا التائية engraftment في الدم المحيطي، الطحال، العقدة الليمفاوية البنكرياس (PLN)، والعقدة الليمفاوية المساريقي (MLN) بعد زرع بنجاح من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ملقط تشريح غرامة </td></tr><tr><td> ملقط تشريح المتوسطة (2) </td></tr><tr><td> ملقط تشريح غرامة (تلميح منحنية) </td></tr><tr><td> Betadine الحل </td></tr><tr><td> 70٪ من الإيثانول </td></tr><tr><td> 18 إبرة قياس </td></tr><tr><td> تشريح المجهر ث / مصدر الضوء </td></tr><tr><td> ديماصات نقل sposable (2) </td></tr><tr><td> أدوية لعلاج الألم: أسيتامينوفين </td></tr><tr><td> مناديل معقمة </td></tr><tr><td> مصباح الحرارة </td></tr><tr><td> الحلاقة الكهربائية </td></tr><tr><td> الأيزوفلورين والمرذاذ isoflurane </td></tr><tr><td> الغرز (سريع الامتصاص، الأمعاء عادي) </td></tr><tr><td> تشريح مقص </td></tr><tr><td> 9 مقاطع مم الفولاذ المقاوم للصدأ الجرح </td></tr><tr><td> الجرح كليب أداة إزالة </td></tr><tr><td> العقيمة برنامج تلفزيوني 1X </td></tr><tr><td> 60 ملم صحن </td></tr></tbody></table> الجدول 1: المواد اللازمة خلال زرع الغدة الصعترية الجراحي قائمة المواد الضرورية المستخدمة لزرع الغدة الصعترية تحت كبسولة الكلى من الماوس المتلقي. يتم سرد كمية من المواد المحددة بين قوسين. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> توتال عدد خلايا CD4 T </td><td> إجمالي عدد خلايا CD8 T </td></tr><tr><td> دم </td><td> 1652 خلية / υl </td><td> 351 خلية / υl </td></tr><tr><td> طحال </td><td> 11546617 </td><td> 4203299 </td></tr><tr><td> PLN </td><td> 1241789 </td><td> 364918 </td></tr><tr><td> MLN </td><td> 2182266 </td><td> 532059 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. إجمالي عدد خلايا T الحالية في الطرفية الدم واللمفاوية أجهزة لعملية زرع المتلقي الغدة الصعترية. مجموع عدد CD4 + CD8 + T والخلايا المستخرجة من الأجهزة وكذلك الدم المحيطي من حديثي الولادة الغدة الصعترية زرع المتلقي لما بعد 6 أسابيع الزرع. هذه الأرقام هي تمثيلية من CD4 + CD8 + T والخلايا الخلوية التي عادة ما لوحظ في متلقى الغدة الصعترية حديثي الولادة والبالغين ناجحة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

isolation-and-transplantation-of-different-aged-murine-thymic-grafts

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo. 

Video: Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

الفئران كامل سماكة الجلد زراعة

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...