وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل (رقم 1418/11) لآه و(رقم 1933-1912) إلى AW، ومؤسسة الإسرائيلية الألمانية للمحققين الشباب (GIF يونغ) إلى الخبر، وأنا د. . صندوق الهبات للبحوث Cabakoff في مدرسة الجامعة العبرية هداسا طب الأسنان لآه وAW.

إعداد مقدما: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS + 2٪ FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS + 2٪ FCS مع 2 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني و 1 ملغ / مل من الدناز النوع الأول (1 مل لكل عينة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات الجراحية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 M الحل EDTA </li></ul> 1. العلوي وتقنيات استئصال اللثة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران باستخدام التوجيه IACUC المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع جانبي تجويف الفم بما في ذلك الخدين والفك السفلي مع الفرع حاد / كليل مقص على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدم الفك السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنسجة الرخوة والصلبة في وهمي خط 1 ملم وراء الأضراس ثلثي مع مقص القياسية. توجيه مقص عمودي على الطائرة من العظم الحنكي (الشكل 2A، خطوط زرقاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق الأنسجة الصلبة واللينة 2 ملم وراء القواطع (الشكل 2A، خطوط زرقاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدم الجزء الأمامي من الفم. يتم ملاحظتها تجويف الأنف بعد هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع مقصبالتوازي مع الحنك، وضعت شفرة واحدة في تجويف الأنف، ينبغي أن نصل غيرها من شق في الدهليز. قطع حتى شق الخلفي (الشكل 2A، خطوط خضراء). كرر هذه الخطوة على جانبي الفك العلوي. في النهاية هو فصل الفك العلوي عن بقية الجمجمة (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفك العلوي، قطع عليه في خياطة الأوسط (الشكل 2، أسود خط متقطع) وتقليم الأنسجة حنكي من كل نصفي الفك العلوي حتى تصل إلى العظم السنخي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر أنسجة اللثة (كلا نصفي للفك العلوي) من حدودهما الأمامي مع أدسون ملقط (بدون أسنان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اللثة رفعه في لوحة مع PBS + 2٪ FCS. </li></ol> 2. اللثة التحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اللثة رفعه في طبق زراعة الأنسجة (35 × 10 مم) مع 1 مل PBS + 2٪ FCS، 2 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني و 1 ملغ / مل من الدناز نوع I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم جيدا الأنسجة مع N ° 15 شفرة جراحية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TRansfer الأنسجة من لوحة إلى 15 مل أنبوب اختبار المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا الأنسجة / المتبقية على لوحة مع 1 مل PBS + 2٪ FCS ونقل إلى أنبوب اختبار نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حاضنة شاكر لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة (التوصية: سخن الحاضنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من EDTA 0.5 M واحتضان لمدة 10 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب اختبار ما يصل إلى 12 مل مع برنامج تلفزيوني + 2٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 400 x ج لمدة 8 دقائق (التوصية: مرحلة ما قبل البرد أجهزة الطرد المركزي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 2 مل PBS + 2٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عينة مع 70 ميكرومتر الخلية مصفاة وحفظ تدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 320 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 300 ميكرولتر PBS + 2٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا (ومن المتوقع حوالي 5-10 × 10 5 خلايا من الفك العلوي واحد). </li></ol> 3. جسم الخلية وبين الخلاياتلطيخ لتحليل التدفق الخلوي فمن المستحسن للعمل داخل غطاء محرك السيارة، مع الأنوار. فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الخلايا في بيئة باردة مستمر، وكذلك جميع المواد اللازمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الخلايا ضد الجزيئات خارج الخلية عن طريق إضافة 0.2-0.5 ميكروغرام من كل الأجسام المضادة المحددة في 1 × 10 6 خلايا في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 2 مل PBS + 2٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 320 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الخلايا طاف و resuspend بإضافة قطرة من الحكمة، و 500 ميكرولتر BD الباردة Cytoperm / Cytofix بينما vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب لمدة 40 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 1 مل بيرم BD الباردة / غسل العازلة وتدور في 800 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف باستثناء 300 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الخلايا داخل الخلية بواسطةإضافة 1 ميكروغرام من كل الأجسام المضادة المحددة في 1 × 10 6 خلايا في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 1 مل بيرم BD الباردة / غسل العازلة وتدور في 800 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الخلايا طاف و resuspend عن طريق إضافة 300 ميكرولتر بيرم / غسل BD الباردة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق بينما تصفية لأنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الأنابيب في بيئة مظلمة وباردة حتى التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss.">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+periodontitis.">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li><li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease.">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li><li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis:+in+situ,+in+vivo,+and+in+vitro+studies.">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li><li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li><li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+chemokine+(MCP-1,+MIP-1alpha,+MIP-1beta,+IP-10,+RANTES)-positive+cells+and+chemokine+receptor+(CCR5,+CXCR3)-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues.">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li><li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation.">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li><li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease.">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li><li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response:+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease.">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الفك العلوي أنسجة اللثة الحصول عليها من ماوس واحدة كافية لتحليل المجموعات الفرعية من السكان من الخلايا الليمفاوية T و B، وكذلك قدرتها على التعبير عن جزيئات الخلية وبين الخلايا كما وصفنا سابقا 1. ومع ذلك، إذا السكان الخلية نادرة ذات أهمية (على سبيل المثال ن)، فمن ?...

اللثة هي الأنسجة الرخوة المحيطة عنق الرحم جزء من الأسنان ويغطي عملية السنخية (الشكل 1). اللثة هو نوع من الغشاء المخاطي المضغ التي يمكن تقسيمها إلى مزيد من ظهارة الغشاء المخاطي والنسيج الضام (المعروف أيضا باسم مخاطية أو الصفيحة المخصوصة). بنية التشريحية للاللثة والأسنان المجاورة يسمح البكتيريا للإقامة وتطوير لوحة (بيوفيلم) التي تتحدى باستمرار الجهاز المناعي المحلية. ونتيجة لذلك، يطور الاستجابة الالتهابية في اللثة، والتي في ظروف معينة يصبح المدمرة - وهي حالة تسمى أمراض اللثة 2. في الأساس، ويمكن تقسيم أمراض اللثة البلاك التي يسببها التهاب اللثة والتهاب اللثة إلى. التهاب اللثة يمثل حالة عكسها من الاستجابة الالتهابية المحلية أن يقتصر على اللثة. التهاب اللثة، من ناحية أخرى، هو عملية تدميرية لا رجعة فيه جهاز مرفق (العظم السنخي، اللثةيتم تدمير الرباط، الملاط واللثة) 3. واقترح اللثة لخدمة المواقع على حد سواء المستجيب كما وحثي خلال أمراض اللثة 4. وقد اقترحت الدراسات أن الإنسان استجابة لوحة الأسنان، وخلايا المستجيب المناعي والجزيئات تسللت بشكل حيوي أو مغادرة اللثة 5-7. وقد تبين هذا النشاط لتلعب دورا رئيسيا في تدمير اللثة 8،9. في حين البيانات التي تولدها هذه الدراسات قدمت معلومات قيمة بخصوص هذه العملية المرضية، والعمل مع الأنسجة البشرية تمتلك القيود الأخلاقية والتقنية والتجريبية الكبرى. تطوير نماذج تجريبية يسمح التجريب السبب والنتيجة عبر استخدام الفئران المعدلة وراثيا والتدخلات في الجسم الحي 10. ونتيجة لذلك، علمنا على الآليات التي تشارك في أمراض اللثة زيادة كبيرة خلال العقدين الماضيين. وحتى مع ذلك، ونظرا لتعقيد أمراض اللثة، وهناكمناقشة جارية بشأن طبيعة الاستجابة المناعية المحلية تسهيل تدمير الأنسجة. هناك أيضا نقص في فهمنا على وظيفة الخلايا المناعية المركزية في اللثة أثناء أمراض اللثة. وبالتالي فمن الضروري دراسة الأحداث التهابات المرضية التي تحدث في النسيج المستهدف لهذا المرض، واللثة.

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum </td><td>Biological Industries</td><td>04-121-1</td><td>Heat Inactivated</td></tr><tr><td>Vacuum-Driven Filter</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &amp;mu;m</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish 35&amp;#215;10 mm</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c antibody</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.2 antibody</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>Clone 104</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>100413</td><td>Clone GK1.5</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a antibody</td><td>Biolegend</td><td>100733</td><td>Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 antibody</td><td>Biolegend</td><td>100214</td><td>Clone 17A2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody</td><td>Biolegend</td><td>118219</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody</td><td>Imgenex</td><td>DDX0362D</td><td>Clone 929F3.01</td></tr><tr><td>Anti-mouse I-A&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt; (MHC-II) antobody</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>Clone 39-10-8</td></tr><tr><td>LSR II Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v 7.6.5</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, processing and analysis of murine gingival cells

لقد قمنا بتطوير تقنية لعزل بدقة ومعالجة الأنسجة اللثوية الفئران لالتدفق الخلوي والدراسات الجزيئية. اللثة هي النسيج فريدة وهامة لدراسة آليات المناعة لأنها تشارك في الاستجابة المناعية المضيف ضد بيوفيلم عن طريق الفم التي قد تسبب أمراض اللثة. وعلاوة على ذلك، وعلى مقربة من اللثة إلى أنسجة العظم السنخي تمكن تدرس أيضا إعادة تشكيل العظام في ظل ظروف التهابات. لدينا وسيلة تعطي كمية كبيرة من الخلايا المناعية التي تتيح تحليل حتى السكان الخلية نادرة مثل خلايا لانغرهانس وخلايا T التنظيمية كما أثبتنا سابقا 1. الفئران التي تستخدم لدراسة الاستجابات المناعية المحلية المعنية في فقدان العظم السنخي خلال أمراض اللثة هو مفيد بسبب توافر مختلف الأدوات المناعية والتجريبية. ومع ذلك، نظرا لصغر حجم وغير مريح نسبيا الوصول إلى اللثة الفئران، تجنب العديد من الدراسات دراسة ثيق الحرجة في الأنسجة. الطريقة الموضحة في هذا العمل يمكن أن تسهل تحليل اللثة، التي نأمل زيادة التفاهم لدينا على الجهاز المناعي عن طريق الفم ودورها خلال أمراض اللثة.

يتم عرض أمثلة على تحليل التدفق الخلوي في خلايا اللثة. تم تشغيل خلايا اللثة المجمعة من 2 فئران في LSR الثاني تدفق عداد الكريات وتحليلها باستخدام FlowJo البرمجيات. أثبتت الشكل 3A توزيع خلايا اللثة من الفئران السذاجة في الجانب مبعثر (SSC) مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) مؤام...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells at JoVE.com

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

توضح هذه الدراسة تقنية فعالة لعزل ومعالجة أنسجة اللثة من تجويف الفم الماوس من أجل إنتاج ثقافة وحيدة الخلية. الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كذلك لتحليل التدفق الخلوي والدراسات الجزيئية.

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

isolation-processing-and-analysis-of-murine-gingival-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.9K Views.  Hebrew University - Hadassah Medical Center. توضح هذه الدراسة تقنية فعالة لعزل ومعالجة أنسجة اللثة من تجويف الفم الماوس من أجل إنتاج ثقافة وحيدة الخلية. الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كذلك لتحليل التدفق الخلوي والدراسات الجزيئية.

Video: Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental pulp tissue, rich in the extracellular matrix, requires a long and tedious dissociation process that is typically beyond the reasonable time for single-cell transcriptomics. For avoiding artificial changes in gene expression, the time elapsed from euthanizing an animal until the analysis of single cells needs to be minimized. This work presents a fast protocol enabling to obtain single-cell suspension from mouse and human teeth in an excellent quality suitable for scRNA-seq (single-cell RNA-sequencing). This protocol is based on accelerated tissue isolation steps, enzymatic digestion, and subsequent preparation of final single-cell suspension. This enables fast and gentle processing of tissues and allows using more animal or human samples for obtaining cell suspensions with high viability and minimal transcriptional changes. It is anticipated that this protocol might guide researchers interested in performing the scRNA-seq not only on the mouse or human teeth but also on other extracellular matrix-rich tissues, including cartilage, dense connective tissue, and dermis.

The current protocol presents a fast, efficient, and gentle method for isolating single cells suitable for single-cell RNA-seq analysis from a continuously growing mouse incisor, mouse molar, and human teeth.

العزل السريع للخلايا المفردة من الفأر والأسنان البشرية

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Developmental Biology

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Biology

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

نموذج قوي المستحثة التي يسببها اللثة Murine لتقييم العدلات عن طريق الفم

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

عزل وثقافة الخلايا الظهارية البشرية الأولية باستخدام Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Bioengineering

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Neuroscience

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

عزل الخلايا العضلية الفطرية من الغدد الفكه البالغة الدمعية

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

<meta charset="utf8"></head><body>عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

Summary

Explore More Videos

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

العزل السريع للخلايا المفردة من الفأر والأسنان البشرية

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

نموذج قوي المستحثة التي يسببها اللثة Murine لتقييم العدلات عن طريق الفم

عزل وثقافة الخلايا الظهارية البشرية الأولية باستخدام Y-27632

تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

عزل الخلايا العضلية الفطرية من الغدد الفكه البالغة الدمعية

عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق

عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق