المؤلفين أشكر جيلبرت الأخضر للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من NIAMS / المعاهد الوطنية للصحة (R01-AR060484) وزارة الدفاع (W81XWH-12-1-0555) منحت لSMY، والمعاهد الوطنية للصحة من (CA92871 U24 U54 وCA151838) منحت لمجان

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا للوائح لجنة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز. 1. بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الإسفار التصوير من الهيكل العظمي الكولاجين إعادة عرض في الجسم الحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصور تفعيل CMP والذيل حقن الوريد في قفص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 110 ميكرولتر من الحل في قفص CMP لكل الماوس (20-30 غرام من الوزن الماوس): 100 ميكرولتر من حل لالجرعات، مع حسم إضافي 10 ميكرولتر سادة لاحتمال خسارة أثناء النقل والحقن. مزيج 11 ميكرولتر من IR680-Ahx-NB (GPO) 9 محلول المخزون (400 ميكرومتر) مع 11 ميكرولتر من 100 ميكرومتر السيستين في حل برنامج تلفزيوني العقيمة، ثم يصبح العدد الإجمالي إلى 110 ميكرولتر حجم المخزن المؤقت مع برنامج تلفزيوني 1X. الحل النهائي الببتيد يحتوي على 4 نانومول من IR680-Ahx-NB (GPO) 9 و 1 نانومول من السيستين في 100 ميكرولتر من الحل برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء withdraث الحل الببتيد إلى الأنسولين حقنة 0.5 مل مع برميل شفافة ومقياس صغير (28-30 G) إبرة، وبعناية إزالة فقاعات الهواء. تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية للسماح للمصباح في عملية الاحماء لمدة 2-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حقنة تحتوي على الببتيد مباشرة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر،&gt; 25 ميغاواط / سم 2) لمدة 5 دقائق للسماح الصور التنشيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، ضع الماوس في كابح تحت مصباح ساخنة؛ تسمية الفأر مع علامة دائمة على الذيل أو أساليب تحديد الهوية الأخرى مثل علامة الأذن أو أخمص القدمين الوشم، وتطهير الذيل مع الكحول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التنشيط للأشعة فوق البنفسجية، وضخ 100 ميكرولتر من تنشيط للأشعة فوق البنفسجية IR680-Ahx-NB (GPO) 9 الحل في الوريد الذيل، وتفضيلي في الجزء الخلفي من الذيل. ضع الماوس مرة أخرى إلى القفص بعد الحقن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NIR التصوير مضان من الكولاجين النشاط إعادة عرض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعةلوحة سخان السرير التصوير من تصوير الدافع إلى 37 درجة مئوية باستخدام بيرل دفعة 2.0 البرمجيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس عارية أو حلق في غرفة التخدير تحريض تحتوي على 2٪ isoflurane والأكسجين في. تحقق من عمق التخدير بواسطة طائرة قلة الحركة أثناء التعامل مع الفأرة وخلال رصد وتيرة التنفس (~ 1/sec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تخدير الماوس، فتح درج بيرل تصوير، ووضع الحيوان على السرير التصوير. بسرعة إزالة مخروط الأنف المكونات، وحرك كمامة الماوس، داخل مخروط الأنف للحفاظ على الماوس تحت التخدير (بنسبة 2٪ isoflurane والأكسجين في تسليمها في 2 لتر / دقيقة عن طريق مخروط الأنف) أثناء عملية التصوير. مرة واحدة على الماوس في مكان، أغلق الدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يشير الصك &quot;جاهزة&quot; على لوحة البرمجيات صورة، انقر فوق &quot;700 قناة&quot;، &quot;الضوء الأبيض&quot; و &quot;85 ميكرون&quot; صناديق تليها &quot;الزر الحصول على صورة&quot;. الجرد الوطني (الإثارة 685 نانومتر، 720 نانومتر الانبعاثات) لوبعد ذلك يتم أخذ صور د الضوء الأبيض باستخدام التركيز التلقائي والتعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال التسجيل، فتح درج، وتحويل الماوس، والحصول على صور من زاوية أخرى. يمكن وضع الماوس مع جبهتها (بطني) والظهر (الظهرية) أو الجانبين التي تواجه الكاميرا. شرائط ضيقة من الشريط يمكن استخدامها كأدوات لتقييد الحرية لتمتد أطرافه للحصول على أفضل عرض من المنطقة ذات الاهتمام (مثل القفص الصدري والكاحلين والمعصمين و). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والوقت المناسب لمراقبة امتصاص العظمي من IR680-CMP ما بين 24-96 ساعة بعد الحقن (HPI)، استنادا إلى الجرعة (~ 4 نانومول / الماوس). للحصول على صور عالية الدقة، التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق بينما بعد 72 HPI، وإزالة الجلد (والشعر) باستخدام ملقط الجراحة ومقص، وصورة من قبل الجرد الوطني مضان كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الصور مضان الجرد الوطني المكتسبة. </li></ol></li></ol> 2. التصور من الكولاجين في الجسم الحي السابقينأقسام الأنسجة؛ 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل من 10٪ (ث / ت) حل جيش صرب البوسنة في الماء منزوع الأيونات. ذوبان الجليد 1 مل من مصل الماعز في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. قطع بضع قطع من parafilm في حجم ما يقرب من 2 سم x 5 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل من حجب العازلة عن طريق خلط 500 ميكرولتر من مصل الماعز، 1 مل من برنامج تلفزيوني 10X و 8.5 مل من الماء منزوع الأيونات. إعداد 5 مل من العازلة CMP التخفيف عن طريق تمييع 50 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) BSA مع 4.45 مل من الماء منزوع الأيونات و 500 ميكرولتر 10X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحلول الأسهم من المسمى carboxyfluorescein قفص CMP، CF NB (GPO) 9 (480 ميكرومتر)، إلى 5 ميكرومتر باستخدام العازلة تخفيف CMP. الأمثل تركيز CMP يختلف 2،5 حتي 30 ميكرومتر، وهذا يتوقف على نوع من الأنسجة وطبيعة عينات الأنسجة. ينصح حجم 100 ميكرولتر لتلطيخ واحد الأنسجة قسم الشريحة. تخزين CMP solut صيغتالأيونات في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للشرائح الأنسجة القرنية الماوس تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. احتضان الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X العازلة لمدة 5 دقائق. تم مسبوقة أنسجة القرنية الماوس المستخدمة في هذه التظاهرة مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني الحل لمدة 1 ساعة، cryopreserved في الأنسجة تيك أكتوبر المتوسطة، cryosectioned إلى 8 سمك ميكرون، والتي شنت على الشرائح الزجاجية المشحونة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلوين الأنسجة والتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح في غرفة ترطيب. إلى كل شريحة، وتطبيق 0.5 مل من عرقلة الحل واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الحل حظر بواسطة النشاف الشرائح على منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق ما يقرب من 100 ميكرولتر من CF NB (GPO) 9 حلول لتغطية أقسام الأنسجة من كل شريحة. احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة للسماح الحل CMP لتتخلل الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية. عندما ارتفعت درجة حرارة المصباح تصل، فضح الأنسجة CMP المغطاة حد ذاتهctions لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 6 دقائق (365 نانومتر، ~ 8 ميغاواط / سم 2) لdeprotect في CMPS في قفص. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وتغطي أقسام الأنسجة من كل شريحة مع قطعة من parafilm لمنع جفاف. وضع الشرائح في غرفة ترطيب واحتضان لهم في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيف 1:3،000 من حل دابي في برنامج تلفزيوني 1X. بعد تلطيخ CMP، وإزالة بلطف Parafilm مع ملقط، وصمة عار على الشرائح على منشفة ورقية لإزالة الحل CMP الزائدة. تطبيق ما يقرب من 100 ميكرولتر من الحلول دابي المخفف إلى كل شريحة الأنسجة واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تلطيخ، تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X العازلة في جرة تلطيخ لمدة 5 دقائق. كرر هذه 3X في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة ليغسل وكلاء تلطيخ غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من تصاعد المتوسطة على قسم الأنسجة وتغطية ذلك مع زلة غطاء زجاجي مع تجنب احتباس فقاعات الهواء. وضع الشرائح في علبة من الورق المقوى شريحة لحمايتها من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">الصورة فروع الكولاجين (قناة FITC) ونوى الخلايا (قناة دابي) في الشرائح الأنسجة باستخدام المجهر مضان. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

كما يمكن أن يرى في هذا البروتوكول، وتسليم CMP واضح وصريح منذ الأشعة فوق البنفسجية تفعيل CMPS قفص هو خطوة إضافية فقط إلى ذيل المشتركة بروتوكولات حقن الوريد 19. والمفتاح هو لحقن تحقيقات الببتيد في دولة واحدة حبلا uncaged ومتبدل الاستقرار. مجموعة قفص يمنع CMP من التجميع الذاتي وملزمة لالكولاجين (الشكل 2B) حتى تتم إزالته بواسطة الأشعة فوق البنفسجية وعند هذه النقطة يبدأ اجتماع الأطراف إلى أضعاف في الحلزون الثلاثي. يحتوي على صياغة حقن السيستين، والتي يمكن أن تتفاعل بسرعة مع المجموعة قفص المشقوق خلال أشعة فوق البنفسجية لتقليل سمية. وقد تم اختبار الفئران عديدة مع سلالات مختلفة (على سبيل المثال SKH-1 و DR-1) باستخدام هذه الصيغة، ونحن لم يكشف أي عيوب الصحة السلوكية أو غيرها في هذه الفئران تصل إلى ستة أشهر. إذا لم الحقن مباشرة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، فإن CMPS أضعاف في اللوالب الثلاثي homotrimeric، التي ليس لها القدرة على التهجينويبين الشكل 2C حالة متطرفة حيث قبل الحقن وCMPS تم تجميعها بالكامل في اللوالب ثلاثة أضعاف بحلول وقت التأخير الطويل (&gt; 2 أيام). للتحايل على هذه المشكلة، ينبغي إعداد الحل CMP في تركيز منخفض نسبيا (على سبيل المثال ~ 40 ميكرومتر)، وحقنها في الفئران مباشرة بعد الأشعة فوق البنفسجية decaging. بسبب الحلزون الثلاثي المعدل البطيء للطي من CMPS في ظروف المخففة (نصف وقت طوي ثانية:&gt; 50 دقيقة) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية قصيرة والوقت الحقن (5 ~ 7 دقائق الكل)، فإن معظم CMPS تدخل إلى مجرى الدم في واحد حبلا النموذج عند ويتبع هذا البروتوكول. ومن المتوقع أن تظل كما خيوط واحد مرة واحدة حقن، CMPS، كما يتم تقليل تركيز من قبل عامل من 20 في بركة الدم، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في معدل اعادة 18. إذا تأخر حقن (على سبيل المثال بسبب التعامل مع الحيوانات) ويشتبه طوي ثانية homotrimeric، الببتيدات تجميعها جزئيا يمكن تنشيطها عن طريق التسخين إلى أعلى من 7076؛ C ليفرق بين CMPS لفروع واحدة، تليها التبريد السريع والحقن. على الرغم من أن أقل ملاءمة، مثل CMPS-فصل الحرارة أيضا تظهر نتائج في الجسم الحي تستهدف (الشكل 2D) المتوقع. في هذه المظاهرة، واستخدمت الفئران عارية عن قوائم الجرد الوطنية التصوير مضان لتصل إلى 50٪ من إشارة الجرد الوطني يمكن حظره من قبل الشعر. عند العمل مع نماذج الماوس الشعر (وخصوصا منها مع الشعر الأسود)، ونحن نوصي حلق الماوس في المنطقة ذات الاهتمام قبل التصوير باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية أو مزيل الشعر. في الشكل 1، وهناك إشارات إيجابية كاذبة من منطقة البطن الحيوان، والذي كان سببه لصناعة السيارات في مضان من الكلوروفيل في النظام الغذائي للحيوانات. إشارات خلفية مثل هذه يمكن ان تخفض بشكل كبير عن طريق التحول الماوس لحمية تنقية ما يقرب من 4 أيام قبل التصوير. كما رأينا في أرقام 1 و 2A، هناك امتصاصات CMP قوي في زيادة ونقصان الذيله. لذا، لتجنب الآثار الناتجة عن الكمال حقن الوريد الذيل، نوصي طريق الحقن في الجزء الخلفي من الذيل بحيث لا يتم القبض موقع الحقن في الصورة مضان. اجتماع الأطراف المسمى تمكن استهداف والتصوير من مواقع محددة من الكولاجين في الجسم الحي إعادة التي يصعب الكشف باستخدام طرق أخرى. على سبيل المثال، الدم والبول المقايسات مقرها ELISA-حساسة للالمشقوق شظايا الكولاجين telopeptide، ولكن الأسلوب لا يمكن توطين مصدر دوران الكولاجين، لأنه يستهدف مستضدات للذوبان. وصفت القيود الرئيسية للفي الجسم الحي باستخدام تقنية التصوير الجرد الوطني CMPS هي العمق من الاختراق التوهين والتبريد بواسطة الداني تجميع خلايا الدم الحمراء الهيموجلوبين كما هو فاكهه تقضي الذاتية لل680/710 نانومتر الأصباغ الجرد الوطني. وتشمل التطبيقات المستقبلية من CMP في الجسم الحي التصوير SPECT أو PET التصوير باستخدام CMPS المسمى مع النويدات المشعة التي ينبعث منها أشعة غاما مباشرة أو بوزيترون مع EMItters، للتشخيص من الحالات المرضية التي تنطوي على إعادة تشكيل الكولاجين (مثل هشاشة العظام والتهاب المفاصل وتصلب الشرايين، والتليف). وهذه النظير CMP المسمى الراديو القضاء على القيود المفروضة على فقدان إشارة بسبب عمق الأنسجة وجود خلايا الدم الحمراء المجمعة، وسوف تسمح القياسات الكمية من الأنسجة المريضة. يمكن بالإضافة إلى ذلك، ووقت التصوير في وقت متأخر نسبيا (مثلا 48-96 HPI) الناتجة عن إزالة بطيئة ملزمة وCMPS تجعل من الصعب لمتابعة التغيرات السريعة في إعادة عرض الكولاجين. ويمكن التغلب على مثل هذا التقييد عن طريق زيادة هندسة حركية ملزمة وتقارب من وكلاء التصوير CMP. منذ CMP بربط الكولاجين التشويه والتحريف التي لديها بنية قليلا، والتصوير الكولاجين مقرها CMP-مكملة للجيل الثاني متناسق المجهري التي لا يمكن إلا صورة ألياف الكولاجين 5. عندما تلطيخ أقسام الأنسجة مع fluorescently المسمى CMPS، وجدنا أنه من المفيد لاحتضانعينات في حلول الببتيد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية في 4 درجات مئوية، لأنه سهل التهجين حلزونية ثلاثية في درجة حرارة أقل 1،20. ووجد أيضا أن تخبط الشرائح العازلة في برنامج تلفزيوني جديد في جرة تلطيخ هي الطريقة الأكثر فعالية ليغسل CMPS غير منضم، والتي تعمل على نحو أفضل بكثير من مجرد pipetting لغسل مخازن على العينات. التهجين CMP-الكولاجين حبلا غير محددة للغاية وقوية، وبالتالي بروتوكول تلطيخ بسيطة المعروضة في هذا الفيديو يمكن تعديلها بسهولة لcostaining المؤشرات الحيوية إضافية، وتحديد الكولاجين المتدهورة في أقسام الأنسجة غير المثبتة. هذا هو بديل فعالة ومريحة لاستخدام الأجسام المضادة للالكولاجين الكولاجين للكشف عن ليفي في عينات نسيجية مختلفة.

الكولاجين، البروتين الأكثر وفرة في الثدييات، ويلعب دورا حاسما في التنمية الأنسجة وتجديدها من خلال دعم انتشار وتمايز الخلايا. بينما الكولاجين الليفية (مثل النوع الأول والثاني)، في الأنسجة الضامة تعطي القوة الميكانيكية للأنسجة، والكولاجين، مثل شبكة (النوع الرابع) تشكل سقالة الأساسية من الغشاء القاعدي حيث تعلق الخلايا والأنسجة تشكيل المنظمة. إعادة عرض الكولاجين تشمل كلا تدهور الكولاجين (بواسطة البروتياز) والتوليف (التي يروج لها عوامل النمو). على الرغم من أن إعادة عرض الكولاجين، على سبيل المثال في العظام، هو جزء من عملية طبيعية تجديد الأنسجة، وإعادة النشاط الزائد، أو وقوعه في أماكن غير طبيعية، ويشير عادة التئام الجروح استجابة لإصابة أو الحالات المرضية المزمنة مثل السرطان وهشاشة العظام والتهاب المفاصل، و التليف 1-4. القدرة على مباشرة الكولاجين الصورة فيخضع لعمليات المجراة يمكن أن يؤدي إلى فهم التقدمايون من هذه الأمراض، وكذلك التشخيص والعلاجات الجديدة. على سبيل المثال، يمكن تصوير حي تقديم معلومات عن شدة وموقع من الأمراض، ويمكن أن تستخدم أيضا لتقييم فعالية وكلاء علاجية جديدة. طبقت Multiphoton مسح بالليزر المجهري والجيل الثاني التوافقي لالكولاجين الصورة ييفي لرصد خارج الخلية مصفوفة إعادة عرض في الورم في الفئران الحية 5. ولكن، هذا الأسلوب يتطلب الحيوانات لتركيبها مع شفافة غرف الظهرية ثنية الجلد، والذي هو إجراء الغازية. والتصوير المباشر وموسع الكولاجين إعادة الاستفادة من التحقيق الذي يستهدف على وجه التحديد الكولاجين فيخضع لعمليات. هذا التحقيق من الصعب إعداد لأنها تحتاج للتمييز بين إعادة عرض الكولاجين من الكولاجين سليمة وناضجة، والتي هي وفرة في الأنسجة الطبيعية 6. يرصد الكولاجين تتكون من بنية البروتين نادرة للغاية يسمى الحلزون الثلاثي، الذي هوالمشقوق بواسطة البروتياز مثل مصفوفة metalloproteinases (MMP) خلال إعادة عرض الكولاجين. شظايا الكولاجين المشقوق تفقد بنية حلزونية ثلاثية وتصبح فروع تكشفت (الجيلاتين)، والتي يتم هضمها مزيدا من البروتياز غير محدد 1. وقد اكتشف مؤخرا أن الببتيد الكولاجين المحاكاة (CMP) الذي لديه الميل إلى أضعاف في بنية حلزونية ثلاثية يمكن أن تستهدف على وجه التحديد فروع الكولاجين التي تنفصل عن حالته حلزونية ثلاثية إما عن طريق الحرارة أو عن طريق تمسخ تدهور الأنزيمية 1،7. الربط هو مدفوعة أساسا عن طريق الثلاثي الحلزون التهجين بين CMPS أحادى وفروع الكولاجين التشويه والتحريف. لأن CMPS تجميع الذاتي في اللوالب الثلاثي homotrimeric في درجة حرارة الغرفة مع القوة الدافعة قليلا عن التهجين الكولاجين، وهو CMP قفص [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4، وتسمى NB (GPO) 9، O: الهيدروكسي برولين]، وقد وضعت ، والذي يحتوي على الصورة nitrobenzyl-شطورةمجموعة (NB) تعلق على الجلايسين المركزية للالببتيد. مجموعة قفص NB sterically يمنع CMP من للطي في الحلزون الثلاثي، ومع ذلك، إزالة مجموعة القفص بواسطة الأشعة فوق البنفسجية على الفور بتشغيل لطي حلزونية ثلاثية والكولاجين التهجين 1. عندما يتم تسليم CMPS أحادى المسمى مع قرب الأشعة تحت الحمراء (الجرد) fluorophores منتظم لنموذج الفئران، فإنها يمكن أن تستهدف على وجه التحديد والسماح في مجال التصوير المجراة من التشويه والتحريف الكولاجين في الأنسجة تمر العادي (على سبيل المثال في العظام والغضاريف) والمرضية (على سبيل المثال في الأورام) إعادة عرض 1 . ويمكن أيضا CMPS fluorescently المسمى استخدامها لتصوير الكولاجين في أقسام الأنسجة النسيجية. في دراسة نسيجية، وغالبا ما يتم الاحتفاظ الأنسجة تحصد التثبيت للحفاظ على المكونات الخلوية والأنسجة التشكل الشاملة من التدهور. إجراءات التثبيت، والتي تشمل الحرارة، والعلاج مع المذيبات العضوية والكيميائية عبر ينكينز الكواشف (مثل امتصاص العرق)، تفسد بنية حلزونية ثلاثية الكولاجين 8. هذا تمسخ يولد مواقع لCMP التهجين. وقد تبين أن CMPS fluorescently المسمى يمكن ربط خصيصا لالكولاجين في أقسام الأنسجة الثابتة (مثل الجلد والقرنية، والعظام) أكثر فعالية من الأضداد المضادة للالكولاجين، مما سمح بتحديد السهل ظروف مرضية في أنسجة الكبد متليفة 9. اجتماع الأطراف تستهدف التشويه والتحريف التي تحتوي على الكولاجين فروع تسلسل الأحماض الأمينية من زخارف حلزونية الثلاثي، وهو أمر شائع في كل أنواع الكولاجين. لذا CMP يمكن اعتباره واسعة الطيف وكيل الكولاجين تلطيخ. هنا، نقدم إجراءات تجريبية مفصلة لط) التصوير فروع الكولاجين في الجسم الحي والتشويه والتحريف ب) تصور الكولاجين في الجسم الحي السابقين أقسام الأنسجة باستخدام CMPS قفص fluorescently المسمى. العلامة الجرد الوطني، IR680، كان مترافق إلى CMP قفص للتصوير الحي، حين إلىتم استخدام البريد carboxyfluorescein (CF) في أنسجة العمل تلطيخ لتوافقه مع المجاهر مضان القياسية. ويركز هذا البروتوكول على تطبيق التصوير من CMPS ما يتعلق منها إعادة عرض الكولاجين. طرق CMP التوليف يمكن العثور عليها في التقارير السابقة 1،7،9-15. في هذا التقرير والفيديو، وقد تم اختيار الهيكل العظمي الأنسجة التصوير في الفئران العادية وأقسام الأنسجة القرنية من الماوس لغرض التظاهر، ولكن الأساليب المقدمة هنا يمكن تطبيقها بسهولة إلى العديد من الأمراض البيولوجية التي تنطوي على نماذج وإعادة عرض الكولاجين (مثل الأورام، والتئام الجروح)، و كذلك أي عينة الأنسجة تقريبا مسبوقة يحتوي الكولاجين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

الكولاجين هو عنصر هيكلية رئيسية من المصفوفة خارج الخلية التي تدعم تشكيل الأنسجة والصيانة. على الرغم من أن إعادة عرض الكولاجين هو جزء لا يتجزأ من تجديد الأنسجة الطبيعية، وتشارك كمية زائدة من النشاط إعادة عرض في الأورام، والتهاب المفاصل، والعديد من الحالات المرضية الأخرى. خلال إعادة عرض الكولاجين، تعطل بنية حلزونية ثلاثية من جزيئات الكولاجين بواسطة البروتياز في البيئة خارج الخلية. بالإضافة إلى ذلك، الكولاجين الموجودة في العديد من عينات الأنسجة النسيجية والتشويه والتحريف جزئيا عمليات التثبيت والحفظ. لذا، يمكن لهذه الخيوط الكولاجين التشويه والتحريف خدمة أهداف اعتبارا للتصوير البيولوجية. وضعنا سابقا في قفص الببتيد الكولاجين المحاكاة (CMP) التي يمكن أن تكون لهجن مع فروع الكولاجين التشويه والتحريف من خلال تشكيل بنية حلزونية ثلاثية، والتي هي فريدة من نوعها لالكولاجين أثار الصورة. الأهداف العامة من هذا الإجراء هي ط) لصورة خيوط الكولاجين التشويه والتحريف صesulting من أنشطة إعادة طبيعية في الجسم الحي، والثاني) لتصور الكولاجين في الجسم الحي السابقين أقسام الأنسجة باستخدام CMPS قفص أثار الصورة. لتحقيق التهجين فعالة وناجحة في الجسم الحي وخارج الحي والتصوير، وCMPS قفص fluorescently المسمى إما مباشرة قبل الحقن في الوريد تنشيط الصورة، أو يتم تفعيلها مباشرة على أقسام الأنسجة. يتم تصوير العادي remolding الكولاجين الهيكل العظمي في الفئران والكولاجين عارية في الماوس مسبوقة أقسام الأنسجة القرنية في هذا الإجراء. طريقة التصوير التي تعتمد على تقنية التهجين CMP-الكولاجين المقدمة هنا يمكن أن يؤدي إلى فهم أعمق لعملية إعادة عرض الأنسجة، وكذلك السماح تطوير وسائل التشخيص الجديدة لأمراض المرتبطة الكولاجين عالية النشاط التجديد.

ويبين الشكل 1 نتيجة نموذجية لكيفية توزع IR680-Ahx (GPO) أثار الصورة 9 في SKH1 صحية الإناث الماوس عارية بعد الحقن آخر 24-96 ساعة. فإنه يدل على تراكم CMP الواضح في الهيكل العظمي بعد 24 HPI، وعند هذه النقطة أكثر من الببتيدات غير منضم تم تطهيرها إلى حد كبير. عملية CMP التهجين مع فروع إعادة عرض الكولاجين يبدو بطيئا نسبيا، وخصوصا في المقابل إلى غيرها من تحقيقات التصوير الببتيد (مثل RGD 16). هذا على الأرجح هو بسبب معدل لطي بطء الحلزون الثلاثي الكولاجين 17،18. ومع ذلك، مرة واحدة المهجنة، وفروع CMP ملزمة بقوة إلى الأنسجة كولاجيني، كما يعتبر الحد من إشارة طفيفة فقط بعد 24 HPI (الشكل 1). في 96 HPI، الصورة الجرد الوطني مضان من الفأرة بعد إزالة الجلد يدل بوضوح على امتصاص العظمي من IR680-Ahx (GPO) 9 في العمود الفقري والأضلاع، وكذلك داخل الركبتين والكاحلين والمعصمين، والفك السفلي السفلي (الشكل 2A). في فيفو السابقين الأنسجة تلطيخ، أثار الصورة fluorescently المسمى-CMPS قفص هجن خصيصا لفروع الكولاجين التشويه والتحريف في أقسام الأنسجة. في الشكل 3، CMP تلطيخ يكشف بوضوح غرامة الألياف الكولاجين موازية في سدى القرنية، والذي يدل على استخدامه كعامل تلطيخ محددة الكولاجين. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> الشكل 1. المسلسل الصور مضان الجرد الوطني للماوس عارية تدار عن طريق الوريد مع الصورة decaged IR680-Ahx (GPO) 9 تظهر امتصاص الهيكل العظمي على مدى أربعة أيام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:contenتي العرض = &quot;4IN&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. الصور مضان الجرد الوطني من الفئران التي تديرها مع الصورة decaged IR680-Ahx (GPO) 9 (A)، في قفص IR680-Ahx-NB (GPO) 9 دون التعرض للأشعة فوق البنفسجية (B)، prefolded الثلاثي حلزونية [IR680-Ahx (GPO ) 9] 3 (C)، أو فصل الحرارة واحدة حبلا IR680-Ahx (GPO) 9 (D) في 96 HPI بعد إزالة الجلد. استهداف الهيكل العظمي من قبل CMP لا يمكن إلا أن الملاحظ في A و D. وترد إشارات مضان الجرد الوطني في نطاق قوس قزح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> الرقم 3. الميكروسكوب مضان من شارك الماوسقسم الأنسجة rneal مسبوقة في امتصاص العرق، وملطخة دابي وأثار الصورة CF (GPO) 9 باستخدام بروتوكول 2، وعرض سدى كولاجيني كثيفة (الملون بواسطة CMP، باللون الأخضر) وكذلك ظهارة البطانة الخلوية و(الملون بواسطة دابي، في الزرقاء () شريط مقياس: 100 ميكرون).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

يوضح هذا الإجراء في الجسم الحي بالقرب من الأشعة تحت الحمراء التصوير مضان من أنشطة إعادة عرض الكولاجين في الفئران وكذلك فيفو السابقين تلطيخ من الكولاجين في أقسام الأنسجة باستخدام قفص الكولاجين الببتيدات المحاكاة التي يمكن أن تكون تسببت الصورة لهجن مع فروع الكولاجين التشويه والتحريف.

التصوير مبدل طبيعة الكولاجين السواحل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; و<em&gt; خارج الحي</em&gt; عن طريق التهجين أثار صور من المحاكاة محبوس الكولاجين الببتيدات

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

imaging-denatured-collagen-strands-vivo-ex-vivo-via-photo-triggered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.8K Views.  University of Utah.  يوضح هذا الإجراء في الجسم الحي بالقرب من الأشعة تحت الحمراء التصوير مضان من أنشطة إعادة عرض الكولاجين في الفئران وكذلك فيفو السابقين تلطيخ من الكولاجين في أقسام الأنسجة باستخدام قفص الكولاجين الببتيدات المحاكاة التي يمكن أن تكون تسب...

Video: Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

تصنيع الأنسجة الصغيرة باستخدام وحدات من الخلايا التي تحتوي على الكولاجين جل

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

عالية الدقة 3D تصوير السابقين فيفو العينات البيولوجية بواسطة CT مايكرو

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

خارج الحي تقليد تكون الدم الإنسان العادية وغير العادية

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

الفيروسية النانوية ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير ورم

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

في تركيب المختبر من تباعد الليفية الأصلية، طويل والقطاعي الكولاجين تباعد طويل

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب في أجهزة ميكروفلويديك لMicrotissue لتحقيق الاستقرار

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

قياس القياس فيبريلار منظمة الكولاجين مع Curvelet تحويل القائم على أدوات

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

The chicken embryo and the blood-vessel rich chorioallantoic membrane (CAM) is a valuable in vivo model to investigate biomedical processes, new ultrasound pulsing schemes, or novel transducers for contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery. The reasons for this are the accessibility of the embryo and vessel network of the CAM as well as the low costs of the model. An important step to get access to the embryo and CAM vessels is to take the egg content out of the eggshell. In this protocol, three methods for taking the content out of the eggshell between day 5 and&#160;8 of incubation are described thus allowing the embryos to develop inside the eggshell up to these days. The described methods only require simple tools and equipment and yield a higher survival success rate of 90% for 5-day, 75% for 6-day, 50% for 7-day, and 60% for 8-day old incubated eggs in comparison to ex ovo cultured embryos (~50%). The protocol also describes how to inject cavitation nuclei, such as microbubbles, into the CAM vascular system, how to separate the membrane containing the embryo and CAM from the rest of the egg content for optically transparent studies, and how to use the chicken embryo and CAM in a variety of short-term ultrasound experiments. The in vivo&#160;chicken embryo and CAM model is extremely relevant to investigate novel imaging protocols, ultrasound contrast agents, and ultrasound pulsing schemes for contrast-enhanced ultrasound imaging, and to unravel the mechanisms of ultrasound-mediated drug delivery.

This protocol describes three methods on how to obtain and use 5 to 8-day old chicken embryos and their chorioallantoic membrane (CAM) as an in vivo&#160;model to study contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery.

تحضير أجنة الدجاج ex ovo والأوعية الغشائية المشيمية كما هو الحال في نموذج الجسم الحي للتصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين ودراسات توصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة