وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل (رقم 1418/11) لآه و(رقم 1933-1912) إلى AW، ومؤسسة الإسرائيلية الألمانية للمحققين الشباب (GIF يونغ) إلى الخبر، وأنا د. . صندوق الهبات للبحوث Cabakoff في مدرسة الجامعة العبرية هداسا طب الأسنان لآه وAW.

إعداد مقدما: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS + 2٪ FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS + 2٪ FCS مع 2 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني و 1 ملغ / مل من الدناز النوع الأول (1 مل لكل عينة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات الجراحية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 M الحل EDTA </li></ul> 1. العلوي وتقنيات استئصال اللثة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران باستخدام التوجيه IACUC المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع جانبي تجويف الفم بما في ذلك الخدين والفك السفلي مع الفرع حاد / كليل مقص على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدم الفك السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنسجة الرخوة والصلبة في وهمي خط 1 ملم وراء الأضراس ثلثي مع مقص القياسية. توجيه مقص عمودي على الطائرة من العظم الحنكي (الشكل 2A، خطوط زرقاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق الأنسجة الصلبة واللينة 2 ملم وراء القواطع (الشكل 2A، خطوط زرقاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدم الجزء الأمامي من الفم. يتم ملاحظتها تجويف الأنف بعد هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع مقصبالتوازي مع الحنك، وضعت شفرة واحدة في تجويف الأنف، ينبغي أن نصل غيرها من شق في الدهليز. قطع حتى شق الخلفي (الشكل 2A، خطوط خضراء). كرر هذه الخطوة على جانبي الفك العلوي. في النهاية هو فصل الفك العلوي عن بقية الجمجمة (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفك العلوي، قطع عليه في خياطة الأوسط (الشكل 2، أسود خط متقطع) وتقليم الأنسجة حنكي من كل نصفي الفك العلوي حتى تصل إلى العظم السنخي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر أنسجة اللثة (كلا نصفي للفك العلوي) من حدودهما الأمامي مع أدسون ملقط (بدون أسنان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اللثة رفعه في لوحة مع PBS + 2٪ FCS. </li></ol> 2. اللثة التحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اللثة رفعه في طبق زراعة الأنسجة (35 × 10 مم) مع 1 مل PBS + 2٪ FCS، 2 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني و 1 ملغ / مل من الدناز نوع I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم جيدا الأنسجة مع N ° 15 شفرة جراحية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TRansfer الأنسجة من لوحة إلى 15 مل أنبوب اختبار المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا الأنسجة / المتبقية على لوحة مع 1 مل PBS + 2٪ FCS ونقل إلى أنبوب اختبار نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حاضنة شاكر لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة (التوصية: سخن الحاضنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من EDTA 0.5 M واحتضان لمدة 10 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب اختبار ما يصل إلى 12 مل مع برنامج تلفزيوني + 2٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 400 x ج لمدة 8 دقائق (التوصية: مرحلة ما قبل البرد أجهزة الطرد المركزي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 2 مل PBS + 2٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عينة مع 70 ميكرومتر الخلية مصفاة وحفظ تدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 320 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 300 ميكرولتر PBS + 2٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا (ومن المتوقع حوالي 5-10 × 10 5 خلايا من الفك العلوي واحد). </li></ol> 3. جسم الخلية وبين الخلاياتلطيخ لتحليل التدفق الخلوي فمن المستحسن للعمل داخل غطاء محرك السيارة، مع الأنوار. فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الخلايا في بيئة باردة مستمر، وكذلك جميع المواد اللازمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الخلايا ضد الجزيئات خارج الخلية عن طريق إضافة 0.2-0.5 ميكروغرام من كل الأجسام المضادة المحددة في 1 × 10 6 خلايا في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 2 مل PBS + 2٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 320 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الخلايا طاف و resuspend بإضافة قطرة من الحكمة، و 500 ميكرولتر BD الباردة Cytoperm / Cytofix بينما vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب لمدة 40 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 1 مل بيرم BD الباردة / غسل العازلة وتدور في 800 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف باستثناء 300 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الخلايا داخل الخلية بواسطةإضافة 1 ميكروغرام من كل الأجسام المضادة المحددة في 1 × 10 6 خلايا في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 1 مل بيرم BD الباردة / غسل العازلة وتدور في 800 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الخلايا طاف و resuspend عن طريق إضافة 300 ميكرولتر بيرم / غسل BD الباردة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق بينما تصفية لأنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الأنابيب في بيئة مظلمة وباردة حتى التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss.">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+periodontitis.">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li><li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease.">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li><li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis:+in+situ,+in+vivo,+and+in+vitro+studies.">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li><li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li><li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+chemokine+(MCP-1,+MIP-1alpha,+MIP-1beta,+IP-10,+RANTES)-positive+cells+and+chemokine+receptor+(CCR5,+CXCR3)-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues.">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li><li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation.">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li><li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease.">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li><li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response:+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease.">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الفك العلوي أنسجة اللثة الحصول عليها من ماوس واحدة كافية لتحليل المجموعات الفرعية من السكان من الخلايا الليمفاوية T و B، وكذلك قدرتها على التعبير عن جزيئات الخلية وبين الخلايا كما وصفنا سابقا 1. ومع ذلك، إذا السكان الخلية نادرة ذات أهمية (على سبيل المثال ن)، فمن المستحسن أن الأنسجة تجمع 2-3 الفئران. من ملاحظة، إذا الأفضل، وأنه من الممكن أن قشر كل من أنسجة الحنك واللثة ومن ثم إلى استئصال اللثة (أ تعديل الخطوة 1،8-1،9). تجدر الإشارة أيضا إلى أن الفك السفلي اللثة يمكن جمعها كذلك؛ يزال، عزلتها أكثر تعقيدا ويمكن أن تشمل الأنسجة الأخرى التي قد تتداخل مع التحليل. التقنيات الشائعة لدراسة الخلايا المناعية في اللثة هي المناعية والمناعي. هذه التقنيات تمكين التصور من توزيع هدفا جزيء / الخلية من خلال اللثة، وفحص العديد من الميدانمطلوب و من أجل دراسة منطقة معينة. في حين أن التعريب الفسيولوجية للخلايا معينة لا يمكن تحديده من خلال التدفق الخلوي بسبب معالجة اللثة، فإن هذا النهج يوفر العديد من المزايا الأخرى: (1) التدفق الخلوي هو طريقة سريعة وبسيطة لتحليل أعداد كبيرة من الخلايا (2) أنه يقلل الأخطاء تحليل تنشأ من تجانس الأنسجة (3) أنه تمكن من تحليل للسكان الخلية النادرة (4) لأنها تتيح تحليل مختلف المتغيرات في وقت واحد (5) لأنها تتيح التمييز بين الخلايا الحية والميتة (6) ويسمح تحليل وظيفي للخلايا الناتجة عن ذلك. القدرة على إجراء تحليل التدفق الخلوي على أنسجة اللثة أثناء أمراض اللثة التجريبية يعزز من قدرتنا على الكشف عن الآليات المناعية تشارك في هذه العملية. دراسة طولية من التغيرات الخلوية التي تحدث في ما يلي التعرض لمسببات الأمراض اللثة عن طريق الفم يجب توفير المزيد من المعلومات ذات الصلة بدلا من قياس الاستجابات المناعية لياليystemically. هذا الجانب له أهمية خاصة عند تحليل النمط الظاهري وحركية من خلايا التهابية الفطرية والتكيفية في اللثة الملتهبة.

اللثة هي الأنسجة الرخوة المحيطة عنق الرحم جزء من الأسنان ويغطي عملية السنخية (الشكل 1). اللثة هو نوع من الغشاء المخاطي المضغ التي يمكن تقسيمها إلى مزيد من ظهارة الغشاء المخاطي والنسيج الضام (المعروف أيضا باسم مخاطية أو الصفيحة المخصوصة). بنية التشريحية للاللثة والأسنان المجاورة يسمح البكتيريا للإقامة وتطوير لوحة (بيوفيلم) التي تتحدى باستمرار الجهاز المناعي المحلية. ونتيجة لذلك، يطور الاستجابة الالتهابية في اللثة، والتي في ظروف معينة يصبح المدمرة - وهي حالة تسمى أمراض اللثة 2. في الأساس، ويمكن تقسيم أمراض اللثة البلاك التي يسببها التهاب اللثة والتهاب اللثة إلى. التهاب اللثة يمثل حالة عكسها من الاستجابة الالتهابية المحلية أن يقتصر على اللثة. التهاب اللثة، من ناحية أخرى، هو عملية تدميرية لا رجعة فيه جهاز مرفق (العظم السنخي، اللثةيتم تدمير الرباط، الملاط واللثة) 3. واقترح اللثة لخدمة المواقع على حد سواء المستجيب كما وحثي خلال أمراض اللثة 4. وقد اقترحت الدراسات أن الإنسان استجابة لوحة الأسنان، وخلايا المستجيب المناعي والجزيئات تسللت بشكل حيوي أو مغادرة اللثة 5-7. وقد تبين هذا النشاط لتلعب دورا رئيسيا في تدمير اللثة 8،9. في حين البيانات التي تولدها هذه الدراسات قدمت معلومات قيمة بخصوص هذه العملية المرضية، والعمل مع الأنسجة البشرية تمتلك القيود الأخلاقية والتقنية والتجريبية الكبرى. تطوير نماذج تجريبية يسمح التجريب السبب والنتيجة عبر استخدام الفئران المعدلة وراثيا والتدخلات في الجسم الحي 10. ونتيجة لذلك، علمنا على الآليات التي تشارك في أمراض اللثة زيادة كبيرة خلال العقدين الماضيين. وحتى مع ذلك، ونظرا لتعقيد أمراض اللثة، وهناكمناقشة جارية بشأن طبيعة الاستجابة المناعية المحلية تسهيل تدمير الأنسجة. هناك أيضا نقص في فهمنا على وظيفة الخلايا المناعية المركزية في اللثة أثناء أمراض اللثة. وبالتالي فمن الضروري دراسة الأحداث التهابات المرضية التي تحدث في النسيج المستهدف لهذا المرض، واللثة.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Comments (optional)</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Company</td>
 <td>Name of the reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>CLS-2</td>
 <td>Worthington Biochemical Corp.</td>
 <td>Collagenase Type II</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>DN25-1G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>DNAse I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>E6758-100G</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>D8537</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat Inactivated</td>
 <td>04-121-1</td>
 <td>Biological Industries</td>
 <td>Fetal Bovine Serum </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FPE-204-500</td>
 <td>Jet Biofil</td>
 <td>Vacuum-Driven Filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>352052</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>93070</td>
 <td>SPL Lifesciences</td>
 <td>Cell Strainer 70 &mu;m</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>153066</td>
 <td>NUNC</td>
 <td>Tissue Culture Dish 35&times;10 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>554714</td>
 <td>BD</td>
 <td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone N418</td>
 <td>117305</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD11c antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 104</td>
 <td>109819</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD45.2 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone GK1.5</td>
 <td>100413</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD4 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 53-6.7</td>
 <td>100733</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD8a antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 17A2</td>
 <td>100214</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD3 antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone G8.8</td>
 <td>118219</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 929F3.01</td>
 <td>DDX0362D</td>
 <td>Imgenex</td>
 <td>Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clone 39-10-8</td>
 <td>115010</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>LSR II Flow Cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tree Star</td>
 <td>FlowJo Software v 7.6.5</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, processing and analysis of murine gingival cells

لقد قمنا بتطوير تقنية لعزل بدقة ومعالجة الأنسجة اللثوية الفئران لالتدفق الخلوي والدراسات الجزيئية. اللثة هي النسيج فريدة وهامة لدراسة آليات المناعة لأنها تشارك في الاستجابة المناعية المضيف ضد بيوفيلم عن طريق الفم التي قد تسبب أمراض اللثة. وعلاوة على ذلك، وعلى مقربة من اللثة إلى أنسجة العظم السنخي تمكن تدرس أيضا إعادة تشكيل العظام في ظل ظروف التهابات. لدينا وسيلة تعطي كمية كبيرة من الخلايا المناعية التي تتيح تحليل حتى السكان الخلية نادرة مثل خلايا لانغرهانس وخلايا T التنظيمية كما أثبتنا سابقا 1. الفئران التي تستخدم لدراسة الاستجابات المناعية المحلية المعنية في فقدان العظم السنخي خلال أمراض اللثة هو مفيد بسبب توافر مختلف الأدوات المناعية والتجريبية. ومع ذلك، نظرا لصغر حجم وغير مريح نسبيا الوصول إلى اللثة الفئران، تجنب العديد من الدراسات دراسة ثيق الحرجة في الأنسجة. الطريقة الموضحة في هذا العمل يمكن أن تسهل تحليل اللثة، التي نأمل زيادة التفاهم لدينا على الجهاز المناعي عن طريق الفم ودورها خلال أمراض اللثة.

يتم عرض أمثلة على تحليل التدفق الخلوي في خلايا اللثة. تم تشغيل خلايا اللثة المجمعة من 2 فئران في LSR الثاني تدفق عداد الكريات وتحليلها باستخدام FlowJo البرمجيات. أثبتت الشكل 3A توزيع خلايا اللثة من الفئران السذاجة في الجانب مبعثر (SSC) مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) مؤامرة. استراتيجية المحاصرة لتحديد (ط) الخلايا الليمفاوية (II) حيدات / الخلايا الجذعية و (الثالث) ويشار المحببة. لغرض المقارنة، فإننا نقدم أيضا مؤامرة FACS توضح خلايا اللثة تنقيته من P. اللثوية إصابة الفئران بعد 21 يوما أنبوب تغذية عن طريق الفم في وضع اللثة التجريبية ونحن سبق وصفها (الشكل 3B). زيادة في مختلف السكان الخلايا المناعية يمكن اكتشافه بسهولة في الفئران المصابة بالمقارنة مع الفئران السذاجة. المقبل، ونحن تحديد الخلايا المناعية في اللثة التي تتم معالجتها بواسطة تبوب على الخلايا المكونة للدم معربا عن علامة CD45 (الشكل 4A). T<html> مزيد من فصل الخلايا ذات المناظر في خلايا إيجابية CD3 تمثل خلايا T (الشكل 4B). كما حددنا العدلات اللثة وفقا لتعبير عن Ly6G والجزيئات CD11b (الشكل 4C). وأخيرا، تم تحديد خلايا لانغرهانس، مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية الظهارية (DCS)، بواسطة تبوب على MHC من الدرجة الثانية + + CD11c والخلايا (علامة من DCS الفئران) والتعبير عن EP-CAM وlangerin/CD207 (تلطيخ الخلايا) (الشكل 4D). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50388/50388fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50388/50388fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي يبين المعالم التشريحية للاللثة. oad/50388/50388fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. تخطيطيا من تجويف الفم الماوس الناتج بعد إكمال الخطوة 1.3 الأنسجة الرخوة من الخلف إلى الأمام:. الماضغة العضلات (MM)، والحنك الرخو (SP) والحنك الصلب (HP)، اللثة (G). الأنسجة الصلبة: الأضراس والقواطع. والهدف الرئيسي من هذه التقنية هو عزل الأنسجة اللثوية التي تحيط الأضراس ثلاثة (داخل البيضاوي الأسود). <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50388/50388fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50388/50388fig3.jpg" /> الشكل (3). تم تشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية ممثل المؤامرات يتظاهرون توزيع الخلوية من الكريات البيض اللثة. عينات اللثة معالجتها على LSR الثاني تدفق عداد الكريات وتحليلها باستخدام FlowJo البرمجيات. الجانب مبعثر (SSC) مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) قطع من الخلايا اللثة من (A) الفئران السذاجة أو (B) اللثة الملتهبة هي بريهented. موقع (ط) الخلايا الليمفاوية (II) حيدات / الخلايا الجذعية و (الثالث) ويشار المحببة السكان. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50388/50388fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50388/50388fig4.jpg" /> الشكل 4. ممثل FACS المؤامرات يدل تحليل خلايا اللثة المناعي. (A) تم تحديد الخلايا المناعية وفقا لCD45 التعبير. بعد تبوب على خلايا CD45 الإيجابية والخلايا الليمفاوية السكان والتعبير عن CD3 مكن استهداف تي خلية فرعية. (B) تم تحديد العدلات في اللثة وفقا لقدرة الخلايا + CD45 للتعبير أيضا Ly6G وCD11b. (C) وكانت الخلايا الجذعية التي حددها تبوب على خلايا CD45 + من السكان الوحيدات / شجيري [الشكل 3، بوابة (II)]، ومن ثم على MHC من الدرجة الثانية والخلايا CD11c إيجابية. <sتم فصل ترونج&gt; (D) خلايا لانغرهانس مزيد من الخلايا الجذعية الأخرى على أساس التعبير عن EP-CAM وجزيء langerin داخل الخلايا. <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50388/50388fig4large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells at JoVE.com

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

توضح هذه الدراسة تقنية فعالة لعزل ومعالجة أنسجة اللثة من تجويف الفم الماوس من أجل إنتاج ثقافة وحيدة الخلية. الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كذلك لتحليل التدفق الخلوي والدراسات الجزيئية.

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

isolation-processing-and-analysis-of-murine-gingival-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.8K Views.  Hebrew University - Hadassah Medical Center. توضح هذه الدراسة تقنية فعالة لعزل ومعالجة أنسجة اللثة من تجويف الفم الماوس من أجل إنتاج ثقافة وحيدة الخلية. الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كذلك لتحليل التدفق الخلوي والدراسات الجزيئية.

Video: Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...