Die Autoren bedanken sich Gilbert Grün für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIAMS / NIH (R01-AR060484) und DOD (W81XWH-12-1-0555), um SMY ausgezeichnet und vom NIH (U24 und U54 CA92871 CA151838) zu vergeben MGP unterstützt

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Johns Hopkins Animal Care und Verwenden Ausschuss vorgenommen. 1. Nah-Infrarot (NIR)-Fluoreszenz-Imaging von Skelett Kollagen Remodeling In-vivo- <ol><li> Photo-Aktivierung der Käfig CMP und Schwanzveneninjektion <ol><li> Bereiten Sie 110 ul Käfig CMP-Lösung für jede Maus (20-30 g Mausgewicht): 100 ul Lösung zum Dosieren, mit einem zusätzlichen 10 ul Kissen für den möglichen Verlust bei der Übertragung und Einspritzung. Mischen Sie 11 ul IR680-Ahx-NB (GPO) 9 stock-Lösung (400 uM) mit 11 ul 100 uM Cystein in sterile PBS-Lösung, dann bringen Sie das Gesamtvolumen auf 110 ul mit 1x PBS-Puffer. Die endgültige Peptid-Lösung enthält 4 nmol IR680-Ahx-NB (GPO) 9 und 1 nmol Cystein in 100 ul 1x PBS-Lösung. </li><li> Langsam withdraw der Peptid-Lösung in einer 0,5 ml Insulinspritze mit transparentem Schaft und einem kleinen Messgerät (28-30 G) Nadel und vorsichtig die Luftblasen. Schalten Sie die UV-Lampe, um die Lampe zum Aufwärmen für 2-5 min. </li><li> Legen Sie die peptidhaltige Spritze direkt unter der UV-Lampe (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) für 5 min auf Foto-Aktivierung zu ermöglichen. </li><li> Inzwischen, positionieren Sie die Maus in einem Rückhalte unter einem beheizten Lampe; beschriften Sie die Maus mit einem Permanentmarker auf den Schwanz oder andere Identifikationsmethoden wie Ohrmarke oder Zehen Tätowierung, und desinfizieren den Schwanz mit 70% Alkohol. </li><li> Unmittelbar nach der UV-Aktivierung, injizieren 100 ul UV-aktivierten IR680-Ahx-NB (GPO) 9-Lösung in die Schwanzvenen, bevorzugt an den hinteren Teil des Schwanzes. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig nach der Injektion. </li></ol></li><li> NIR-Fluoreszenz-Imaging von Kollagen Remodeling Aktivität <ol><li> Setdie Heizplatte der Abbildungsschicht des Abbildungsimpuls bis 37 ° C unter Verwendung von Perlen Impulse 2.0-Software. </li><li> Setzen Sie die nackt oder rasierte Maus in die Narkose Kammer mit 2% Isofluran in Sauerstoff. Verifizierung der Narkosetiefe-Ebene durch fehlende Bewegung der Maus während der Handhabung und durch Überwachen der Frequenz der Atmung (~ 1/sec). </li><li> Nachdem die Maus narkotisiert, öffnen Sie die Perle Imager Schublade, und legen Sie das Tier auf dem Aufnahmebett. Schnelles Entfernen der Nasenkegel Stecker, und schieben Sie die Maus Mündung in der Nase Kegel, um die Maus in Narkose (um 2% Isofluran in Sauerstoff bei 2 l / min durch die Nase Kegel geliefert) während des Abbildungsprozesses zu halten. Sobald die Maus vorhanden ist, schließen Sie die Schublade. </li><li> Wenn das Gerät zeigt &quot;ready&quot; auf dem Image-Software-Panel, klicken Sie auf die &quot;700-Kanal&quot;, &quot;weißes Licht&quot; und &quot;85 Mikrometer&quot;-Boxen, gefolgt von der &quot;Bild erwerben&quot; klicken. NIR (Anregung 685 nm, Emission 720 nm) eind Weißlicht-Fotos werden dann mit Hilfe der automatischen Fokussierung und Belichtung genommen werden. </li><li> Wenn die Aufnahme beendet ist, öffnen Sie die Schublade, drehen Sie die Maus, und die Bilder aus einem anderen Winkel zu erwerben. Die Maus kann mit seinem vorderen (ventralen), Rücken (dorsal) oder an den Seiten vor der Kamera platziert werden. Schmale Streifen Klebeband verwendet werden, wie Fesseln um seine Gliedmaßen strecken, um den besten Blick auf die Region von Interesse (zB Brustkorb, Knöchel und Handgelenke) erhalten werden. </li><li> Eine richtige Zeit, um Skelett Aufnahme von IR680-CMP beobachten, ist zwischen 24 bis 96 Stunden nach der Injektion (hpi), bezogen auf die Dosierung (~ 4 nmol / Maus). Um hochauflösende Bilder zu erwerben, zu opfern, die Maus durch Genickbruch während unter tiefer Narkose nach 72 hpi, entfernen Sie die Haut (und Haar) mit chirurgischen Pinzette und Schere, und Bild es durch NIR-Fluoreszenz wie oben beschrieben. </li><li> Analysieren Sie die erworbenen NIR-Fluoreszenzbilder. </li></ol></li></ol> 2. Visualisierung der Kollagene in der Ex-vivo-0; Gewebeschnitte <ol><li> Materialaufbereitung <ol><li> Herstellung von 1 ml 10% (w / v) BSA-Lösung in entionisiertem Wasser. Auftauen 1 ml Ziegenserum in einem Wasserbad bei Raumtemperatur. Schneiden Sie ein paar Stücke von Parafilm in der Größe von ca. 2 cm x 5 cm. </li><li> Vorbereitung 10 ml Blockierungspuffer durch Mischen von 500 &amp;mgr; l Ziegen-Serum, 1 ml 10-fach PBS und 8,5 ml entionisiertem Wasser. Vorbereitung 5 ml CMP-Verdünnungspuffer durch Verdünnung von 50 ul 10% (w / v) BSA mit 4,45 ml entionisiertes Wasser und 500 &amp;mgr; l 10 × PBS. </li><li> Verdünnen Stammlösungen von Carboxy-markierten caged CMP, CF NB (GPO) 9 (480 uM), bis 5 uM mit dem CMP-Verdünnungspuffer. CMP optimale Konzentration variiert von 2,5 bis 30 &amp;mgr; M, abhängig von der Art des Gewebes und der Art der Gewebeproben. Ein Volumen von 100 &amp;mgr; l für die Färbung einer Gewebesektion Schieber empfohlen. Bewahren Sie das formuliert CMP SOLUTIonen in der Dunkelheit. </li><li> Lassen Sie die Maushornhautgewebe gleitet ins Gleichgewicht auf Raumtemperatur. Die Folien Inkubation in 1x PBS-Puffer für 5 min. Die in diesem Beispiel verwendeten Maus Hornhaut Gewebe wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS-Lösung für 1 h, kryokonserviert in Tissue-Tek Oktober mittel, bis 8 um Dicke kryogeschnitten vorangestellt worden ist, und auf Glasobjektträger geladen montiert. </li></ol></li><li> Gewebefärbung und Imaging <ol><li> Objektträger in einer feuchten Kammer. Zu jeder Folie, gelten 0,5 ml Blockierlösung und Inkubation der Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Blocking-Lösung durch Abtupfen die Folien auf einem Papiertuch. </li><li> Bewerben etwa 100 ul CF NB (GPO) 9 Lösungen, um die Gewebeschnitte der einzelnen Folien abzudecken. Die Objektträger für 2 min inkubiert, damit der CMP-Lösung, um das Gewebe zu durchdringen. </li><li> Schalten Sie die UV-Lampe. Wenn die Lampe aufgewärmt ist, setzen die CMP-Gewebe bedeckt sections dem UV-Licht für 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2), um die Käfig CMPs entschützen. Nach der UV-Exposition, decken die Gewebeschnitte der einzelnen Folien mit einem Stück Parafilm Austrocknen zu verhindern. Objektträger in der feuchten Kammer inkubiert und diese bei 4 ° C für 2 Stunden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:3000 DAPI-Lösung in 1x PBS. Nach CMP-Färbung, entfernen Sie vorsichtig die Parafilm mit einer Pinzette, und tupfen Sie die Folien auf einem Papiertuch, um überschüssige CMP-Lösung zu entfernen. Gelten etwa 100 ul verdünnte Lösungen DAPI jedem Gewebe Schlitten und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Färbung, tauchen die Folien in 1x PBS-Puffer in einer Küvette für 5 min. Wiederholen Sie diesen 3x in frischem 1x PBS zu waschen ungebundenen Färbemittel. </li><li> Einen Tropfen Eindeckmedium auf dem Gewebeschnitt und decken Sie es mit einem Deckglas unter Vermeidung von Luftblasen. Legen Sie die Folien in einem Karton Diamagazin, um sie vor Licht zu schützen. </li><li>Bild die Kollagenstränge (FITC Kanal) und Zellkerne (DAPI-Kanal) in den Gewebeschnitten mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wie in diesem Protokoll zu erkennen ist, ist die Lieferung von CMP einfach, da die UV-Aktivierung der photoaktivierbaren CMP ist die einzige zusätzliche Schritt den gemeinsamen Schwanzveneninjektion Protokolle 19. Der Schlüssel ist, um die Peptid-Sonden in einem metastabilen uncaged und Einzelstrang-Zustand zu injizieren. Der Käfig verhindert, dass CMP Gruppe von Selbstorganisation und der Bindung an Kollagene (2B), bis sie durch UV-Licht, an welcher Stelle der CMP beginnt, in Dreifach-Helix falten wird entfernt. Die Injektion Formulierung enthält Cystein, das schnell mit der Gruppe gespalten Käfig bei UV-Bestrahlung reagieren können, um die Toxizität zu minimieren. Zahlreiche Mäuse mit verschiedenen Stämmen (zB SKH-1 und DR-1) wurden unter Verwendung dieser Formulierung getestet und wir konnten keine Verhaltens-oder andere gesundheitliche Mängel in diesen Mäusen erkennen, bis zu sechs Monate. Wenn die Injektion nicht unmittelbar nach UV-Exposition zu folgen, wird die CMPs in homotrimeres Dreifachhelices falten, die keine Hybridisierung Kapazität. 2C zeigt einen extremen Fall, in dem vor der Injektion die CMPs wurden vollständig in Triple-Helices durch lange Verzögerungszeit (&gt; 2 Tage) wieder zusammengesetzt. Um dieses Problem zu umgehen, sollte CMP-Lösung in relativ niedriger Konzentration (z. B. ~ 40 &amp;mgr; M) hergestellt werden, und unmittelbar nach der UV-decaging in die Mäuse injiziert. Aufgrund der langsamen Dreifachhelix Klapprate der CMPs in verdünnter Bedingungen (Halbzeit der Rückfaltung:&gt; 50 min) und der kurzen UV-Exposition und Einspritzzeit (5 ~ 7 Minuten insgesamt), die meisten der CMPs in die Blutbahn im Einzel Strang bilden, wenn dieses Protokoll gefolgt. Nach der Injektion CMPs werden erwartet, um als Einzelstränge bleiben, da die Konzentration um den Faktor 20 in der Blut-Pool reduziert, was zu dramatischen Reduzierung der Zusammenbau Rate 18. Wenn Einspritzung verzögert wird (z. B. durch Behandlung der Tiere) und homotrimeren Rückfaltung vermutet wird, die teilweise zusammengesetzten Peptide können durch Erwärmen über 70 reaktiviert76; C, um die CMPs um Einzelstränge, gefolgt von Aufforderung Kühlung und Einspritzung zu distanzieren. Obwohl weniger bequem, wie Wärme-dissoziiert CMPs zeigen auch die erwarteten Ergebnisse der in-vivo-Targeting (2D). In dieser Demonstration wurden Nacktmäusen für NIR-Fluoreszenzbildgebung verwendet werden, da bis zu 50% des NIR-Signals durch Haar blockiert werden. Bei der Arbeit mit haarige Maus-Modellen (vor allem die, die mit schwarzen Haaren), empfehlen wir Rasieren der Maus in die Region von Interesse vor der Bildgebung mit einem elektrischen Rasierer oder Haar Entferner. In Fig. 1 sind falsch positive Signale von Bauchbereich des Tieres, die von Autofluoreszenz der Chlorophylle in der Tierernährung verursacht wird. Solche Hintergrundsignale können durch Umschalten der Maus gereinigt Diäten etwa 4 Tage vor der Bilderzeugung erheblich gesenkt werden. Wie in den 1 und 2A zu sehen ist, gibt es starke CMP Aufnahmen im TrudelnE. Deshalb, um Artefakte aus unvollkommenen Schwanzvene Injektionen zu vermeiden, empfehlen wir die Injektion am hinteren Teil des Schwanzes, so dass die Injektionsstelle nicht im Fluoreszenzbild eingefangen. Das markierte CMP ermöglicht Targeting und Bildgebung von bestimmten Orten von Kollagen Umbau in vivo, die schwer zu erkennen, mit anderen Methoden. Zum Beispiel die ELISA-basierten Blut-und Urintests sind empfindlich für Kollagen-Telopeptid gespaltenen Fragmente, aber das Verfahren kann die Quelle des Kollagen Umsatz nicht lokalisieren, da es zielt löslichen Antigenen. Die Haupteinschränkungen der in vivo Bildgebungsverfahren unter Verwendung von NIR-markierten CMPs sind Tiefenpenetrationsdämpfung und Dämpfung durch proximale gepoolt Erythrozyten Hämoglobin ist ein endogener Quencher von 680/710 nm NIR-Farbstoffe. Zukünftige Anwendungen von CMP in-vivo-Bildgebung sind SPECT-oder PET-Bildgebung mit CMPs mit direktem gamma-emittierende Radionuklide oder Positronen mit emi beschriftettters für diagnostische Krankheitszuständen, die Kollagen Umbau (z. B. Osteoporose, Arthritis, Atherosklerose und Fibrose). Diese radioaktiv markierten CMP-Analoga werden die Grenzen der Signalverlust durch Gewebetiefe und Präsenz von gepoolten roten Zellen zu beseitigen, und die quantitativen Messungen von erkranktem Gewebe zu ermöglichen. Darüber hinaus ist die relativ spät Belichtungszeit (zB 48-96 hpi), die aus dem langsamen Bindungs ​​und die Räumung von CMPs könnte es schwierig machen, auf schnelle Veränderungen in Kollagen Umbau folgen. Diese Einschränkung könnte durch weitere Engineering der Bindungsaffinität von Kinetik und CMP-Bildgebungsmittel überwunden werden. Seit CMP bindet an denaturierte Kollagene, die wenig Struktur haben, ist der CMP-basierten Kollagen Bildgebung zur Erzeugung der zweiten Harmonischen Mikroskopie, die nur Bildkollagenfasern können 5 komplementär. Wenn Färbung Gewebeschnitte mit fluoreszenzmarkierten CMPs, fanden wir es von Vorteil, die InkubationProben für die UV-aktivierte Peptidlösungen bei 4 ° C, weil der dreifach helikalen Hybridisierung bei niedriger Temperatur 1,20 erleichtert. Es wurde auch festgestellt, dass das Eintauchen der Objektträger in frischem PBS-Puffer in einer Küvette ist der effektivste Weg, um abzuwaschen ungebundenen CMPs, die viel besser als nur Pipettieren Waschpuffer über die Proben funktioniert. Die CMP-Kollagen-Strang-Hybridisierung ist sehr spezifisch und stabil, daher die in diesem Video präsentiert einfache Färbeprotokoll leicht für costaining weitere Biomarker modifiziert werden, und zum Identifizieren abgebauten Kollagen in unfixierten Gewebeschnitten. Dies ist eine wirksame und praktische Alternative zur Verwendung von Anti-Kollagen-Antikörpern zum Nachweis von Faser Kollagene in verschiedenen histologischen Proben.

Kollagen, das häufigste Protein in Säugetier, spielt eine kritische Rolle bei der Gewebeentwicklung und Regeneration durch Unterstützung der Proliferation und Differenzierung von Zellen. Während faserige Kollagen (z. B. Typ I, II), in Bindegewebe mechanische Festigkeit zu geben, um das Gewebe, das netzartige Kollagen (Typ IV) bilden Grundgerüst der Basalmembran, wo Zellen befestigen und bilden organisierten Geweben. Collagen Umbau beinhaltet sowohl Kollagenabbau (durch Proteasen) und Synthese (durch Wachstumsfaktoren gefördert). Obwohl Kollagen Umbau, beispielsweise im Knochen, ist Teil der normalen Gewebeerneuerung, Über Umbau Tätigkeit oder sein Auftreten in abnormalen Stellen, in der Regel an Wundheilungsantwort auf eine Verletzung oder chronischen pathologischen Zuständen, wie Krebs, Osteoporose, Arthritis, und 1-4 Fibrose. Die Möglichkeit, direkt Bild Kollagene Umbau in vivo unterziehen konnte, um das Verständnis des Fortschritts führenIonen dieser Krankheiten, sowie neue Diagnostika und Therapeutika. Zum Beispiel kann die Bildgebung liefern Informationen über die Schwere und den Ort der Krankheiten, und kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von neuen therapeutischen Mitteln zu beurteilen. Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie und der Erzeugung der zweiten Harmonischen haben fibrillären Kollagene Bild für die Überwachung der extrazellulären Matrix der Tumor Umbau in lebenden Mäusen 5 angewendet worden. Diese Technik erfordert jedoch Tiere mit transparenten Rückenhautkammern angebracht werden, die ein invasives Verfahren ist. Direkte und nicht-invasive Bildgebung von Kollagen Umbau wird von einer Sonde, die speziell auf Kollagen unterziehen Umbau profitieren. Solche Sonde ist schwierig herzustellen, da es braucht, um die Umbau-Kollagene von den intakten und reifen Kollagene, die reichlich in normalen Geweben 6 unterscheiden. Collagen besteht aus extrem seltene Proteinstruktur namens Triple-Helix, die ist gemachtdurch Proteasen, wie Matrix-Metalloproteinasen (MMP), während Kollagen Umbau gespalten. Die gespaltenen Kollagenfragmente verlieren ihr Triple-Helix-Struktur und werden aufgeklappt Stränge (Gelatine), die weiter durch unspezifische Proteasen 1 verdaut werden. Es wurde vor kurzem entdeckt, dass das Kollagen-mimetischen Peptid (CMP), die die Neigung, in Triple-Helix-Struktur zu falten hat, kann gezielt Kollagenstränge, die aus ihrer Triple-Helix-Zustand entweder durch Hitzedenaturierung oder durch enzymatischen Abbau 1,7 dissoziiert sind. Die Bindung wird in erster Linie durch Triple-Helix-Hybridisierung zwischen monomeren CMPs und die denaturierten Kollagenstränge angetrieben. Da CMPs Selbstorganisation homotrimeres Dreifachhelices bei Raumtemperatur mit wenig Antriebskraft für Kollagen-Hybridisierung, ein gefangener CMP [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, wie NB (GPO) 9 bezeichnet, O: Hydroxyprolin] wurde entwickelt, , die enthält eine Foto-spaltbare NitrobenzylGruppe (NB) an die zentrale Glycin des Peptids gebunden. Die NB Käfig Gruppe sterisch verhindert, dass die CMP von Falten in Dreifach-Helix, doch die Entfernung der Käfig Gruppe durch UV-Bestrahlung löst sofort die Triple-Helix-Falt-und Kollagen-Hybridisierung ein. Wenn monomere CMPs mit nahem Infrarot (NIR) Fluorophoren markiert sind systemisch geliefert Mausmodell, können sie gezielt und damit in vivo Bildgebung von denaturiertem Kollagen in Gewebe, normale (z. B. in Knochen und Knorpel) und pathologischen (z. B. in Tumoren) Umbau 1 . Fluoreszierend markierten CMPs auch zum Abbilden Kollagene in histologischen Gewebeschnitten eingesetzt werden. In histologischen Untersuchung geerntet Gewebe oft durch Fixierung aufbewahrt, um die Zellkomponenten und Gesamtgewebemorphologie von Verschlechterung zu halten. Die Befestigungsverfahren, die Wärme, und die Behandlung mit organischen Lösungsmitteln und chemischen Quer linkin umfasseng Reagenzien (z. B. Para), denaturieren die Triple-Helix-Struktur des Kollagens 8. Diese Denaturierung erzeugt Standorte für CMP-Hybridisierung. Es hat sich gezeigt, dass fluoreszenzmarkierte CMPs spezifisch an Kollagen zu binden in Gewebeschnitten (z. B. Haut, Hornhaut und Knochen) noch wirksamer als ein Anti-Kollagen-Antikörper, der eine leichte Identifizierung von pathologischen Zuständen in fibrotischen Lebergewebe 9 erlaubt. Die CMP zielt denaturierte Kollagenstränge Aminosäuresequenz von Tripelhelix-Motive, die für alle Arten von Kollagenen ist, enthält. Daher CMP kann als Breitspektrum-Kollagen Färbemittel werden. Hier präsentieren wir detaillierte experimentelle Verfahren für i) die Abbildung denaturierte Kollagenstränge in vivo und ii) Visualisierung Kollagene in ex-vivo-Gewebeschnitten mit Fluoreszenz-markierten caged CMPs. Ein NIR-Tag, IR680, wurde der Käfig CMP für Live-Imaging, whil konjugiertE Carboxyfluorescein (CF) wurde in Gewebefärbung Arbeit für die Kompatibilität mit Standard-Fluoreszenzmikroskopen eingesetzt. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Anwendung von bildgebenden CMPs als nahe an Kollagen Umbau. Methoden für die CMP-Synthese kann in früheren Berichten 1,7,9-15 gefunden werden. In diesem Video-Bericht wurden Imaging Skelettgewebe in normalen Mäusen und Gewebeschnitten von Maushornhaut zu Demonstrationszwecken gewählt, aber die hier vorgestellten Verfahren können leicht zu vielen Krankheiten und biologische Modelle, die Kollagen-Umbau (z. B. Tumoren, Wundheilung) angewendet werden, wie sowie zu fast jedem voranGewebeProbe, die Kollagene enthält.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

Kollagen ist ein Hauptstrukturbestandteil der extrazellulären Matrix, die Gewebebildung und Wartung unterstützt. Obwohl Kollagen Umbau ist ein integraler Bestandteil der normalen Gewebeerneuerung, wird eine übermäßige Menge des Remodeling-Aktivität in Tumoren, Arthritis und vielen anderen pathologischen Zuständen beteiligt. Während Kollagen Umbau wird der Dreifach-Helix-Struktur der Kollagenmoleküle durch Proteasen, die in der extrazellulären Umgebung gestört. Darüber hinaus werden in vielen histologischen Gewebeproben vorhanden Kollagene teilweise durch die Fixierung und Konservierung Verfahren denaturiert. Daher können diese denaturiert Kollagenstränge als wirksame Ziele für biologische Bildgebung dienen. Wir haben vorher entwickelte ein Käfig Kollagen mimetischen Peptid (CMP), die Foto-ausgelöst, um mit denaturierten Kollagenstränge durch Bildung von Dreifach-Helix-Struktur, die einzigartig für Kollagene ist hybridisieren können. Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens sind i) die Bild denaturierte Kollagenstränge resulting Umbau von normalen Aktivitäten in vivo, und ii) die Kollagene in ex-vivo-Gewebeschnitten mit Hilfe der Foto-caged ausgelöst CMPs visualisieren. Um eine wirksame Hybridisierung und in vivo und ex vivo-Bildgebung erfolgreich zu erreichen, sind fluoreszierend markierten Caged CMPs entweder photoaktivierten unmittelbar vor der intravenösen Injektion oder direkt an Gewebeschnitten aktiviert. Normale Skelett Kollagen Umformung in Nacktmäusen und Kollagene in vorangestellten Maus Hornhaut Gewebeschnitte werden in diesem Verfahren abgebildet. Die bildgebende Verfahren auf der Basis des CMP-Kollagen-Hybridisierungstechnologie hier vorge könnte zu einem tieferen Verständnis der Gewebeumbauprozess führen, sowie die Möglichkeit der Entwicklung neuer Diagnostika für Erkrankungen mit hohem Kollagenumbau Aktivität.

Abbildung 1 zeigt ein typisches Ergebnis, wie Foto-ausgelöst IR680-Ahx-(GPO) 9 verteilt in einer gesunden weiblichen SKH1 Nacktmaus nach 24-96 Stunden nach der Injektion. Es zeigt offensichtlich CMP Akkumulation im Skelett nach 24 hpi, an welchem ​​Punkt die meisten von ungebundenen Peptide wurden weitgehend ausgeräumt. Der Prozess der CMP Hybridisierung mit den Umbau Kollagenstränge scheint relativ langsam, insbesondere im Gegensatz zu anderen Peptid Bildgebungssonden (zB RGD-16). Dies ist wahrscheinlich wegen der langsamen Faltungsrate des Collagentripelhelix 17,18. Allerdings, wenn hybridisiert, die CMP-Stränge sind stark auf die Kollagengewebe gebunden, da nur geringe Signalreduktion nach 24 hpi (Abbildung 1) zu sehen. Bei 96 hpi, die NIR-Fluoreszenzbild mit der Maus nach Hautentfernung deutlich die Skelett Aufnahme von IR680-Ahx-(GPO) 9 in Wirbelsäule und Rippen, sowie in den Knie, Knöchel,Handgelenke und Unterkiefer (Abbildung 2A). In Ex-vivo-Gewebefärbung, Foto ausgelöst fluoreszenzmarkierten caged CMPs spezifisch hybridisieren an denaturierte Kollagenstränge in Gewebeschnitten. In Fig. 3 zeigt CMP Färbung deutlich die feinen parallelen Kollagenfasern in der Cornea-Stroma, die seine Verwendung als Kollagen spezifischen Färbemittel zeigt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Abbildung 1. Serielle NIR-Fluoreszenzbilder einer nackten Maus intravenös mit Foto decaged IR680-Ahx-(GPO) verabreicht 9, die Skelettaufnahme über vier Tage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; 2. NIR-Fluoreszenzbilder von Mäusen mit Foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) verabreicht 9 (A), Stuben IR680-Ahx-NB (GPO) 9 ohne UV-Bestrahlung (B), vorgefaltet tripelhelicalen [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), oder Wärme dissoziiert Einzelstrang-IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) bei 96 hpi nach Hautentfernung. Skeletal Targeting von der CMP kann nur in A und D beobachtet werden. NIR-Fluoreszenzsignale werden in den Regenbogen Maßstab dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> 3. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen einer Maus Corneal Gewebeschnitt in Paravorangestellt und mit DAPI und Foto ausgelöst CF (GPO) gefärbt 9 unter Verwendung des Protokolls Nr. 2, zeigt dichten kollagenen Stroma (CMP befleckt, in grün) sowie zelluläre Epithel und Endothel (von DAPI gefärbt, in blau ) (Maßstab: 100 um).

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Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Dieses Verfahren zeigt, in vivo nahen IR-Fluoreszenz-Imaging von Kollagen Umbau-Aktivitäten bei Mäusen als auch ex vivo Färbung der Kollagene in Gewebeschnitten mit Käfig Kollagen-mimetischen Peptide, die sein Foto-ausgelöst, um mit denaturierten Kollagenstränge hybridisieren.

Imaging denaturierten Kollagen-Stränge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Über die Photo-ausgelöst Hybridisierung von Caged Collagen mimetischen Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

imaging-denatured-collagen-strands-vivo-ex-vivo-via-photo-triggered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.8K Aufrufe.  University of Utah.  Dieses Verfahren zeigt, in vivo nahen IR-Fluoreszenz-Imaging von Kollagen Umbau-Aktivitäten bei Mäusen als auch ex vivo Färbung der Kollagene in Gewebeschnitten mit Käfig Kollagen-mimetischen Peptide, die sein Foto-ausgelöst, um mit denaturierten Kollagenstränge hybridisieren. 

Serie: Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Forschung

Biotechnik

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Ex-vivo-Mimikry von normalen und anormalen menschlichen Hämatopoese

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantifizierung der Fibrillar Collagen Organisation mit Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...