This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1. إعداد دوائر الهجرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد هلام شمع البارافين / النفط (1: 1) قد ذاب المزيج والحرارة حتى يصبح الخليط. باستخدام فرشاة الطلاء ورسم 2-3 طبقات من هلام شمع البارافين / النفط (1: 1) خلط في منتصف شريحة زجاجية وفقا لأرقام 1B-1D. ملاحظة: نحن نستخدم الشرائح الزجاجية المشتركة (76 × 26 × 1.0-1.5 ملم (W / D / H)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق شمع البارافين / هلام البترول مزيج ذاب بسرعة على الشريحة الزجاجية لتجنب تصلب أثناء الرسم. ضمان هلام طبقة شمع البارافين / البترول حوالي 2-2.5 سم طولا و 0.3-0.5 سم في العرض. يجب أن يكون سمك طبقة هلام شمع البارافين / البترول حوالي 0.1-0.15 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ساترة للشمع البارافين طدت / مزيج هلام البترول وختم ذلك مع 2-3 طبقات البارافين مزيج هلام الشمع / البترول (أرقام 1E، 1F). استخدام 4-8 دوائر الهجرة لتجربة الهجرة الخلية المشتركة. غرف مكان الهجرة طن وضع رأسي في رفوف. </li></ol> 2. إعداد الكولاجين مزيج تعليق خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد (على سبيل المثال، مع 0.25٪ التربسين / EDTA) وعدد الخلايا من الفائدة. resuspend الخلايا في وسائل الإعلام كاملة تحتوي على مصل العجل الجنين (FCS) والمضادات الحيوية والمكملات الغذائية الموصى بها. 4-8 إعداد 1.5 مل أنابيب رد فعل و 20 ميكرولتر تعليق الخلية التي تحتوي على 4-6 × 10 4 خلايا (يعتمد على العدد الكلي للخلايا على نوع من الخلايا لتحليلها) وملء تصل إلى 50 ميكرولتر مع وسائل الإعلام كاملة. ملاحظة: مركبات إضافية (مثل عوامل النمو، كيموكينات، مثبطات، الخ) تضاف إلى تعليق الخلية. استخدام الحلول الأسهم المناسبة مثل أن الحجم النهائي من تعليق خلية لا يتجاوز 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المبلغ الإجمالي من 452 ميكرولتر تعليق الكولاجين النهائي لأربع تجارب الهجرة الخلية. إضافة 50 ميكرولتر MEM 10X (درجة الحموضة 5،1-5،5) و 27 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم (درجة الحموضة 9،0-9،5) إلى أنبوب 1.5 مل رد فعل وتخلط جيدا. مراقبة بدوره اللون الأصفر البرتقالي من حل لالمكثفة الأرجواني (درجة الحموضة 9،0-9،5). إضافة تعليق الكولاجين 375 ميكرولتر السائل إلى 10X MEM / بيكربونات الصوديوم حل وتخلط جيدا. الرقم الهيدروجيني للتعليق الكولاجين النهائي يجب أن يكون حوالي 7.5 (المشار إليها بواسطة اللون الأرجواني الفاتح). ملاحظة: التحقق من درجة الحموضة من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني حوالي 7.5 مكان الحل بيكربونات الصوديوم مع الغطاء مفتوحا في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) ويتم المشبعة مع CO 2 وزيادة درجة الحموضة (حوالي 9،0-9،5). درجة الحموضة من الكولاجين مزيج تعليق خلية هو أمر حاسم لاستقرار الشبكة الكولاجين. إذا كانت منخفضة جدا شعرية الكولاجين سينهار خلال تجربة الهجرة الخلية. ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، استخدام الكولاجين السائل (درجة الحموضة 1،9-2،2) من هند الأبقار (2،9-3،3 ملغ / مل الكولاجين، 95٪ نوع الكولاجين الأول، 5٪ الكولاجين النوع الرابع). أمثلة على بروتوكولات إعداد شعرية المزيد من الكولاجين باستخدامنوع الكولاجين أنا من مصادر أخرى، مثل الخنازير أو الفئران، ترد في 32،33. لا تغيير على حجم الحلول المستخدمة حيث سيؤدي ذلك إلى تغيير تركيز الكولاجين النهائي من 1.67 ملغ / مل من شعرية. وهناك تركيز أعلى أو أدنى الكولاجين له تأثير على كثافة ألياف الكولاجين ومتوسط ​​المسافة بينهما مصاحبة مع الخلايا سلوك الهجرة 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الكولاجين النهائي إلى 50 ميكرولتر تعليق خلية ومزيج thoroughly.The تعليق الكولاجين النهائي (1.67 ملغ / مل الكولاجين) هو لزج قليلا. لنقل المبلغ الصحيح (100 ميكرولتر)، ماصة الحل الكولاجين النهائي مرة واحدة صعودا وهبوطا قبل نقله إلى تعليق الخلية. ملاحظة: عندما يتم الجمع بين الكولاجين مزيج تعليق خلية مع 10X MEM / بيكربونات الصوديوم حل وتغيرت قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 ألياف الكولاجين تبدأ على الفور في بلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مزيج الكولاجين تعليق خلية النهائي من عشرأنابيب رد فعل ه إلى غرف الهجرة. بلطف استفادة الغرفة الهجرة لتوزيع بالتساوي مزيج الكولاجين خلية تعليق على الجزء السفلي من الغرفة الهجرة (الشكل 1H). وضع دوائر الهجرة في وضع رأسي في رفوف واحتضان لمدة حوالي 30 دقيقة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) للسماح البلمرة من ألياف الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ أن الكولاجين شعرية بلمرة هي عكر قليلا ولكن لا يزال يجري ضوء اللون الأرجواني. تملأ غرف الهجرة مع المتوسطة كاملة أو متوسطة الكامل مع ملاحق من الفوائد وختم الغرفة الهجرة مع هلام شمع البارافين / النفط مزيج (أرقام 1I، 1J). </li></ol> 3. تسجيل وتحليل الهجرة الخلية يصف هذا القسم تسجيل هجرة الخلية الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو وتحليل الهجرة الخلية اليدوي تتبع الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على المجهر وهيئة التعليم العالي مرحلة المجهرثالثا. ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. استخدام الهدف 10X. وضع غرفة الهجرة تحت المجهر والتركيز حوالي 50 خلية أو أكثر في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهجرة الخلية قياسية في وضع الوقت الفاصل باستخدام كاميرا متعددة تطبيق برنامج المراقبة بالفيديو. حفظ الأفلام الهجرة الخلية في شكل مناسب، على سبيل المثال، &quot;*. افي&quot; أو &quot;* وسائل التحقق&quot;. ربط ملفات الأفلام الهجرة الخلية إلى قاعدة بيانات تحتوي على معلومات داعمة، مثل نوع من الخلايا والظروف التجريبية. ملاحظة: نحن تسجيل الخلايا الليمفاوية وHSPCs لمدة تصل إلى 2 ساعة باستخدام عامل الوقت الفاصل بين 1:80، مما يعني أن 0.75 ثانية في الوقت الفاصل بين يساوي 1 دقيقة في الوقت الحقيقي. الخلايا السرطانية هي خلايا تتحرك ببطء، وهكذا سجلت لمدة 16 ساعة على الأقل باستخدام عامل الوقت الفاصل بين 1: 1،800 (0.5 ثانية في الوقت الفاصل بين يساوي 15 دقيقة في الوقت الحقيقي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الأفلام الهجرة الخلية باستخدام تطبيق البرمجيات تتبع الخلية المناسبة، مثل الإضافات يماغيج البرمجيات(وتعطى لمحة عامة في 18). للاطلاع على تحليل غير متحيز فإنه من الأهمية الحاسمة أن الخلايا سيتم اختيارها عشوائيا دون علم ما إذا كانت الخلايا المهاجرة هي نشطة أم لا. ملاحظة: نحن نستخدم تطبيق البرمجيات الذاتي المتقدمة يدويا تتبع مسارات لا يقل عن 30 خلايا لكل تجربة باتباع خلايا تتحرك بدقة مع مؤشر الماوس (الذي يتوضع إلى النواة). في حين تتبع، ويتم تحديد إحداثيات س ص للخلايا تتبع تلقائيا وفقا لاستخدام وضع مرور الزمن. الخلايا الليمفاوية ليتم تحديد / HSPCs XY-إحداثيات كل 0.75 ثانية (يساوي 1 دقيقة الحقيقي)، في حين أن للخلايا السرطانية يتم تحديد XY-إحداثيات كل 0.5 ثانية (يساوي 15 دقيقة الحقيقي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ما مجموعه 60 س ص إحداثيات لكل خلية لتجربة الهجرة الخلية نموذجية. هذا يساوي 1 ساعة الوقت الحقيقي للاللمفاويات / HSPCs و 15 ساعة في الوقت الحقيقي لخلايا الورم. أ &quot;،&quot; يشير إلى أن الخلايا لم تتحرك بين TWس نقاط الوقت، في حين أن &quot;القيمة العددية&quot; يشير إلى المسافة في &quot;بكسل&quot; انتقلت خلية بين 2 نقطة الساعة (الشكل 2A). ملاحظة: يتطلب تتبع خلية يدوي الخبرة. خاصة الخلايا المهاجرة بسرعة يصعب تتبع وكل نوع من الخلايا المعرض سلوك المهاجرة المتميزة التي قد يكون سببها عوامل تستكمل. في حالة انقسام الخلايا في حين تتبع، واختيار عشوائي خلية واحدة ابنة لمواصلة تتبع. الخلايا التي تهاجر من مجال البصر أو الموت في حين تتبع ليست مهملة، ولكنها تعتبر لتحليلها. </li></ol> تحليل البيانات 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل بيانات تتبع الخلية باستخدام تطبيق البرامج المناسبة، على سبيل المثال، برنامج جدول بيانات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل بيانات تتبع الخلية عن طريق نسخ خلية تتبع البيانات الخام (الشكل 2A)، في قالب جدول الذاتي المصممة. مضاعفة مجموع &quot;القيم العددية&quot;، التي تمثلالمسافة الإجمالية قد هاجروا زنزانة مع عامل التصحيح لتحويل &quot;بكسل&quot; إلى &quot;ميكرون&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد معلمتين الهجرة الخلية: النشاط الحركي (أي ما يعادل معدل الهجرة) ووقت حركة نشطة (أرقام 2C، 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا التي هاجروا أقل من 25 ميكرون (مستوى عتبة للحد من عدد الخلايا إيجابية كاذبة) وخلايا غير متحركة. استبدال &quot;القيم العددية&quot; هذه الخلايا مع &quot;&quot;. ملاحظة: &quot;النشاط الحركي&quot; (أو معدل الهجرة) معلمة تمثل النسبة المئوية للخلايا من السكان خلية تتبع التي انتقلت بين نقطتين الوقت (الشكل 2D). يتم تعريف &quot;القيمة العددية&quot; كما خلية تتحرك، في حين &quot;،&quot; يعرف باسم خلية غير متحركة. المعلمة &quot;الوقت من حركة نشطة&quot; (بالتوقيت النشطة) يمثل نسبة مئوية من إجمالي الوقت قد هاجر خلية في إعادةlation إلى الإطار الزمني للفترة المراقبة (الشكل 2C). أ &quot;القيمة العددية&quot; تشير إلى أن خلية انتقلت، في حين &quot;،&quot; يشير إلى أن الخلايا لم تتحرك. يتم استخدام هذه المعلمة أيضا على تحديد عدد الخلايا التي لم تتحرك. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الدلالة الإحصائية وعرض بيانات الهجرة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الدلالة الإحصائية للنشاط الحركي يعني من الخلايا (معدل الهجرة) باستخدام اختبار مان ويتني U. النظر ف قيمة &lt;0.05 مهمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض النشاط الحركي يعني من الخلايا كما XY-الرسم البياني، BoxPlot الرسم، أو رسم تخطيطي شريط الرسم البياني. عرض البيانات القائمة على خلية واحدة، مثل الوقت من حركة نشطة أو السرعة، ورسم تخطيطي شريط الرسم البياني أو الرسم البياني. ملاحظة: إذا لم يتضمن تطبيق برنامج جداول البيانات المختارة مخطط أو رسم بياني الرسم البياني أداة BoxPlot يجب إجراء البحث على الانترنت لتبحث عن مناسبة توtorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

القدرة على الهجرة هي السمة المميزة للخلايا السرطانية 4. دون القدرة على الانفصال عن الورم الرئيسي وللهجرة من خلال المحيطة الخلايا السرطانية الأنسجة الضامة لن تكون قادرة على البذور الآفات الثانوية، والتي هي السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان تقريبا. بسبب هذه ?...

<html> مثل انصهار الخلية (لمحة عامة نرى 1،2) الهجرة الخلية هي ظاهرة بيولوجية أخرى التي تشارك في عدد كبير من العمليات الفسيولوجية بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح والاستجابات المناعية (للمراجعة رؤية 3). ومع ذلك، فإن القدرة على الهجرة هي أيضا شرط أساسي لخلايا الورم إلى metastasize (للمراجعة نرى 3،4). الهجرة الخلية هي عملية معقدة، غير مفهومة تماما العملية التي يتم من إخراج التفاعل بين عدة مسارات نقل الإشارة التي بدأها مختلف يجند (على سبيل المثال، السيتوكينات، كيموكينات، عوامل النمو والهرمونات ومكونات المصفوفة خارج الخلية) مستقبلات (مثل مستقبلات التيروزين كيناز، مستقبلات chemokine، integrins) التفاعلات 5 مما تسبب في نهاية المطاف إعادة تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين مع ما يصاحب ذلك اجتثاث وإعادة التجميع المجمعات التصاق التنسيق وإنتغرين بوساطة إشارات 6. وقد تم تطوير ق = &quot;jove_content&quot;&gt; تحليل الهجرة الخلية عدة في المختبر والمجراة المقايسات الهجرة خلية في العقود الماضية، بما في ذلك فحص غرفة بويدن / transwell 7، الصفر فحص / فحص 8-10 التئام الجروح، ثلاثي الأبعاد ( 3D) الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة 11 وكذلك حيوي داخلي التصوير / المجهري (للمراجعة نرى 12). كل من هذه المقايسات الهجرة الخلية لديه إيجابيات وسلبيات، على سبيل المثال، بشأن التكاليف والحاجة لمعدات والمناولة أو موثوقية البيانات التي تم الحصول عليها. كل من غرفة بويدن / transwell الفحص وفحص الصفر / التئام الجروح الفحص سهلة ومنخفضة التكلفة وفحوصات متطورة لقياس الهجرة الخلية في المختبر 7-10. في غرفة بويدن / والمصنف transwell خلايا فحص على رأس لإدراج تحتوي على مسام (حوالي 8 ميكرون في القطر) - ما يسمى المقصورة العلوية 7. اختياري، يمكن أن تكون مغلفة مع إدراج متر خارج الخليةمكونات ATRIX، على سبيل المثال، فبرونيكتين، والكولاجين وغيرها، لتحاكي بيئة أكثر الفسيولوجية. وبالمثل، يمكن زراعة الخلايا البطانية فوق إدراج، وبالتالي محاكاة حاجز الخلايا البطانية 13. تلك الخلايا التي مرت من خلال المسام خلال فترة زمنية محددة في أقل مقصورة إيواء وسائل الإعلام والمكملات الغذائية، مثل عوامل النمو وكيموكينات، وتستخدم باعتبارها من قراءة لقياس الهجرة الخلية (أو التسرب). في مقايسة خدش / هي المصنفة التئام الجروح فحص خلايا في لوحات، ونمت لconfluency 10. في اعتماد لوحات تجريبية يمكن وضع ما قبل المغلفة مع مكونات المصفوفة خارج الخلية، مثل فبرونيكتين. بعد إنشاء نقطة الصفر / الجرح عن طريق كشط الخلايا وحيدة الخلية أحادي الطبقة من كل جانب من الصفر / الجرح يمكن أن تهاجر إلى الفجوة، وبالتالي ملء / 10 فإنه شفاء. يتم تحديد المسافة بين الجانبين من الصفر / الجروحفي الاعتماد من الوقت ويستخدم كأساس التدريجي قراءة لنشاط الهجرة من الخلايا 10. ومع ذلك، للتمييز بين تكاثر الخلايا (التي يمكن أن يؤدي أيضا إلى ملء / الشفاء من الصفر / الجرح) وهجرة الخلايا فمن المستحسن أن الجمع بين الفحص مع مرور الزمن المجهري الفيديو وحيدة الخلية تتبع 10. ومع ذلك، فإن كلا من غرفة بويدن / transwell فحص والصفر فحص / فحص التئام الجروح، والكمال بدلا بشأن بيئة الخلوية الفسيولوجية مثل. في غرفة بويدن / فحص خلايا transwell يجب أن تهاجر من خلال المسام البلاستيك، في حين أنه في نقطة الصفر هي المصنفة فحص / فحص خلايا التئام الجروح على مغلفة مسبقا لوحة من البلاستيك ثنائية الأبعاد. وبالمثل، فمن المسلم به جيدا أن سلوك الهجرة يختلف بشكل ملحوظ بين بيئة ثنائية الأبعاد 3D و3. على سبيل المثال، التصاقات ثلاثي الأبعاد مصفوفة من الخلايا الليفية تختلف من الالتصاقات البؤرية وييفي تتميز على اثنينركائز الابعاد في محتواها من α5β1 وintegrins αvβ3، paxillin، مكونات هيكل الخلية الأخرى، والتيروزين الفسفرة من الالتصاق البؤري كيناز 14. وبالمثل، كما عرض جزءا لا يتجزأ من الخلايا في بيئة 3D سلوك الهجرة غيرت 15. وبالتالي لتحليل الهجرة الخلية بشكل أكثر دقة ينصح فحص الهجرة السماح لقياس هجرة الخلايا واحد ضمن بيئة الفسيولوجية أو تشبه الفسيولوجية-3D. حيوي داخلي التصوير / المجهري هو الذهب القياسية لقياس الهجرة الخلية في سياق الفسيولوجية 3D. هذا لا ينتمي فقط إلى خارج الخلية التفاعلات خلية مصفوفة، ولكن أيضا إلى التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا البطانية تسرب خلال 16 أو الاتجار اللمفاويات ضمن العقدة الليمفاوية 17، والتي، حتى الآن، هو ممكن نظرا ل تحسين تقنيات مضان المجهري، مثل 2 الفوتونمتحد البؤر المجهر الليزر، واستخدام الأصباغ الفلورية الحيوية وسلالات الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية المشتقات 12،16،17. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع حيوي داخلي التصوير / المجهري مع خلية تتبع اليدوي والآلي 18. ومع ذلك، بسبب الحاجة ل2 الفوتون الليزر متحد البؤر المجهر وكذلك الحيوانات (والنماذج الحيوانية المعدلة وراثيا المناسبة) حيوي داخلي التصوير / المجهري هو أسلوب بدلا كثيفة التكلفة. للتغلب على القيود المفروضة على بويدن غرفة / transwell الفحص وفحص الصفر / التئام الجروح فحص وتحليل الهجرة من أنواع مختلفة من الخلايا في بيئة 3D تم تطوير 3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة 11،19. وبالتالي، يتم تضمين الخلايا المهاجرة ضمن شبكة ألياف الكولاجين 3D، والذي يشبه إلى المزيد من المجراة الوضع. سوية، بسبب ضيق الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو خلية حقيقية الهجرة يقاس السماح للdetermiأمة من العديد من المعلمات الهجرة وكذلك التعديلات في استجابة لعوامل الموالية للالمهاجرة أو مثبطات. يمكن تحليل مختلف أنواع الخلايا باستخدام هذه التقنية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية وكريات الدم البيضاء 11،20، الجذعية المكونة للدم / الخلايا الاصلية 21-24، والخلايا السرطانية 5،25-29. بالإضافة إلى خلايا مفردة أو مجموعات الخلية أيضا يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ الكروية داخل يصاحب ذلك الكولاجين مصفوفة مع تحليل للهجرة الخلايا واحد من الكتلة الخلوية / كروي في الكولاجين شعرية 30،31. يعرض هذا البروتوكول لمحة عامة عن تقنية بسيطة، ولكنها قوية لتحليل السلوك المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا في بيئة 3D - طريقة في المختبر العائد في النتائج التي هي قريبة من الوضع في الجسم الحي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

القدرة على الهجرة هي السمة المميزة لمختلف أنواع الخلايا ويلعب دورا حاسما في العديد من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح، والاستجابات المناعية. ومع ذلك، الهجرة الخلية هي أيضا آلية رئيسية في سرطان تمكين هذه الخلايا السرطانية تنفصل عن الورم الرئيسي لبدء الانتشار النقيلي. خلال السنوات الماضية وقد وضعت مختلف المقايسات الهجرة الخلية لتحليل السلوك المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا. لأن السلوك الحركي الخلايا تختلف بشكل ملحوظ بين ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) بيئة يمكن افتراض أن تحليل هجرة الخلايا التي هي جزء لا يتجزأ ضمن بيئة 3D سيحقق في الهجرة الخلية أكثر أهمية البيانات. ميزة لل3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة وصفها هي أن الخلايا هي جزء لا يتجزأ ضمن شبكة 3D الفسيولوجية للألياف الكولاجين التي تمثل عنصرا رئيسيا في المصفوفة خارج الخلية. نظرا ليتم قياس الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو خلية حقيقية الهجرة السماح تحديد العديد من المعلمات الهجرة وكذلك التعديلات في استجابة لعوامل الموالية للالمهاجرة أو مثبطات. يمكن تحليل مختلف أنواع الخلايا باستخدام هذه التقنية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية / الكريات البيضاء، والخلايا الجذعية، والخلايا السرطانية. وبالمثل، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ أيضا مجموعات الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية داخل يصاحب ذلك الكولاجين مصفوفة مع تحليل للهجرة الخلايا واحد من الكتلة الخلوية / كروي في شعرية الكولاجين. نستنتج أن 3D الكولاجين مصفوفة فحص الهجرة هي طريقة تنوعا لتحليل هجرة الخلايا في بيئة 3D الفسيولوجية مثل.

و3D-الكولاجين فحص الهجرة مصفوفة تستخدم جنبا إلى جنب مع الوقت الفاصل الفيديو المجهري وتتبع الخلية بمساعدة الكمبيوتر يسمح لتحديد مختلف المعايير الهجرة الخلية بما في ذلك المعلمة القائمة على السكان (على سبيل المثال، يعني النشاط الحركي) والمعلمات القائم على خلية وا?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix at JoVE.com

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

الهجرة الخلية هي ظاهرة البيولوجية التي تشارك في عدد كبير من الفسيولوجية، مثل التئام الجروح والاستجابات المناعية، والعمليات الفيزيولوجية المرضية، مثل السرطان. فحص الهجرة مصفوفة 3D الكولاجين هو أداة مرنة لتحليل خصائص المهاجرة من أنواع مختلفة من الخلايا داخل في مثل الفسيولوجية للبيئة 3D.

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

analysis-of-cell-migration-within-a-three-dimensional-collagen-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.6K Views.  Witten/Herdecke University.  الهجرة الخلية هي ظاهرة البيولوجية التي تشارك في عدد كبير من الفسيولوجية، مثل التئام الجروح والاستجابات المناعية، والعمليات الفيزيولوجية المرضية، مثل السرطان. فحص الهجرة مصفوفة 3D الكولاجين هو أداة مرنة لتحليل خصائص المهاجرة من أنواع مخت?...

Video: Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

مستو وثلاثي الابعاد من أحبار الطباعة موصل

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

نموذج ثلاثي الأبعاد للخلية ثقافة قياس آثار تدفق السائل الخلالي على غزو الخلايا السرطانية

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا المحاكاة البيولوجية: رواية Biorubber يخلق معرف الصغرى، وعلى نطاق والماكرو-البنى في الكولاجين الهلاميات المائية

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

إعداد وتحليل<em&gt; في المختبر</em&gt; ثلاثة الثدي الأبعاد سرطان البدائل

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.